Влияние all-trans ретиноевой кислоты на культуру склеральных фибробластов кролика

     Известно, что ретиноевая кислота (РК) является одним из мощных агентов, регулирующих процессы морфогенеза в нервной системе [6, 18]. Под контролем ретиноидов находится экспрессия значительного количества генов в клетках нейрональной и глиальной природы, в частности кодирующих белки-транспортеры, дофамингидроксилазу, декарбоксилазу глутаминовой кислоты, рецепторы, сопряженные с Gp, ионотропные рецепторы, некоторые ионные каналы, белки цитоскелета, внутриклеточные сигнальные молекулы, фактор роста нервов, молекулы, ассоциированные с нейродегенерацией. Ретиноевая кислота принадлежит к категории регуляторных эндогенных молекул, продуцируемых астроглией [7].

    По современным представлениям хороидальная аll trans ретиноевая кислота выступает вероятным посредником процесса рефрактогенеза.

    Ранее было показано, что при систематическом алиментарном пути поступления ретиноевой кислоты в организм в условиях эксперимента на кроликах и морских свинках наблюдалось увеличение длины глазного яблока [11]. При моделировании депривационной близорукости на животных также было обнаружено повышение уровня ретиноевой кислоты в сетчатке и склере [11].

    Анализ литературных данных дает право сделать вывод о том, что в ремоделировании склеры важная роль принадлежит фибробластам, в которых присутствуют рецепторы ретиноевой кислоты. All-trans ретиноевая кислота ингибирует пролиферацию фибробластов при посредничестве двух семейств ядерных рецепторов: RAR изотипы (α, β, γ) и RXR изотипов (α, β, γ). Связывание лиганда ретиноевой кислоты вызывает ряд конформационных изменений, что позволяет рецептору связывать гистоны ацетилтрансферазы и другие комплексы, активирующие экспрессию генамишени [13, 15, 16].

    Имеются также данные о том, что ретиноевая кислота способна изменять морфологию фибробластов склеры. Последние становятся тоньше, более сморщенными. Под влиянием ретиноевой кислоты расширяются межклеточные пространства и снижается общее количество фибробластов [16, 21].

    All-trans ретиноевая кислота, с одной стороны, изменяет пролиферативную активность, дифференцировку фибробластов [2, 8, 9, 19] за счет увеличения экспрессии белка экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани и лиганда для аггрекана – фибулина-1, а с другой – уменьшает экспрессию аггрекана, гликозаминогликанов, содержащих протеогликаны, играющих важную роль в ремоделировании склеры [9].

    Однако ретиноевая кислота способна не только ингибировать [11, 17], но и стимулировать пролиферацию склеральных фибробластов [5]. Противоречивые результаты влияния аll-trans ретиноевой кислоты на пролиферативную активность фибробластов склеры послужили основанием для проведения настоящего исследования.

    Цель.

    Изучить влияние all-trans ретиноевой кислоты на культуру склеральных фибробластов кролика.

    Материал и методы.

    Экспериментальные исследования были проведены на базе Научно-исследовательского института фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований при Российском национальном исследовательском медицинском университете им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

    В качестве объекта исследования были использованы 10 кроликов-самцов породы «шиншилла» с исходной массой тела 2,0-2,5 кг в возрасте 1,5-2 мес. Исследования проведены в соответствии с основными положениями международной резолюции ARVO (Ассоциации по офтальмологии и исследованию зрения). Контрольная группа состояла из 5 кроликов.

    Животных выводили из эксперимента под общим наркозом. Осуществляли внутривенную воздушную эмболию. Далее была произведена энуклеация глазных яблок. Склера очищена от подлежащих оболочек и промыта в фосфатном буферном растворе. Из заднего отрезка каждого глаза вырезали образцы склеры площадью 1 мм 2 . Образцы склеры были помещены под покровное стекло в чашку Петри площадью 25 см 2 (NUNC) в среду Игла в модификации Дульбекко DMEM/F12 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и пенициллин-стрептомицинового раствора (ПанЭко, Россия). Склеру инкубировали при 370 С в условиях 100% влажности с уровнем СО₂ 5%. Среду меняли каждые три дни. Через две недели после достижения монослоя культура фибробластов кролика была пересажена в новые чашки Петри. Для эксперимента использовался шестой пассаж.

    Определение чувствительности фибробластов к ретиноевой кислоте оценивали с помощью микротетразолиевого теста (МТТ-тест) [12].

    В качестве субстрата в МТТ-тесте использовали соль тетразолия 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ) (Sigma-Aldrich).

    Культуру фибробластов помещали в 96-ти луночные планшеты (“Linbro”, UK) (2,5х105 клеток на пробу, объем инкубационной среды 100 мкл) и культивировали 24 часа при 37° С в условиях 100% влажности с уровнем СО 25%. При оценке чувстви-тельности фибробластов в МТТ-тесте all-trans ретиноевую кислоту (Sigma Aldrich) использовали в нескольких концентрациях. Через 24 часа к пробам добавляли all-trans ретиноевую кислоту, разведенную в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 1 ммоль/л, 0,5 ммоль/л, 0,25 ммоль/л и 0,1 ммоль/л и инкубировали еще 24 часа. В контрольные лунки вместо all-trans ретиноевой кислоты вносили по 100 мкл физиологического раствора. Далее плашки с пробами инкубировали в атмосфере воздуха, обогащенного 5% СО₂ , при 37° С в течение 24-х часов.

    По окончании инкубации из каждой лунки декантировали по 100 мкл среды и вносили по 20 мкл раствора МТТ (конечная концентрация- 5 мг/мл). Через 4 часа инкубации (5% СО₂ , при 37° С) удаляли среду и добавляли 100 мкл ДМСО. Затем клетки с поверхности снимали раствором трипсина 0,25% (ПанЭко, Россия) и осуществляли подсчет в камере Горяева как общего количества клеток, так и клеток с гранулами формазана.

    Жизнеспособность клеток определяли с помощью добавления к клеткам 10 мкл 0,1% раствора трипанового синего. Жизнеспособность клеток высчитывали в камере Горяева по формуле: % жизнеспособных клеток = (1,00 – (количество синих клеток/ общее количество клеток)) ×100.

    Статистический анализ результатов исследования проводился согласно общепринятым методикам с помощью программных средств Microsoft Office 2007 для операционной системы Windows-XP и программы STATISTICA 10.0. Статистические данные в условиях нормального распределения представлены средней арифметической ± ошибка средней арифметической (M±m). Статистически значимыми считали результаты с уровнем значимости р<0,05 (95% уровень значимости).

    Результаты.

    Микротетразолиевый тест как метод оценки выживаемости клеток in vitro был предложен в 1983 г. T.Mosmann [12]. По мнению автора, МТТ-тест отличается от других методов простотой, доступностью, быстротой исследования, достаточно высокой информативностью. Метод основан на способности соли тетразолия (используемой в качестве субстрата) под влиянием ферментных систем живых клеток превращаться в формазан, окрашенный в синий цвет. Показано, что для разных типов клеток характерна различная активность дегидрогеназных систем [3, 4, 12]; мертвые же клетки теряют способность синтезировать формазан [10, 14], что и позволило предложить МТТ-тест для определения в суспензии доли живых клеток. Количество (в сравнении с контролем) образовавшегося после того или иного воздействия формазана характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в клетках и может являться критерием степени их чувствительности к тому или иному виду воздействия [3, 4].

    Проведенные нами исследования показали: при концентрации all-trans ретиноевой кислоты 0,5 ммоль/л, 0,25 ммоль/л и 0,1 ммоль/л, добавленной к культуре фибробластов, наблюдалось достоверное, в сравнении с контролем, увеличение количества клеток с гранулами формазана. При концентрации alltrans ретиноевой кислоты 1 ммоль/л уже 21,05±2,35% клеток содержали гранулы формазана(рис.). То есть добавление к культуре клеток all-trans ретиноевой кислоты вызывает достоверное увеличение их количества с гранулами формазана, что подтверждает рост числа жизнеспособных клеток [7] и, по нашему мнению, свидетельствует о стимуляции пролиферации фибробластов. Это находит подтверждение и в ранее выполненных исследованиях [5].

    Определенный научный и практический интерес представляет оценка цитотоксичности all-trans ретиноевой кислоты с помощью окраски клеток трипановым синим. При анализе обращает на себя внимание тот факт, что больше всего фибробластов погибло при концентрации all-trans ретиноевой кислоты 0,1 ммоль/л, тогда как при других концентрациях процент погибших клеток не достоверно отличался от контроля (табл.).

    Полученные данные позволили нам сделать предположение, что all-trans ретиноевая кислота способна быть донатором свободных радикалов, которые вступают в процесс одноэлектронного восстановления кислорода с участием клеточного мембран-связанного мультимолекулярного ферментного комплекса (НАДФН-оксидаза). Полагаем, что в этом случае активация процесса перекисного окисления липидов способна объяснить почти 20% гибель фибробластов при концентрации ретиноевой кислоты 0,1 ммоль/л. Приведенные выше сведения служат дополнением к более ранней нашей публикации по изучению характеристик популяций Т- и В- лимфоцитов, NK- клеток и активационных маркеров у детей с приобретенной близорукостью в зависимости от исходного состояния иммунной системы [1].

    Заключение.

    Таким образом, обнаруженные нами в эксперименте закономерности чувствительности фибробластов к ретиноевой кислоте позволяют утверждать, что с увеличением концентрации all-trans ретиноевой кислоты повышается пролиферация фибробластов. Факт стимуляции пролиферации фибробластов является важным обоснованием роли all-trans ретиноевой кислоты в ремоделировании склеры. Однако это лишь первый шаг на пути более углубленных исследований патогенеза близорукости.

    

    Сведения об авторах

    Хамнагдаева Надежда Вениаминовна – аспирант кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

    Обрубов Сергей Анатольевич – доктор медицинских наук, профессор кафедры офтальмологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

    Семенова Людмила Юрьевна – доктор медицинских наук, профессор кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

    Салмаси Жеан Мустафаевич – доктор медицинских наук, профессор кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова Минздрава России

    Порядин Геннадий Васильевич – доктор медицинских наук, чл.-корр. РАН, заведующий кафедрой патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

    Казимирский Александр Николаевич – доктор медицинских наук, профессор кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова Минздрава России

    Кузнецова Юлия Дмитриевна – врач-офтальмолог отделения микрохирургии глаза ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Минздрава России.