Рис. 1. А. Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки лимба, р4. В. 1 этап индукции мультипотентных мезенхимальных клеток лимба. С. 2 этап индукции мультипотентных мезенхимальных клеток лимба
Рис. 2. 1 день инкубирования: а) I модель; в) II модель; с) III модель; 7 день: d) I модель; e) III модель
Известно, что основным патофизиологическим механизмом гибели нейронов при глаукомной оптической нейропатии является апоптоз [8]. Среди растущего числа пусковых факторов апоптоза особо следует выделить блокаду аксоплазматического транспорта нейротрофических факторов (НТФ) [7].
Среди большого семейства нейротрофических факторов в последнее время наибольшее внимание исследователей привлекают фактор роста нервов (NGF) и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF).
В экспериментах in vivo была доказана выраженная нейропротекция ганглиозных клеток сетчатки данными нейротрофическими факторами [4, 5].
Однако в настоящее время вопрос о безопасной и длительной доставке НТФ все еще остается трудно преодолимым препятствием, непосредственная доставка нейротрофических факторов в область повреждения оказывает очень кратковременный эффект вследствие быстрого их расщепления ферментами организма протеазами.
Интересным представляется применение стволовых клеток, способных оказывать длительное и локализованное влияние, опосредованное секрецией синергически действующих факторов [3].
Известно, что мезенхимальные клетки лимба относятся к истинным мультипотентным мезенхимальным стволовым клеткам (ММСК). В работе Liang C.M. с соавт. было показано, что лимбальные ММСК способны выделять нейротрофические факторы и оказывать нейропротекторное действие [6].
Установлено, что культивирование в 3D-системах способствует сохранению фенотипа клеток и поддержанию их дифференцированного и секреторного потенциала. Эти данные открывают перспективы использования 3D-сфероидов лимбальных ММСК для обеспечения нейропротекторного действия.
Цель
Разработать технологию создания 3D-сфероидов из мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба кадаверных глаз человека с индуцированными нейропротекторными свойствами.
Материал и методы
По предложенной ранее технологии получали первичные культуры ММСК из тканевых фрагментов лимба [1]. Для исследования нами взяты 8 донорских глаз от 4 трупов доноров в возрасте от 29 до 63 лет, предоставленные Глазным банком «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад С.Н. Федорова» Минздрава России. Время от момента констатации биологической смерти до выделения тканевых фрагментов – от 9 до 18 часов. Изолированные кусочки лимба переносили в 25 мм3 культуральные матрасы, культивирование осуществлялось в среде DMEM/F12 (1:1) (ПанЭко, Россия), L-глутамин – 0,58 г/л, HEPES – 10 mМ, пенициллин – 10000 ЕД/мл, стрептомицин – 10000 ЕД/мл, амфотерицина В – 1,25 мг/мл, инсулин – 0,4 мкМ, дексаметазон – 10 нМ и 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США) при стандартных условиях (5% СО2, 37° C), смена среды проводилась каждые 3 дня. При достижении монослоем клеток 80-90% конфлуэнтности осуществляли пассирование культуры с использованием растворов Версена и 0,25% трипсина-ЭДТА (ПанЭко, Россия), действие трипсина инактивировали добавлением полной ростовой среды, плотность клеток при рассеве составляла не менее 300 000 кл./мл. Подсчет клеток при пассировании культуры производили с использованием камеры Горяева. В экспериментальных сериях использовали культуры ММСК четвертого пассажа, достигшие 80-90% конфлуэнтности.
Индукция нейропротекторных свойств осуществлялась по двухэтапной методике с использованием неспецифических факторов активации: 1 этап – EGF, hbFGF (ПанЭко, Россия), добавка N2 (Life Technologies, США), 2 этап – через 72 часа дибутирил цАМФ, NRG1-beta 1, PDGF (R&D Systems, США), 3-изобутил-1-метилксантин (Santa Cruz Biotechnology, США).
Сфероиды создавали с использованием агарозных планшетов (3D Petri Dishes, Microtissue, США) тремя способами: I – создание сфероидов из предварительно индуцированных ММСК; II – индукция ММСК в 1 день инкубирования; III – индукция ММСК на 7 день инкубирования. Концентрация клеток 270000 кл/мл.
Полученные 2D- и 3D-культуры ММСК анализировали с помощью инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 (Olympus, Япония).
Результаты
ММСК, полученные при культивировании фрагментов лимба, имели характерную веретеновидную форму и сохраняли высокий пролиферативный потенциал (рис. 1а).
После проведения индукции морфология клеток значительно изменялась, клетки приобретали нейроподобный фенотип (рис. 1b, c).
Индуцированные и интактные ММСК лимба 4-го пассажа переводили в условия 3D-культивирования в агарозных планшетах для получения клеточных сфероидов, позволяющие в каждой лунке планшета получать стандартные сфероиды из одинакового количества клеток.
В 3D-культуре, полученной по I, II и III способу, уже в первые часы инкубирования клетки объединялись в рыхлые агрегаты, которые к концу 1 суток формировали сфероиды с гладким поверхностным слоем (рис. 2a, b, c). Однако после индукции во II модели сфероиды теряли компактность и гладкость, приобретали неровную бугристую поверхность (рис. 3a, b).
Процесс сфероидообразования в I и III модели протекал идентично, и к 7 суткам наблюдалось формирование плотного, гладкого сфероида (рис. 2d, e). Проведение индукции на 7 день в III группе привело к сходным с I группой изменениям (рис. 3c).
Дальнейшая экспозиция клеток в 3D-культуре не приводила к каким-либо морфологическим изменениям сфероидов.
Выводы
1. На 1 и 7 сутки инкубирования индукция 3D-конструкций мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба приводит к изменению морфологии сфероидов: потере компактности, появлению «бахромчатости». Подобные изменения свидетельствуют о нежизнеспособности полученных конструкций.
2. 3D-конструкции, созданные из индуцированных мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба, представляют собой компактные сфероиды с гладкой ровной поверхностью, сохраняющие свою морфологию на протяжении всего периода инкубирования. Данная технология представляется оптимальным методом создания сфероидов с индуцированными нейротрофическими свойствами.
