Рис. 1. Катетеризация левой внутренней сонной артерии кролика при экспериментальном моделировании близорукости
Рис. 2. Экспериментальная начальная близорукость. Истончение коллагеновых фибрилл. Ув. 10000
С 70-х гг. прошлого века, начиная с развития первых моделей близорукости на животных, огромное число отечественных и зарубежных экспериментальных работ подтвердили, что склера является органом-мишенью в патогенезе развивающейся близорукости [6].
В настоящее время уже не вызывает сомнения необходимость применения оригинальных экспериментальных моделей. Моделирование близорукости нацелено на воспроизведение клинико-анатомического комплекса симптомов, характеризующих данную болезнь, и преследует несколько задач: возможность раскрытия её этиологии и патогенеза, а также уточнение некоторых сторон лечебного воздействия.
Известно, что в основе нейрофизилогических реакций фоторецепции лежит конвертация 30-35 ккал/моль энергии кванта света в химический сигнал благодаря изомеризации производных ретинола – цисретиналя в полностью трансформу. В результате фотолиза родопсина транс-ретиналь оказывается в фосфолипидном окружении фоторецепторной мембраны в свободном состоянии. Откуда он должен быть как можно скорее удален, так как в противном случае оказывает токсическое действие на фоторецепторы и клетки пигментного эпителия сетчатки с развитием ряда дистрофических заболеваний [10, 18].
Большое количество исследований посвящено изучению действия побочных веществ зрительного цикла на сетчатку, ввиду того, что она является наиболее вероятной анатомически ближайшей структурой, которая будет повреждаться при неэффективном удалении продуктов реакции. Можно предположить, что в условиях повышенного кровотока на начальных стадиях близорукости избыточное кровенаполнение хороидеи может быть возможным источником чрезмерного поступления ретиноидов, которые оказываются невостребованными в биохимических реакциях сетчатки при близорукости, и ближайшей структурой для их накопления становятся известные рецепторы склеры. Однако подобные исследования ранее не проводились.
По данным литературы в образцах собственно сосудистой оболочки отмечается усиление или ослабление синтеза ретиноевой кислоты (РК) в условиях экспериментальной близорукости [10, 14, 23, 25]. Накапливаясь в склере [23, 25], РК приводит к изменению пролиферативной активности, дифференцировки фибробластов [15-17, 30] за счет усиления экспрессии белка фибулина-1, который создает межмолекулярные связи, стабилизирующие структуру экстрацеллюлярного матрикса [17]. Сведения о влиянии РК на пролиферативную активность и дифференцировку фибробластов склеры человека [11, 29] позволяют рассматривать данное вещество как потенциальный агент развития миопии не только в эксперименте, но и в условиях естественного появления и прогрессирования близорукости.
В последние годы опубликовано несколько исследований, подтверждающих влияние all-trans ретиноевой кислоты на процессы рефрактогенеза у молодых животных [2, 12, 24, 28].
В доступной нам литературе мы не нашли сведений об ультраструктурных особенностях склеры при моделировании начальной близорукости.
Цель
Изучить ультраструктурные особенности склеры при моделированной в эксперименте начальной близорукости.
Материал и методы
Рис. 3. Экспериментальная начальная близорукость. Нарушение плотной упаковки коллагеновых структур. Извилистый ход волокон. Ув. 12000
Рис. 4. Экспериментальная начальная близорукость. Утолщение центральной части эластического волокна. Ув. 20000
Экспериментальная работа проводилась на 15 кроликах-самцах породы «шиншилла» с исходной массой тела 2,0-2,5 кг в возрасте 2 мес. Исследования проведены в соответствии с основными положениями международной резолюции ARVO (Ассоциации по офтальмологии и исследованию зрения). Контрольная группа состояла из 5 кроликов. В опытную группу вошли 10 кроликов, которым с целью моделирования близорукости в левую внутреннюю сонную артерию устанавливался катетер Vasofix Certo 24G (B. Braun, Belgium, Luxemburg) (рис. 1). Этапы данной операции: а) выделение левой внутренней сонной артерии; б) установка Vasofix Certо 24G в левую внутреннюю сонную артерию; в) ушивание раны.
Операция осуществлялась под общим наркозом: для премедикации вводили 2% раствор ксилозина гидрохлорида (рометар). Через 10-15 мин. внутривенно в краевую вену уха вводили золетил-50 в дозе 6,6 мг/кг массы тела.
Правильное положение катетера контролировалось проведением рентгенограммы черепа в боковой проекции после введения 0,5 мл рентгенконтрастного вещества Омнипак (Amersham Health, Cork, Ireland) в концентрации 300 мг/мл.
В последующем в течение 6 мес. осуществлялось ежедневное введение 0,5 мл транс-ретиноевой кислоты в концентрации 0,06 мг/мл (Sigma –Aldrich, США).
Клиническую рефракцию определяли с помощью авторефрактометра «Mirae Optics (Charops) MRK-2000» (Япония). Доминирующей клинической рефракцией в контрольных глазах экспериментальных животных на всем сроке наблюдения являлась гиперметропия от +2,5 до + 3,5 дптр. Клиническая рефракция опытных глаз животных изменилась от гиперметропии +3,5±0,05 дптр в начале эксперимента до близорукости -0,75±0,26 дптр в конце срока наблюдения.
Эхобиометрические исследования осуществляли на аппарате «Ultrasonic Biometer Model 820» (США). В результате измерения передне-заднего размера глазного яблока до и после интраартериального введения all-trans-ретиноевой кислоты по окончанию эксперимента отмечено достоверное увеличение передне-заднего размера в опытных глазах с 16,01±1,26 до 18,79±1,45 (р<0,05). В то время как аналогичные данные в контрольных глазах животных достоверно не менялись и составили 15,18±1,17 мм.
Животных выводили из эксперимента под общим наркозом. Осуществляли внутривенную воздушную эмболию.
Материалом для морфологических исследований явились образцы склеры 20 опытных глаз животных с моделированной начальной близорукостью. Контролем служили образцы 10 глаз экспериментальных животных. Из каждого глаза в области экватора вырезали по 4 образца склеры в верхне-наружном квадранте. Всего исследовано 120 образцов склеры. Морфологические исследования выполнены через 6 мес. от начала эксперимента.
Для исследования склеры методом трансмиссионной электронной микроскопии материал фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида в течение 4 ч с последующей постфиксацией четырехокисью осмия в течение 1 ч. После этого образцы промывали в дистиллированной воде (2 смены по 30 мин), обезвоживали в спиртах и окиси пропилена и заливали в эпон по общепринятой методике. Ультратонкие срезы готовили на специальном приборе LKB, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца по общепринятой схеме и изучали на трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100 [5].
Статистический анализ результатов экспериментального исследования проводился согласно общепринятым методикам с помощью программных средств Microsoft Office 2007 для операционной системы Windows XP и программы STATISTICA 10.0. Статистические данные в условиях нормального распределения представлены средней арифметической ± ошибка средней арифметической (M±m). Уровнем значимости различий считали р<0,05 (95% уровень значимости).
Результаты и обсуждение
Рис. 5. Экспериментальная начальная близорукость. Фрагмент цитоплазмы фибробласта склеры. Интенсивное расширение цистерн ГЭС с мелкозернистым содержимым. Ув. 15000
Рис. 6. Экспериментальная начальная близорукость. Фрагмент цитоплазмы фиброцита склеры. Нитчатые филаменты по периферии цитоплазмы. Ув. 10000
Клетки склеры контрольной группы животных в основном представлены Фб и фиброцитами (Фц). Фб являются наиболее многочисленной и морфологически неоднородной популяцией клеток, имеющих небольшие размеры, с малым объемом цитоплазмы и некрупными клеточными ядрами. В зависимости от степени зрелости, особенностей ультраструктурной организации и функциональной активности среди них выделяется несколько субпопуляционных линий.
Преобладающими в склере контрольной группы животных являлись Фб крупных размеров с многочисленные отростками, с характерным светлым ядром, интенсивно развитой гранулярной эндоплазматической сетью (ГЭС) и митохондриями с выраженными кристами.
Фб с крупным ядром и дисперстным хроматином практически без отростков на поверхности клетки были представлены единично. В цитоплазме данных клеток преобладающими органеллами являлись свободные полисомы.
Фц, наблюдаемые в склере контрольных животных, морфологически проявляли себя как функционально неактивная часть популяции клеток склеры. Они имели веретеновидную форму, как правило, два небольших отростка, округлое вытянутое ядро и частично деградированные органеллы.
В склере здоровых глаз кроликов отмечалось отсутствие макрофагов, тучных клеток, лимфоцитов, плазмоцитов и миофибробластов.
Клеточный состав склеры экспериментальной группы животных составлял сложную гетерогенную популяцию, разнообразную по степени зрелости, особенностям ультраструктуры и функциональной активности клеток.
При трансмиссионной электронной микроскопии склеры животных с экспериментальной начальной близорукостью были выявлены ультраструктурные изменения, как со стороны волокнистых структур, так и со стороны клеточного состава и аморфного вещества соединительной ткани.
Коллагеновые волокна (КВ) в склере глаз животных с начальной близорукостью подвергались истончению. Количество крупных КВ уменьшилось, а более тонких КФ стало больше(рис. 2).
В условиях экспериментальной начальной близорукости изменение толщины КФ сопровождалось появлением извилистого хода волокон.
Наблюдалось также увеличение содержания аморфного вещества ECM, располагающегося между волокнистыми структурами и клетками склеры. Полагаем, что изменения в соотношении между аморфным веществом и волокнистыми структурами склеры и создают условия для уменьшения плотности и упорядоченности упаковки КФ(рис. 3).
Электронная микроскопия позволила отметить, что выявленные изменения волокнистых структур характерны как для крупных фибрилл, так и для тонких филаментов, а также для самых тонких фибрилл, располагающихся вокруг клеточной мембраны Фб.
ЭВ склеры были представлены единично и для них чаще характерна фрагментация (рис. 3). Они имели утолщение в центральной гомогенной части при некотором разрыхлении микрофибриллярной обертки (рис. 4).
В склере экспериментальной группы животных преобладающими клетками являлись функционально активные формы Фб.
Среди Фб выделялись два клеточных типа. Первый тип Фб – коллагенобласт, интенсивно продуцирующий коллаген. Он имел крупное ядро удлиненной формы, многочисленные инвагинации, одно крупное или два мелких ядрышка. В коллагенобласте присутствовала маргинация гетерохроматина (кариорексис). Цистерны ГЭПС этих клеток были резко расширены, поверхность канальцев и цистерн сети со сниженным количеством рибосом, пластинчатый комплекс не обнаруживался или был представлен отдельными вакуолями. Митохондрии немногочисленные, разбухшие с просветленным мелкозернистым матриксом, с редуцированными кристами, располагающимися по периферии.
Второй тип Фб, выявленный в склере экспериментальных животных, обладал крупным, округлой формы ядром, занимающим большую часть цитоплазмы. Ядрышко встречалось редко, маргинация гетерохроматина не характерна. Цитоплазма была бедна органеллами, но при этом отмечалась ГЭПС в виде раздутых, округлой формы цистерн, на которых местами густо, местами разреженно располагались рибосомы. Пластинчатый комплекс выявлялся в виде немногочисленных круглых вакуолей. По периферии цитоплазмы различных форм Фб определялись нитчатые филаменты в виде рыхлых пучков (рис. 5).
Таким образом, для клеточного состава склеры животных с экспериментальной начальной близорукостью характерно преобладание функционально активных форм фибробластов, имела место внутриклеточная репаративная регенерация, находящая свое выражение в гипертрофии клеток и гиперплазии ультраструктур.
Среди Фц склеры в зависимости от степени их дифференцировки выявлялись два типа клеток. Первый тип Фц представлен единичными клетками веретеновидной формы, с крупным ядром, занимающим основную часть клетки. В цитоплазме фиброцитов располагался слабо выраженный комплекс Гольджи и немногочисленные узкие цистерны эндоплазматической сети (ЭПС), лизосомы и липидные капли.
Второй тип Фц встречался чаще (рис. 6). Он обладал крупным веретеновидным ядром с многочисленными инвагинациями, единичными митохондриями ортодоксального типа и распределением гетерохроматина по периферии. ГЭС этого типа фиброцитов была незначительна по количеству, но состояла из крупных по объему цистерн с хлопьевидным содержимым. В цитоплазме по периферии клеток располагались тонкие нитчатые филаменты.
Для выявленных типов как Фб, обнаруженных в склере экспериментальных животных с начальной близорукостью, так и для Фц было характерно явление клазмоцитоза.
Таким образом, морфологический анализ субмикроскопических особенностей Фц склеры глаз животных с экспериментальной начальной близорукостью отражает признаки компенсаторных процессов. Внутриклеточные перестройки клеток фибробластического дифферона сформировали структурную основу адаптационных реакций соединительной ткани в данных экспериментальных условиях.
Как свидетельствуют данные литературы, начальную стадию развития близорукости характеризует истончение примерно на 20% склеры заднего полюса. Причиной истончения склеры является не ее пассивное растяжение, а потеря ткани. Истончение склеры при развитии близорукости является прежде всего результатом сниженного синтеза коллагена и увеличенная его деградация [19, 26]. В ряде экспериментальных моделей подтверждено снижение синтеза гликозаминогликанов на самых ранних стадиях развития осевой близорукости [21, 27]. Этот процесс сохраняется при прогрессирующем ее течении [20, 22].
В аспекте рассматриваемого вопроса важно отметить, что нами с помощью электронно-микроскопического исследования склеры глаз животных с моделируемой начальной близорукостью установлены значительные изменения коллагеновых волокон: истончение и нарушение естественного хода волокнистых структур. Изменения происходили и в микроскопическом строении эластического волокна: отмечено утолщение его гомогенной части. Важно подчеркнуть, что вышеописанные нарушения в структуре волокнистых компонентов соединительной ткани склеры происходили на фоне увеличения содержания ECM.
В катаболизме экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани склеры центральная роль принадлежит ферментам суперсемейства металлопротеаз (МР) [9]. Действие этих ферментов специфично и точно направлено. Так, ММР-1 (интерстициальная коллагеназа) расщепляет коллагены в единственном локусе, разрывая a1 (I), a2 (I), a1 (II) полипептидные цепи между остатками Gly775 и Ile776 и a1 (III) полипептидную цепь между остатками Gly784 и Ile785. ММР-2 (желатиназа А) расщепляет коллаген V типа, эластин, фибронектины и желатин [13].
Создавая основу для интерпретации полученных в ходе эксперимента данных, позволительно вернуться в 1960 гг., когда Давыдовский И.В. разработал учение, назвав его «общей патологией человека» [4].
Среди общепатологических процессов особое положение занимают категории «приспособление» и «компенсация». Для компенсаторного процесса характерен стадийный характер процесса. Еще в 1960-х гг. были обоснованы и подтверждены 3 морфологические фазы компенсаторного процесса: становления, закрепления, истощения (фаза декомпенсации) [7, 8]. В фазе становления компенсаторного процесса пораженный орган использует все скрытые резервы, структурные изменения касаются лишь обменных нарушений. В фазе закрепления происходит структурная перестройка пораженного органа, возникает новое морфологическое качество – гиперплазия, гипертрофия; в органе отлаживается новый тип обмена, обеспечивающий относительно устойчивую длительную компенсацию. В фазе истощения вновь образованные гипертрофированные и гиперплазированные структуры пораженного органа не обеспечиваются в полной мере кислородом, энергией, ферментами, что ведет к развитию в них дистрофических процессов, лежащих в основе декомпенсации [8].
В результате экспериментального моделирования начальной близорукости нами установлен процесс усиленного функционирования всех клеток фибробластического дифферона. Выявлены следующие закономерности ультраструктурных изменений при начальной экспериментальной близорукости: увеличение количества фибробластов с ультраструктурными признаками активного синтеза коллагена; активизация синтетических процессов в фиброцитах; появление клазмоцитоза у различных клеточных типов склеры; образование тяжей тонковолокнистого соединительнотканного регенерата. Для всех функционально активных клеток склеры с начальной близорукостью характерен выраженный полиморфизм секреции коллагена: от обычного пути переноса белка через транспортные вакуоли до голокринной секреции.
Вышеизложенные факты, по всей видимости, можно рассматривать как компенсаторный процесс, направленный на усиление коллагенового каркаса склеры и на ограничение дальнейшего растяжения склеры, а, следовательно, и развития близорукости. Анализ полученных нами данных совпадает с наблюдениями Волколаковой Р.Ю. об ультраструктурных изменениях в склере при миопии средней степени [3 ].
Принимая во внимание вышесказанное, можно не сомневаться, что при экспериментальной миопической болезни имеет место истощение компенсаторных возможностей, поскольку в склере присутствуют клетки с дистрофически-деструктивными изменениями ультраструктуры, отсутствуют клетки, ультраструктура которых свидетельствует о высоком уровне протекающих в них энергетических и пластических процессов, уменьшается число активных фибробластов [1].
Есть основания полагать, что выявление при экспериментальном моделировании активно функционирующих клеток фибропластического ряда обусловлено функциональным раздражением – растяжением склеры при начальной близорукости, оказывающем стимулирующее влияние на процессы фибриллогенеза.
Обнаруженные факты подтверждают закономерность, обнаруженную еще в прошлом веке С. Самуэлем (1879) [7]. Он писал о том, что «прогрессивное изменение тканей, вследствие непосредственного механического растяжения, встречается чрезвычайно часто. Если даже механическое растяже ние вначале и заключается просто в более сильном напряжении, то, все-таки, в тканях, имеющих нормальную кровеносную сеть, которая может следовать за их растяжением, впоследствии наступает более сильное питание, и потому растяжение, бывшее в начале механическим, переходит в настоящее прогрессивное изменение ткани» (т.е. в ее гиперплазию).
На сегодняшний день имеются серьезные основания считать, что механическое напряжение в склере, в результате удлинения оси глаза, при начальной близорукости имеет важное значение в контроле над фибробластами со стороны экстрацеллюлярного матрикса. С помощью набора трансмембранных рецепторов Фб получают сигналы о механических воздействиях на ткань от экстрацеллюлярного матрикса. Возникающие изменения экспрессии генов направлены на повышение резистентности матрикса к механическим воздействиям, но эти же изменения на определенном уровне могут приобрести и патологический характер [6].
Резюмируя проведенное экспериментальное исследование, нам хотелось бы констатировать следующее. Известные на сегодняшний день экспериментальные модели позволяют воспроизвести осевую близорукость и во многом объяснить механизмы ее формирования, что необходимо для понимания патогенеза данного заболевания и у человека.
Полагаем, что технологии лечения прогрессирующей близорукости должны быть направлены на компенсацию механического напряжения в склере.
Сведения об авторах
Обрубов Сергей Анатольевич – докт. мед. наук, профессор кафедры офтальмологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.
Ставицкая Галина Васильевна – канд. биол. наук. Центр охраны зрения «Доктор Оптикус».
Хамнагдаева Надежда Вениаминовна – аспирант кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.
Богинская Ольга Андреевна – канд. мед. наук, врач-офтальмолог ФГБУ ФНКЦ «ДГОИ им. Дмитрия Рогачёва» Минздрава России
Семенова Людмила Юрьевна – докт. мед. наук, профессор кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.
Порядин Геннадий Васильевич – докт. мед. наук, чл.-корр. РАН, зав. кафедрой патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова Минздрава России.
Чиненов Игорь Михайлович – канд. мед. наук, зав. отделением микрохирургии глаза ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Минздрава России.
