Влияние интравитреального введения эпидермального фактора роста на морфофункциональное состояние глаза кролика

    

    Актуальность

    Эпидермальный фактор роста (Epidermal Growth Factor, EGF) – стимулятор роста пролиферации и дифференцировки клеток, реализуемых за счет его связывания с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR). EGF представляет собой белок с молекулярной массой 6,4 кДа с 53 аминокислотными остатками, содержащими внутримолекулярные дисульфидные связи. Помимо самого эпидермального фактора роста, семейство EGF включает гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста (HB-EGF), трансформирующий фактор роста α(TGF-α), амфирегулин, эпирегулин, эпиген, бетацеллулин и нейрегулин-1, -2, -3 и -4 [1]. EGF выступает в роли сильного митогена различных типов клеток, стимулятора пролиферации эпителиоцитов и фибробластов. EGF является компонентом слезы человека [2], обнаружен в тканях глаза [3] и в ряде образцов стекловидного тела [4]. Установлено влияние EGF и членов его семейства как на экстраокулярные ткани и органы, так и на внутриглазные структуры и клетки, включая пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) [5, 6].

    На культурах клеток было показано влияние эпидермального фактора роста на пролиферацию и миграцию клеток ПЭС. Имеются сведения о том, что патологические процессы, происходящие в ретинальном пигментном эпителии, опосредуют развитие многочисленных заболеваний сетчатой оболочки глаза, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД), дистрофии сетчатки, ретиниты и др. [7]. В связи с этим можно предположить, что внутриглазное присутствие терапевтической дозы EGF, основанное на его патогенетически ориентированном воздействии, может иметь положительное влияние на клиническое течение этих заболеваний сетчатки.

    Цель исследования

    Изучить морфофункциональное состояние глаза кролика при интравитреальном введении эпидермального фактора роста.

    Материал и методы

    Эксперименты проведены на 4 кроликах породы Шиншилла массой 2,5 кг. В стекловидное тело правого глаза (опыт) животных вводили препарат Эберпрот-П, содержащий рекомбинантный EGF, объемом 0,1 мл в дозе 100 нг. Левый глаз (контроль) оставался интактным. Животным опытной группы произвели три интравитреальные инъекции (ИВИ) EGF с интервалом 1 месяц. ИВИ выполняли в правый верхний квадрант глаза на расстоянии 3–4 мм от лимба под местной анестезией глазными каплями 0,4 % оксибупрокаина («Инокаин», Индия), общим внутримышечным наркозом препаратами Золетил («Valdepharm», Франция) 15 мг/кг и Ксила («Interchemie werken «De Adelaar B.V.», Нидерланды) 20 мг/кг с использованием операционного микроскопа Carl Zeiss (Германия).

    Через 7 и 30 дней после каждой инъекции проводили биомикроскопию и офтальмоскопию, оптическую когерентную томографию (ОКТ) заднего отрезка глаза (Nidek RS-3000 Advance, Япония) in vivo. Для морфологического исследования через 1 месяц после третьей ИВИ глаза энуклеировали и помещали в раствор 4 % формальдегида и 1 % глутарового альдегида. Перед заливкой в парафин производили обезвоживание глазных тканей в спирте. Гистологические срезы толщиной 4–6 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Проводили световую микроскопию гистопрепаратов и гистоморфометрический анализ (количество клеток на площадь поля зрения), включающий оценку плотности клеток ганглиозного слоя, внутреннего ядерного и наружного ядерного слоев сетчатки глаза экспериментальных животных.

    Статистический анализ проведен с использованием программного обеспечения SPSS для Windows, версия 25.0, IBM-SPSS.

    Результаты и обсуждение

    Прижизненные биомикроскопические и офтальмоскопические исследования интраокулярных структур глаза опытных кроликов не выявили признаков отека или внутриглазного воспаления, явлений токсического или раздражающего действия интравитреальной инъекции EGF. Не было обнаружено патологических изменений в виде катаракты, феномена Тиндаля в переднекамерной влаге, помутнений стекловидного тела в т.ч. в области сетчатки, ретинальных инфильтратов.

    По данным ОКТ глаз кроликов in vivo не обнаружены эффекты «сморщивания» или «складчатости» сетчатки, связанные с ИВИ (рис. 1). При этом толщина сетчатки оставалась без изменений в течение всего срока наблюдения, что указывало на отсутствие ретинального отека: на 7-й день после ИВИ она составляла 152 ± 5 мкм против контроля 157 ± 3 мкм (р = 0,15), на 30-й день – 158 ± 5 мкм против контроля 158 ± 3 мкм (р = 1,0).

    Морфологическая картина интраокулярных тканей глаза после интравитреальной инъекции EGF характеризовалась отсутствием каких-либо патологических изменений в архитектонике слоев и клеточных структур сетчатки (рис. 2). В гистопрепаратах опытной группы сохранялась последовательность слоев и клеток пигментного эпителия сетчатки, в которых определяются крупные клеточные ядра, что соответствовало результатам наблюдений в контроле. При этом четко визуализировались: ганглиозный слой клеток, внутренний ядерный слой сетчатки, включающий клетки Мюллера и наружный ядерный слой, образованный ядрами фоторецепторных клеток.

    Гистоморфометрический анализ продемонстрировал отсутствие существенной разницы в плотности клеток ганглиозного слоя, внутреннего ядерного и наружного ядерного слоев сетчатки опытного и контрольного глаз кроликов(табл.).

    Отсутствие каких-либо патологических изменений при интравитреальном введении EGF может быть связано с тем, что последний является естественным белком организма человека и животных, который присутствует и в глазных тканях. Так, EGF обнаружен в слезной жидкости, играет важную роль в восстановлении поврежденного эпителия роговицы [8]. Показано значимое снижение уровня эпидермального фактора роста в роговичном эпителии у пациентов с синдромом рецидивирующей эрозии роговицы [9]. В связи с этим EGF предложен в качестве средства для лечения стойких эпителиальных поражений роговой оболочки глаза.

    Эпидермальный фактор роста признан одним из ключевых индукторов пролиферации клеток ПЭС [10]. Было установлено повышение продукции рецептора EGF в клетках Мюллера при повреждениях сетчатки [11]. Интравитреальное применение амфирегулина, являющегося лигандом рецептора EGF, у морских свинок подтвердило предположение специалистов о потенциальных возможностях его клинического использования при дистрофической ретинальной патологии [12].

    Заключение

    Интравитреальное применение эпидермального фактора роста в дозе 100 нг у кроликов не вызывает внутриглазного специфического воспаления или каких-либо деструктивных эффектов в сетчатке.

    Положительные результаты проведенных экспериментальных исследований подтверждают представление о совместимости эпидермального фактора роста с интраокулярными тканями, что существенно повышает значимость применения этого многофункционального цитокина, как перспективного биологически активного соединения, нацеленного на патогенетически ориентированное лечение дистрофических заболеваний сетчатки.

    

    Информация об авторах

    Бикбов Мухаррам Мухтарамович – доктор медицинских наук, профессор, директор Уфимского НИИ глазных болезней, eye@anrb.ru, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Халимов Тимур Азатович – врач-офтальмолог IV микрохирургического отделения Уфимского НИИ глазных болезней, khalimoff.timur@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-7141-3214

    About authors

    Bikbov Mukharram Mukhtaramovich – PhD, Professor, Director of the Ufa Research Eye Institute, eye@anrb.ru, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Khalimov Timur Azatovich – ophthalmologist of the IV Microsurgical Department of the Ufa Research Eye Institute, khalimoff.timur@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-7141-3214

    Вклад авторов в работу:

    Бикбов М.М.: концепция и дизайн исследования.

    Халимов Т.А.: сбор и обработка материалов, сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, диагностические исследования, написание текста.

    Contribution of the authors:

    Bikbov M.M.: concept and design of the study.

    Khalimov T.A.: collection and processing of materials, collection and processing materials, analysis of the obtained data, diagnostic studies, writing text.

    Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Financial transparency: Authors have no financial interest in the submitted materials or methods.

    Conflict of interest: None.

    Поступила: 19.06.2022

    Переработана: 30.06.2022

    Принята к печати: 31.08.2022

    Originally received: 19.06.2022

    Final revision: 30.06.2022

    Accepted: 31.08.2022