Цилиарный нейротрофический фактор и его значение в офтальмологии (обзор литературы)

    Нейропоэтические цитокины — это семейство структурно и функционально сходных полипептидов, играющих важную роль в таких сложных процессах, как дифференциация, выживание и регенерация разного рода клеток. Цитокины экспрессируются во многих тканях и характеризуются плейотропизмом, т.е. возможностью действовать на различные клетки-мишени. К семейству нейропоэтических цитокинов относят восемь факторов, которые осуществляют свое действие через общий рецепторный комплекс. Среди них в последнее время наибольшее внимание исследователей привлекает один из наиболее распространенных в нервной ткани цитокинов — цилиарный нейротрофический фактор (ЦНТФ). ЦНТФ впервые был обнаружен в тканях глаза эмбриона цыпленка R. Adler и соавт. в 1979 г. [1], и с тех пор не раз было продемонстрировано его нейропротекторное действие [6, 10, 12-14, 16, 19, 26].
    По мнению многих исследователей, ЦНТФ играет важную роль в патогенезе различных заболеваний, в частности нейродегенеративных. Например, широко изучается связь ЦНТФ с болезнями Альцгеймера [7], Паркинсона [24] и хореей Хантингтона [2]. В офтальмологии активно изучается роль ЦНТФ при таких тяжелых заболеваниях органа зрения, как глаукома, возрастная макулодистрофия, пигментный ретинит. На экспериментальных и клинических моделях продемонстрированы успешные попытки использования ЦНТФ в качестве нейропротективной терапии.
    
    Молекулярные механизмы действия ЦНТФ
    ЦНТФ является полипептидом, состоящим из 200 аминокислотных остатков с низкой молекулярной массой 22,7 кДальтон. Свое действие фактор оказывает через рецептор CNTFRα и гликопротеин gp-130. После связывания ЦНТФ с рецепторами происходит связывание gp-130 с рецептором ингибирующего фактора лейкемии (LIFR), и весь комплекс быстро перемещается внутрь клетки. В цитоплазме происходит активация тирозинкиназы семейства Janus, что приводит к фосфорилированию тирозинового остатка белка STAT (Signal transducer and activator of transcription). В свою очередь, STAT подвергается димеризации и перемещается в ядро, где происходит активация генов, необходимых для выживания клеток. Следует также отметить, что для сбалансирования эффекта цитокина существуют и механизмы подавления его действия. В частности, это тирозиновые фосфатазы, приводящие к дефосфорилированию активированных ферментов, и ингибиторы взаимодействия STAT с соответствующими генами [8].
    
    ЦНТФ в здоровом глазу
     О том, что ЦНТФ экспрессируется в различных структурах глаза, свидетельствует немало исследований. У животных белок обнаруживается в наружных сегментах фоторецепторов [22], в ганглиозных клетках как в соме, так и в аксонах [17, 22], во внутренних ядерных слоях сетчатки [11]. Другими источниками ЦНТФ считаются глиальные клетки Мюллера [22]. Цитокин и его рецептор также обнаружены в клетках решетчатой пластинки и астроцитах головки зрительного нерва (ГЗН) [15, 20]. Рецептор CNTFRα идентифицирован в клетках пигментного эпителия, в фоторецепторах, во внутренних и наружных плексиформных и внутренних ядерных слоях сетчатки, а также в ганглиозных клетках и в слое нервных волокон [3].
    По сравнению с исследованиями на животных, значительно реже встречаются работы, выполненные на клиническом материале. Однако недавно опубликованная объемная работа, выполненная U.R. Chowdhury и коллегами в 2010 г., указывает на значение ЦНТФ и для человеческого глаза. Авторы исследовали влагу передней камеры, получаемую при хирургии неосложненной катаракты, на наличие различных белковых частиц. Во влаге обнаружено 676 различных видов белков, в том числе и рецептор ЦНТФ CNTFRα [5].
    
    Нейропротекторные свойства эндогенного ЦНТФ
    Большое количество исследований показывают, что экспрессия ЦНТФ меняется при разного рода повреждениях нервной ткани глаза. Например, его уровень повышается в клетках Мюллера при введении в глаз токсических доз каиновой кислоты и N-метил-D-аспартата [9]. После аксотомии количество ЦНТФ также повышается, достигает пика через 2 недели и снижается до контрольного уровня через четыре недели [22]. При хронической компрессии зрительного нерва также выявлено повышение количества ЦНТФ в ганглиозных клетках сетчатки [4].
    Интересное исследование, проведенное A.Muller и соавт. [18], показало, что повышение синтеза ЦНТФ в астроцитах сетчатки приводит к активации белка STAT и переводит аксотомированные нейроны в стадию активной регенерации. При этом индуктором ЦНТФ служит повреждение хрусталика. Интравитреальное введение антител против ЦНТФ или ингибитора Janus киназы подрывает указанный эффект [18].
    При хроническом повышении ВГД ЦНТФ также подвергается повышенному синтезу в клетках Мюллера. На экспериментальной модели глаукомы, полученной путем коагуляции эписклеральных вен, показано, что если до вмешательства ЦНТФ идентифицируется только в слое ганглиозных клеток, то после повышения ВГД цитокин обнаруживается во внутренних и наружных ядерных слоях сетчатки. Его уровень достигает пика к 7-14 дню после коагуляции сосудов, а далее начинает снижаться [23]. Похожее исследование также показывает, что на поздних стадиях глаукомы количество ЦНТФ снижено в значительной мере [25].
    Нейропротекторные свойства ЦНТФ подтверждаются также в исследованиях с введением экзогенного ЦНТФ. С использованием достижений генной инженерии разработаны способы доставки ЦНТФ к клеткам сетчатки. Применяются два метода. Первым методом является трансплантация различных клеточных культур, способных к выработке белков. Используются клетки Шванна, пигментного эпителия, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, фибробласты. Эффект относительно недолгий — продукция белков продолжается около двух месяцев. Однако разработаны специальные имплантируемые приспособления, значительно продлевающие этот срок. Вторым методом является введение ДНК с помощью вирусных векторов. Чаще всего в качестве вектора используется адено-ассоциированный вирус (ААВ) типа 2. После однократного введения его эффективность сохраняется до года. Считается, что оба метода достаточно безопасны для глаза.
    В исследовании Y. Fang и Y. Hu сравнили трансплантацию клеток Шванна в чистом виде с пересадкой тех же клеток, «инфицированных» ЦНТФ в аксотомированные глаза крыс [6, 10]. «Инфицированные» клетки в большей степени активизировали регенераторные процессы (рост аксонов нейрональных клеток) в срок 1 мес. В другом исследовании в витреальную полость глаз крыс, перенесших ишемию с последующей реперфузией, вводили мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, секретирующие ЦНТФ, либо физиологический раствор на фосфатном буфере (контроль). Ганглиозные клетки сетчатки в основной группе подвергались апоптозу в меньшей степени, чем клетки контрольной группы, хотя через четыре недели после трансплантации уровень ЦНТФ уже был достаточно низким [13].
    В своем исследовании R.E. MacLaren и соавт. вводили ЦНТФ в глаза крыс с помощью ААВ. До введения производили дозированное локальное повреждение сетчатки, вызывавшее также окклюзию одной из ветвей центральной артерии сетчатки. По сравнению с контрольной группой (без ЦНТФ), в которой выжило всего 2% ганглозных клеток, в основной группе этот показатель достиг 12% [16]. При раздавливании зрительного нерва у взрослых крыс интравитреальное введение ЦНТФ с использованием ААВ [12] наряду с повышением выживаемости ганглиозных клеток сетчатки приводило также к регенерации нейронов, многие аксоны достигали дистальных частей зрительного нерва, а некоторые даже хиазмы. В другой части опыта при перерезке зрительного нерва и трансплантации аутологичного периферического нерва в место разреза, к седьмой неделе выживало еще больше ганглиозных клеток (около 25% популяции), и половина из них имела связь с трансплантатом (окрашивалась при введении в него красителя). Авторы заключают, что комбинированный подход, т.е. доставка ЦНТФ с помощью вирусного вектора и клеточных технологий в сочетании с хирургическим лечением может оказаться наиболее эффективным методом нейропротекции.
    Введение ААВ, содержащих ЦНТФ, исследуется также на экспериментальных моделях глаукомы. ЦНТФ оказывает значительный нейропротекторный эффект — на 15% меньше ганглиозных клеток погибает при повышении ВГД по сравнению с контрольной группой [19].
    В 2009 г. компания Neurotech объявила об окончании второй фазы клинических исследований по применению клеточной терапии при возрастной макулодистрофии. Компания разработала имплант, основанный на инновационной технологии инкапсуляции клеточных культур (Encapsulated Cell Technology) под названием NT-501. Имплант является небольшой трубкой (6 мм), которая имеет полупроницаемую мембрану, позволяющую секретировать белковый продукт (ЦНТФ), находящийся внутри генетически модифицированных клеток. Его капсула, с одной стороны, позволяет кислороду и питательным веществам диффундировать внутрь трубки, а с другой — является барьером для иммунных факторов организма. NT-501 имеет петлю, с помощью которой он подшивается к склере после введения в витреальную полость, соответственно, при необходимости его возможно эксплантировать (например, для корректировки дозы препарата). Надо также отметить, что после эксплантации NT-501 через 12-24 мес. клетки все еще способны продуцировать ЦНТФ в терапевтических дозах, что говорит о возможности продолжительной доставки ЦНТФ к сетчатке в обход гемато-ретинального барьера [26].
    В начальной стадии колбочковой дистрофии сетчатки, при которой отмечается только потеря наружных сегментов фоторецепторов, введение ЦНТФ в глаза крыс с помощью системы, подобной NT-501, приводит к задержке потери колбочек, и даже отмечается регенерация их наружных сегментов. Эффект подтвержден с помощью иммуногистохимических исследований и электроретинографии через 140 дней после имплантации системы [14].
    
    Применение ЦНТФ в клинической офтальмологии
    P.A. Sieving и соавт. [21] сообщают о хороших результатах первой фазы клинического исследования NT-501 при пигментном ретините. В нем принимали участие десять пациентов. Первая группа больных получала низкую дозу ЦНТФ, вторая — высокую дозу. Через 6 мес. после имплантации системы ни один пациент не отмечал ухудшения остроты зрения, а у нескольких больных даже наблюдалось улучшение, соответствующее 2-3 строчкам по таблице Снеллена. Местных и системных осложнений практически не наблюдалось [21]. Вторая фаза исследования все еще продолжается. В нем принимают участие 67 пациентов с начальной и 65 пациентов с далеко зашедшей стадией пигментного ретинита. В один глаз больным вводится NT-501 в двух разных дозах, а в другой глаз — плацебо. На данном этапе статистически значимых результатов нет, что объясняется медленным прогрессированием заболевания. За пациентами предполагается наблюдение еще до 18 мес. [21].
    Эффективность NT-501 у больных с географической атрофией желтого пятна изучалась в клиническом исследовании второй фазы, включавшем 51 пациента. Сравнивались группы пациентов, получавших ЦНТФ в двух разных дозах или плацебо. Через 12 мес. методом оптической когерентной томографии выявлялось утолщение сетчатки, коррелирующее с дозой ЦНТФ. Стабилизация зрительных функций была достигнута у 96% пациентов в группе с высокой дозой ЦНТФ по сравнению с 83% случаев в группе, которой вводили низкую дозу белка, и 75% пациентов — в группе плацебо [26].
    
    Заключение
    Таким образом, на сегодняшний день имеется большое число работ, свидетельствующих о важной роли ЦНТФ в обеспечении жизнедеятельности фоторецепторов и ганглиозных клеток сетчатки и их выживании при различных патогенных воздействиях. Однако экспериментальные исследования лишь косвенно указывают на роль цитокина в сохранении нервных клеток в человеческом глазу. На данном этапе число работ, посвященных использованию ЦНТФ в клинике, невелико, и, хотя результаты указанных работ выглядят многообещающими, их практическое значение пока весьма ограничено. Нейропротекция с помощью ЦНТФ представляется весьма перспективным подходом при разного рода заболеваниях органа зрения, что, однако, требует проведения дальнейших клинических исследований.