Трансплантация суспензии эндотелиальных клеток в эксперименте ex vivo

    

    Актуальность

    Патологии эндотелиального слоя роговицы различного генеза, включая как первичную генетически детерминированную эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, так и вторичную буллезную кератопатию, являются одними из наиболее часто встречающихся и требуют проведения оптической кератопластики [1]. Единственный эффективный вариант лечения таких пациентов – это выполнение трансплантации роговицы с полной или частичной заменой ее слоев на донорскую ткань. В практике офтальмохирургов у пациентов с эндотелиальной недостаточностью роговицы преобладает метод сквозной кератопластики. Однако в последние два десятилетия активно внедрялась в клиническую практику более патогенетически обоснованная методика селективной замены эндотелия – задняя послойная кератопластика (ЗПК) [2].

    В ходе ЗПК у реципиента удаляется дефектный монослой эндотелия с подлежащей Десцеметовой мембраной (ДМ), после чего на подготовленное ложе укладывается предварительно выкроенный донорский трансплантат, состоящий из нескольких слоев: стромы роговицы, ДМ и монослоя эндотелиальных клеток (ЭК) [3]. Толщина заднего послойного трансплантата может варьировать в широких пределах, но в среднем составляет 120 мкм. Данная технология имеет массу преимуществ в сравнении со сквозной кератопластикой. Одним из главных является исключение необходимости проведения операции по типу «открытого неба», когда глазное яблоко реципиента полностью разгерметизировано, соответственно, минимизируется вероятность сопряженных с этим операционных осложнений. Также при ЗПК трансплантируется меньшее количество донорской ткани, что, в свою очередь, снижает риск развития реакции отторжения.

    Дальнейшие разработки метода ЗПК привели к ее усовершенствованию и созданию метода эндотелиальной кератопластики ЭК, при которой трансплантируется изолированная ДМ с монослоем эндотелия без стромального слоя роговицы донора (ТЭДМ) [4]. Метод ТЭДМ имеет ряд существенных преимуществ в сравнении с ЗПК, а именно: трансплантируется меньший объем донорской ткани, получается более предсказуемый оптический результат по причине минимального влияния трансплантата (толщина порядка 20 мкм) на послеоперационную рефракцию, улучшаются оптические свойства зоны интерфейса (между подлежащей стромой реципиента и адаптированной трансплантированной ДМ донора). Несмотря на высокую технологичность и результативность метода ТЭДМ, она несет ряд специфических интра- и послеоперационных осложнений: высокая вероятность повреждения ДМ в ходе заготовки трансплантата (при отсепаровке от стромы роговицы донора), скручивание мембраны в передней камере глаза реципиента после имплантации, возможность инверсной фиксации трансплантата (эндотелием к строме реципиента), отслойка мембраны в послеоперационном периоде [5].

    В связи с вышесказанным существуют предпосылки для дальнейшего усовершенствования эндотелиальной кератопластики, при этом одним из путей является трансплантация суспензии ЭК непосредственно в переднюю камеру глаза реципиента. В случае культивирования ЭК донора имеется потенциал существенного увеличения пула клеток, пригодных для трансплантации. Это даст возможность использования одного донора на несколько пациентов. Данный факт может стать решением проблемы дефицита донорского материала, пригодного для проведения эндотелиальной кератопластики. Еще одним преимуществом технологии прямой инъекции ЭК реципиенту является возможность использования доноров с исходно низкой плотностью эндотелиальных клеток не пригодных для целей трансплантации. Подобный донорский материал чаще всего отбраковывается, однако он может быть использован для реабилитации пациентов с дисфункцией эндотелия при условии разработки эффективной технологии имплантации суспензии ЭК.

    К настоящему моменту опубликованы лишь две работы по клиническому применению культивированных клеток эндотелия роговицы человека [6, 7]. Стоит отметить, что данным методом были пролечены пациенты с буллезной кератопатией. Указанные работы базировались на серии доклинических исследований, а также на экспериментах с кадаверными глазами (модель ex vivo). S. Kinoshita и соавт. вводили клетки посредством инъекции в совокупности с ингибитором ROCK-киназы в концентрации 1×106 кл/мл. В то время как P. Parikumar и со-авт. использовали нанокомпозитный гель в виде листка с культивированными клетками на его поверхности в концентрации 5×105 кл/мл. Однако в данных исследованиях не была детально изучена миграция введенных клеток, что повлекло за собой большое количество споров об эффективности и конкретном вкладе клеточной культуры в получение положительных результатов. Также стоит отметить, что ни одна из групп не сообщила о каких-либо побочных эффектах у своих пациентов. S. Kinoshita и соавт. заявили о теоретической возможности попадания клеточной культуры в трабекулярную сеть и развития глаукомы. Следует, однако, подчеркнуть, что ни у одного из пациентов не было обнаружено данного осложнения на протяжении двух лет наблюдения.

    На данный момент на территории Российской Федерации использование культивированных клеточных продуктов регламентируется Федеральным законом № 180 «О биомедицинских клеточных продуктах», что ограничивает использование полученных зарубежными коллективами результатов [8]. Также стоит отметить, что в данных работах применяется 8% фетальная бычья сыворотка, используемая для культивирования эндотелиальных клеток. Наличие ксеногенных продуктов представляет собой существенное ограничение для дальнейшего массового использования клеточных технологий. Стоит отметить, что на сегодня нет данных по разработке протокола получения и культивирования ЭК без использования ксеногенных продуктов. Однако применение суспензии нативных (некультивированных) клеток эндотелия роговицы позволяет легитимно использовать данный метод, не входя в противоречие с действующим законодательством. Данный вид трансплантации может рассматриваться как один из вариантов селективной эндотелиальной кератопластики [9].

    Таким образом, в аспекте вышеизложенного комплекс вопросов, связанный с трансплантацией нативных клеток эндотелия роговицы в современных условиях на территории Российской Федерации, является крайне актуальным, но не изученным. Трансплантация ЭК роговицы в виде их суспензии имеет потенциал кардинально изменить подход к лечению эндотелиальных патологий роговицы с возможностью быстрого восстановления зрения и уменьшения потребности в донорском материале.

    Цель

    Оценить эффективность трансплантации суспензии ЭК на кадаверном глазу человека в эксперименте ex vivo.

    Материал и методы

    Ранее нами было опубликовано описание нескольких вариантов методики выделения ЭК и получения их суспензии [10].

    Модифицированный энзимный метод выполняли путем предварительного выкраивания изолированной ДМ с эндотелием из кадаверной роговицы человека. ДМ переносили в пробирку типа Эппендорф, добавляли 0,3 мл трипсина (Invitrogen, США) и помещали в термошейкер: 300 rpm, при 37 °С в течение 5 мин. Инактивация проводилась 10-кратным разбавлением полученной суспензии консервационной средой для хранения роговицы («Раствор для хранения роговицы», ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) с последующим центрифугированием 5 мин, 900 об/мин при 37 °С.

    Эксперимент по трансплантации суспензии ЭК был разделен на 3 этапа.

    На первом этапе нами был проведен подсчет планируемой потери ЭК, связанной с процедурой введения суспензии клеток «реципиенту» при использовании стеклянной канюли. Для этого было подготовлено 3 пробирки Эппендорф, содержащих 10×10⁴ эндотелиальных клеток в 100 мкл среды для хранения роговицы, полученную суспензию однократно набирали в стеклянную канюлю с последующим переносом в чашку Петри для подсчета количества «трансплантированных» клеток в автоматизированном счетчике клеток Luna-II (Logos Biosystems, Южная Корея).

    На втором этапе, в качестве модели реципиента для введения полученной суспензии использовали корнеосклеральный диск. Диск помещали в вакуумный трепан для донорских роговиц эндотелием вверх, предварительно до этапа удаления эндотелиальных клеток производили окрашивание роговицы раствором трипанового синего 0,15% (Membrane blue-Dual, DORC, Нидерланды) (рис. 1 а). Далее при помощи микротупфера механически и ирригационным методом – путем смыва струей сбалансированного солевого раствора (BSS) проводили деликатную зачистку эндотелия, при этом стараясь не повредить подлежащую ДМ (рис. 1 б). Диаметр зоны удаления эндотелиального монослоя составил 6 мм. Дополнительное окрашивание зоны воздействия проводили после удаления клеток с целью оценки полноты зачистки ДМ от эндотелиального монослоя (рис. 1 в).

    Далее предварительно полученную суспензию в объеме 0,1 мл при помощи шприца объемом 1 мл, соединенного со стеклянной канюлей, наносили на корнеосклеральный диск (рис. 2 а). При этом весь объем суспензии клеток концентрировался в носике стеклянной канюли (рис. 2 б), что позволило наиболее эффективно произвести трансплантацию клеток с минимальным объемом жидкости. Использование стеклянной канюли обосновано гладкостью ее стенок и минимальной вероятностью механического повреждения клеток в момент прохождения суспензии по просвету канюли. Имея физиологический изгиб, диск являлся резервуаром для инстиллированной суспензии, при этом максимальная концентрация клеток суспензии должна сосредотачиваться в центральной точке роговицы. Таким образом, имитируется положение пациента после проведенного хирургического вмешательства по трансплантации суспензии эндотелия «лицом вниз».

    Далее корнеосклеральный диск помещали в инкубатор при температуре 37 °С и 100% влажности на 4 ч, после чего проводили оценку количества прикрепившихся эндотелиальных клеток к ДМ. Для этого суспензию забирали с задней поверхности роговицы и пересчитывали количество клеток в автоматизированном счетчике клеток Luna-II (Logos Biosystems, Южная Корея).

    Третий этап эксперимента проводили на кадаверном глазном яблоке. Предварительно устанавливали донорский глаз в держатель. После деэпителизации при помощи роговичного метчика определяли центральную зону диаметром 6 мм. Далее при помощи металлического ножа шириной 2,2 мм выполняли роговичный разрез, после чего при помощи модифицированного обратного крючка Сински зачищали заднюю поверхность ДМ. Саму ДМ при этом старались не травмировать и не получить ее разрывов или отслойки. После чего в переднюю камеру глаза вводили раствор трипанового синего с целью оценки эффективности удаления ЭК с поверхности мембраны. При этом получали насыщенное окрашивание центральной зоны роговицы по намеченному диаметру 6 мм. Насыщенное окрашивание ДМ свидетельствует об отсутствии эндотелиальных клеток в данном зоне. Далее при помощи инсулинового шприца и стеклянной канюли трансплантировали 0,1 мл суспензии в переднюю камеру кадаверного глаза. Хирургический доступ герметизировали наложением одного узлового шва (нейлон 10-0). Глазное яблоко в перевернутом виде помещали в инкубатор при температуре 37 °С и 100% влажности на 4 ч для прикрепления трансплантированных ЭК к ДМ (рис. 3). После чего роговичным трепаном диаметром 16 мм иссекали корнеосклеральный диск для органотипического культивирования с целью определения регенеративной способности к закрытию сформированного дефекта на ДМ, а также оценки сохранности фенотипа трансплантированных клеток. Срок культивирования составил 3 суток, в культуральной среде, содержащей DMEM/F12, 2% – бычьей фетальной сыворотки, ингибитор Rho-киназы (ROCK), антибиотик и антимикотик. После культивирования были проведены сканирующая электронная микроскопия и иммуногистохимическое исследование.

    Результаты

    На первом этапе нами изучен процент потери ЭК в суспензии при прохождении через стеклянную канюлю. Для этого подсчитывали количество ЭК в готовой суспензии до прохождения через канюлю и после. Потеря ЭК составила 10±2,5%

    По результатам второго этапа эксперимента показано, что количество клеток в суспензии, забранной с поверхности корнеосклерального диска, составило около 40±3,8% от исходно введенного. Таким образом, через 4 ч после введения количество адгезированных к ДМ ЭК составляет около 60±12% от первично введенного в суспензии.

    По завершении третьего этапа эксперимента методом сканирующей электронной микроскопии нами подтверждена жизнеспособность трансплантированных ЭК, а также факт их эффективной адгезии к ДМ (рис. 4). По истечении 1-й недели культивирования методом иммуногистохимического анализа в образцах роговицы были определены характерные маркеры ЭК ZO-1, Na + / K+ -АТФаза, Ki67, а также обнаружены единичные клетки, экспрессирующие виментин – маркер мезенхимальных клеток (рис. 5).

    Обсуждение

    По результатам проведенного нами эксперимента итоговая потеря трансплантированных в суспензии ЭК составила примерно 50±9%. С учетом формулы для измерения площади круга (S=πR² ), можно пересчитать площадь ДМ диаметром 6 мм с расчетом на плотность ЭК здоровой роговицы, равную 3200 кл/мм² . Для полного покрытия указанного дефекта монослоем клеток, необходимо их количество, примерно равное 9×10⁴ . В нашем эксперименте количество ЭК в полученной суспензии при подсчете на приборе cells counter составило порядка 10×10⁴ клеток. При этом после трансплантации суспензии на кадаверный корнеосклеральный диск нами было определено количество адаптированных на ДМ клеток в количестве порядка 50% от исходной величины, что составляет в абсолютных величинах 5,4×10⁴ клеток на весь диаметр. Известно, что критически низким является количество в 500 кл/мм², что достаточно для выполнения адекватной барьерной и насосной функции для поддержания прозрачности роговицы. Таким образом, для достижения минимальной плотности ЭК, способных поддержать прозрачность роговицы, необходимо введение не менее 25×10⁴ клеток, с учетом запланированной потери.

    Следует отметить, что в нашем эксперименте клетки распределялись по ДМ неравномерно и где-то были собраны в конгломераты, между которыми были участки оголенной ДМ. Тем самым их функциональная способность, вероятно, может быть неполноценной и требует дальнейшего изучения. Очевидно, что для максимального эффекта и большей плотности адаптированных клеток на единицу площади требуется увеличение количества клеток в суспензии. При этом повышается вероятность, что они покроют ДМ в центральной зоне роговицы.

    Еще одним критерием эффективности эксперимента является качественная зачистка ДМ от имеющихся ЭК реципиента. Говоря о возможных показаниях к методу трансплантации суспензии ЭК, следует упомянуть декомпенсацию эндотелиального монослоя по причине его ятрогенного повреждения (буллезная кератопатия) или первичной генетически детерминированной патологии (дистрофия роговицы Фукса). В таком случае мы исходим из того, что у пациента имеется либо критически низкая плотность клеток в центральной зоне роговицы, как это характерно для эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, либо практически полное их отсутствие, что присуще диагнозу «буллезная кератопатия». Имея в виду данный факт, мы не исключаем, что полноценность зачистки эндотелия с ДМ в реальной клинической практике не столь значимо. Однако для оценки результатов проводимого нами эксперимента это может иметь существенное значение. Учитывая пока еще не изученные возможные пути потери клеток (на этапе имплантации, адгезии на структурах передней камеры, миграции в задний отрезок и трабекулярную сеть и т.п.), дальнейшей задачей исследования является получение максимального количества ЭК в суспензии.

    Заключение

    Таким образом, учитывая все вышеизложенное, представляется актуальным выполнение дальнейших экспериментальных исследований по достижению основной цели – полноценному заполнению дефекта центральной зоны задней поверхности роговицы изолированными ЭК, при условии сохранения их морфологии и функциональной активности. Стоит отметить, что идея реализации культивации эндотелия с потенциальным применением полученного продукта в реальной клинической практике на сегодняшний день нечетко регламентирована нормативно. При этом, по нашему мнению, данный метод наиболее перспективен для целей оказания хирургической помощи максимальному количеству пациентов с дисфункцией роговичного эндотелия на фоне дефицита донорского материала.


    


    Информация об авторах


    Борис Эдуардович Малюгин, д.м.н., профессор, член-корр. РАН, boris.malyugin@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-5666-3493


    Сергей Анатольевич Борзенок, д.м.н., mdborzenok@yandex.ru, http://orcid.org/0000-0001-9160-6240


    Ольга Павловна Антонова, к.м.н., antonova.mntk@gmail.com, https://orcid. org/0000-0002-7414-0511


    Д

Рис. 5. Иммуногистохимическое исследование образца кадаверной роговицы во 2-м этапе эксперимента
Fig. 5. Immunohistochemical study of cadaveric cornea sample in the 2nd stage of the experiment

митрий Сергеевич Островский, к.б.н., dmitriy.ostrovskiy@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-2817-7102;


    Зухра Рашитовна Эбзеева, врач-офтальмолог, ebzeeva.zuhra@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-3074-5017


    Information about the authors


    Boris E. Malyugin, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, boris.malyugin@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-5666-3493


    Sergey A. Borzenok, Doctor of Science in Medicine, Professor, mdborzenok@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-9160-6240


    Olga P. Antonova, PhD in Medical Sciences, antonova.mntk@gmail.com, https://orcid. org/0000-0002-7414-0511


    Dmitrii S. Ostrovskii, PhD in Biological Sciences, dmitriy.ostrovskiy@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-2817-7102


    Zukhra R. Ebzeeva, Ophtalmologist, ebzeeva.zuhra@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-3074-5017


    Вклад авторов в работу:


    Б.Э. Малюгин: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.


    С.А. Борзенок: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.


    О.П. Антонова: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.


    Д.С. Островский: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.


    З.Р. Эбзеева: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, написание текста.


    Authors' contribution:


    B.E. Malyugin: significant contribution to the concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.


    S.A. Borzenok: significant contribution to the concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.


    O.P. Antonova: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, statistical data processing, writing.


    D.S. Ostrovskii: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, statistical data processing, writing.


    Z.R. Ebzeeva: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, writing.


    Финансирование: Авторы получили грант в конкурсе «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами» (2021). Название гранта «Разработка метода получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека и ее последующей трансплантации в эксперименте ex vivo». Номер: 22-25-00356.


    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.


    Конфликт интересов: Отсутствует.


    Funding: The authors received a grant in the competition «Conducting fundamental scientific research and exploratory scientific research by small individual scientific groups» (2021). The grant title is «Development of a method for obtaining a suspension of human corneal endothelial cells and its subsequent transplantation in an ex vivo experiment». Number: 22-25-00356.


    Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.


    Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.


    Поступила: 22.10.2023


    Переработана: 14.11.2023


    Принята к печати: 30.11.2023


    Originally received: 22.10.2023


    Final revision: 14.11.2023


    Accepted: 30.11.2023