Рис. 1. Макромолекулярные агрегаты (ММА) в СЖ человека: а – тип ММА-1; б – тип ММА-2; в – тип ММА-3; а и в – увеличение 80 000, длина масштабной линии – 100 нм, б – увеличение 60 000, длина масштабной линии – 200 нм. Электронная микроскопия. Негативное контрастирование уранилацетатом
Рис. 2. Мембранные микрочастицы в СЖ человека: а – СЖ здорового человека, микрочастица (экзосома); б – г – СЖ пациентов с ДР; б – микрочастицы в «чехле»; в, г – пузырьки с истонченной мембраной, длина масштабной линии – 100 нм, увеличение 100 000. Электронная микроскопия. Негативное контрастирование
Витреомакулярный тракционный синдром (ВМТС) представляет собой хроническое состояние, связанное с неполной задней отслойкой стекловидного тела и преретинальной пролиферацией, которые вызывают тракционную деформацию макулы, механическое натяжение и повреждение макулярной сетчатки, приводящих к необратимой потере зрительных функций [1, 2]. Изолированный ВМТС встречается в 22,5 случаях на 100 тыс. населения. Около 15 % населения имеют глазную патологию, причиной которой стал ВМТС [3].
Тяжелым осложнением сахарного диабета (СД) является диабетическая ретинопатия (ДР) – поражение сосудов сетчатки, нередко ведущее к слепоте [4]. Основным методом диагностики ДР служит офтальмоскопия, показывающая состояние сосудов, кровоизлияния и очаги поражения нервных клеток сетчатки при уже развившемся заболевании [5]. «Надежные» методы ранней диагностики в настоящее время не разработаны. Между тем ранняя диагностика и адекватное лечение ДР позволяют значительно уменьшить риск слепоты [6]. Несомненно, проведение диагностических процедур при офтальмологических заболеваниях осложняется самой природой органа зрения, и единственным легко доступным для анализа субстратом является слезная жидкость (СЖ) – постоянная микросреда переднего отдела глаза. СЖ прозрачная или слегка опалесцирующая, имеет слабощелочную реакцию и плотность около 1,008. СЖ содержит 97,8 % воды, электролиты, низкомолекулярные метаболиты, клеточный детрит, слизь и белки, основную долю составляют лизоцим, лактоферрин и липокалин [7].
Активно развивающимся направлением диагностических исследований является анализ микрочастиц, включая экзосомы, в биологических жидкостях. Экзосомы – везикулы (40–100 нм), локализованные в мультивезикулярных тельцах, передающие сигналы между клетками и несущие маркеры многих заболеваний [8, 9, 10]. Однако состав и особенности экзосом при офтальмологических заболеваниях не изучены. Более того, не опубликованы доказательства наличия микрочастиц и экзосом в СЖ. В связи с этим мы провели электронно-микроскопический анализ СЖ с целью выявления и характеризации микрочастиц и оценки пригодности СЖ для диагностики офтальмологических заболеваний на примере ВМТС и ДР.
Материал и методы
Образцы СЖ
Образцы СЖ собирали у 14-ти пациентов с ВМТС, у 16 пациентов с диабетической ретинопатией (ДР). В качестве контроля использовали образцы СЖ 19-ти людей без офтальмологических заболеваний. Слезоотделение стимулировали световым пучком, выделявшуюся СЖ собирали стерильным хирургическим капилляром из нижнего конъюнктивального свода глаза в стерильную пробирку. Визуальный осмотр полученных образцов показал, что СЖ может быть прозрачной или мутной с гелеобразными полупрозрачными включениями
Электронная микроскопия
Индивидуальные образцы СЖ центрифугировали (20 000 g, 15 мин, 4°С); полученные супернатанты были прозрачные, без включений, осадки – обычно белого цвета, могли состоять из гелеобразного вещества или иметь творожистую структуру. Осадки фиксировали 4 % раствором параформальдегида, дофиксировали в 1 % растворе четырехокиси осмия, обезвоживали в растворах этилового спирта и ацетоне, заключали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме Leica EM UC7 (Leica, Германия), контрастировали растворами уранилацетата и цитрата свинца. Подготовленные срезы изучали в просвечивающем электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Изображения получали с помощью цифровой фотокамеры Veleta (Olympus Corporation, Япония). Размеры структур измеряли на экране монитора с помощью программы iTEM (Olympus Corporation, Япония).
Результаты и обсуждение
Ультраструктурная характеристика супернатанта СЖ
Метод НК выявил во всех образцах СЖ два основных компонента: 1) макромолекулярные агрегаты (ММА) и 2) микрочастицы. В электронном микроскопе (ЭМ) ММА выглядели как скопления округлых структур трех типов, содержание которых варьировало в разных образцах. ММА-1: разветвленные цепочки округлых частиц размером около 10 нм с четкими границами, прокрашиваются контрастирующим веществом (рис. 1а). ММА-2: агрегаты, напоминающие «кружево» из округлых чашеобразных частиц, частично сливающихся друг с другом (размеры частиц 15 и 50 нм), не прокрашиваются (рис. 1б). ММА-3: рыхлые агрегаты из «звеньев» с нечеткой границей, размер частиц около 20 нм, прокрашиваются (рис. 1в). Основная доля белков СЖ представлена секреторными белками [7]. Возможно, выявленные нами три типа ММА соответствуют трем основным и самым крупным белкам СЖ – лизоциму, липокалину и лактоферрину.
Наблюдались методом НК во всех исследованных образцах мембранные микрочастицы, имевшие вид округлых везикул размером 40–100 нм, часто чашеобразной формы (рис. 2а). Их морфология соответствует экзосомам [10].
Ультраструктурная характеристика СЖ в контроле
В контрольных образцах СЖ методом НК выявлено небольшое количество ММА-1 и редкие ММА-3, ММА-2 отсутствовали.
Образцы содержали примерно в равных пропорциях микрочастицы разнообразной морфологии. Мембранные частицы имели размеры 40–80 нм (экзосомы) и 150–200 нм (микровезикулы), округлую или чашеобразную форму и ровную поверхность.
Немембранные микрочастицы различались по размерам: 30–40 нм (мелкие), 90–100 нм (средние) и 120–150 нм (крупные), имели ровную или с небольшими вдавлениями поверхность. Контрольные образцы также содержали крупные (несколько мкм) скопления вещества низкой электронной плотности с четкими изрезанными границами, формирующего тонкий слой, возможно, липидной природы. Внутри некоторых скоплений отмечались «островки» высокой электронной плотности диаметром около 80 нм различной формы с четкими границами.
Ультраструктурная характеристика СЖ пациентов с ВМТС
Анализ СЖ пациентов с ВМТС методом НК выявил повышенное по сравнению с контролем содержание ММА с преобладанием ММА-3, агрегаты ММА-1 и ММА-2 были единичны. СЖ пациентов с ВМТС содержала немногочисленные мембранные и немембранные микрочастицы в равном соотношении. Мембранные частицы в основном были крупные (150 нм), в отличие от контроля с неровными контурами. Экзосомы (60–100 нм) встречались редко. Немембранные частицы преимущественно имели ровную поверхность, их размер в среднем составлял около 100 нм. Встречались скопления низкой электронной плотности, аналогичные таковым в контроле, но с размытыми границами.
Ультраструктурная характеристика СЖ пациентов с ДР
В СЖ всех пациентов с ДР отсутствовали ММА-2. Содержание и структура ММА-1 и ММА-3 существенно варьировали, возможно, вследствие разной тяжести и длительности заболевания. Содержание мембранных микрочастиц в СЖ пациентов с ДР было существенно выше, чем в контроле и группе сравнения, отличалась и морфология частиц. Размеры частиц составляли 50–150 нм, преобладали везикулы размерами 60–80 нм и 125–150 нм.
Основную долю частиц во всех образцах составляли пузырьки, имевшие мембрану с измененной структурой. В некоторых пузырьках мембрана была истончена (рис. 2в,г), в других – утолщена и разрыхлена, наблюдалась деформация частиц.
В 5-ти образцах из 8-ми обнаруживались частицы, состоящие из центральной сферической частицы (60–100 нм), окруженной тонким ободком электронно-плотного вещества и слоем зернистого вещества средней электронной плотности (30–40 нм). Данные частицы выглядели как экзосомы, окруженные «чехлом» (рис. 2б).
Содержание немембранных частиц и ММА коррелировало: чем чаще встречались ММА, тем больше было микрочастиц. В 62 % образцов СЖ пациентов с ДР содержалось небольшое количество ММА и отсут- ствовали немембранные частицы.
Ультраструктурный анализ показал наличие в СЖ людей микрочастиц, в том числе – экзосом, количество и морфология которых зависят от характера офтальмологического заболевания. При ДР в СЖ содержится существенно больше, чем в группе контроля, мембранных микрочастиц, тогда как количество немембранных снижено. Маркерами ДР, по-видимому, являются появление микрочастиц, окруженных «капсулой», изменение структуры мембраны микрочастиц, а также отсутствие ММА-2. Проведенное исследование показало пригодность СЖ в качестве субстрата для ультраструктурного анализа. В свою очередь, обнаруженные различия структурных характеристик СЖ у пациентов с ДР, ВМТС и в контроле свидетельствуют о необходимости дальнейших исследований для поиска маркеров ранних стадий данных заболеваний.
Заключение
Исследование СЖ людей методом электронной микроскопии позволило визуализировать и идентифицировать ее структурные компоненты: микрочастицы, в том числе экзосомы, и макромолекулярные агрегаты.
Выявление различий в содержании и морфологии структурных компонентов СЖ при ВМТС, ДР свидетельствует о диагностическом потенциале СЖ и перспективности поиска диагностических маркеров офтальмологических заболеваний.
Сведения об авторах
Еремина Алена Викторовна, к. м. н., научный сотрудник научного отдела, Новосибирский филиал ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.
Черных Дмитрий Валерьевич, к. м. н., врач-офтальмолог 5-го офтальмологического отделения.
Information about the authors
Eremina Alena Viktorovna, Cand. Sci. (Med.), researcher, Research Dept., Novosibirsk Branch of FSAI “The Acad. S.N. Fyodorov Eye Microsurgery Complex” of the Minpublhealth of Russia.
Chernykh Dmitriyi Valerievich, Cand. Sci. (Med.), ophthalmologist, 5th Ophthalmology Dept.
