Влияние местного применения раствора лактоферрина на уровень цитокинов и показатели окислительного стресса при щелочных ожогах роговицы

    Актуальность

    Одним из наиболее тяжелых травматических повреждений органа зрения является ожог роговицы. Распространенность ожогов роговицы зависит от степени развития стран и составляет от 11,5 до 22,1% всех травм органа зрения [1, 2].

    Для повышения эффективности терапии повреждений роговицы, разработки новых способов лечения необходимо детальное изучение патогенеза данной патологии. Например, в последнее время все большее внимание уделяется изучению иммунологического и свободнорадикального статуса роговицы как ключевого биохимического процесса, участвующего в патогенезе развития повреждений роговицы [3].

    Известно, что от баланса провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, а также от выраженности окислительного стресса во многих случаях зависит исход заболевания [4]. Например, чрезмерное повышение уровней провоспалительных цитокинов и активация процессов свободнорадикального окисления могут приводить к развитию перфорации роговицы, и наоборот, слабое повышение содержания провоспалительных цитокинов и активация продукции свободных радикалов могут приводить к хронизации процесса и чрезмерному развитию соединительной ткани при инфекционных язвах роговицы [5–7].

    Лактоферрин (ЛФ) – железосвязывающий гликопротеин, представитель семейства белков трансферринов.

    В его состав входит около 700 аминокислотных остатков. Одиночная полипептидная цепь собрана в два симметричных шаровидных N- и C-концевых полипептидных фрагмента, которые соединены α-спиралью. Каждый из этих фрагментов способен связывать по одному иону железа [8].

    Сочетание антибактериальных и антиоксидантных свойств делает ЛФ перспективным препаратом для лечения системных заболеваний. В ряде исследований были доказаны его противовирусные и противовоспалительные свойства, а также способность ускорять заживление ран кожи. Антиоксидантные свойства ЛФ обусловлены его способностью связывать железо, блокируя развитие реакций Фентона и Хабер–Вайса [9]. ЛФ обладает как бактериостатическими, так и бактерицидными свойствами, в связи с чем он является важным компонентом неспецифической системы защиты глаза человека.

    Было выявлено противовоспалительное действие ЛФ, реализующееся путем угнетения синтеза конвертазы C3 системы комплимента. Бактерицидное действие обусловлено способностью ЛФ непосредственно взаимодействовать с поверхностью бактериальной стенки грамотрицательных бактерий, связываясь с анионным липидом А липополисахарида клеточной стенки. В результате такого взаимодействия повреждается бактериальная мембрана. В экспериментальных работах была доказана антибактериальная активность ЛФ в отношении таких бактерий, как Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. и Pseudomonas spp. [10].

    Ранее было показано, что ЛФ является эффективным средством для лечения гнойной язвы роговицы, которое снижало выраженность окислительного стресса, улучшало клиническое течение, снижало процент осложнений. Однако влияние на баланс цитокинов при данной патологии не оценивалось [11–13].

    Цель

    Изучить особенности иммунологического и свободнорадикального статуса роговицы при ее щелочном ожоге и возможности его коррекции с помощью местного применения раствора ЛФ.

    Материал и методы

    Исследование проводилось на базе ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен на заседании комиссии по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных (№17 от 07.11.2018). В качестве тест-системы использовали 45 кроликов-самцов породы «Советская шиншилла», массой 3000–3500 г, в возрасте 9–12 месяцев. Животных закупали в специализированном питомнике Филиал «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России и имели необходимые ветеринарные свидетельства. Кроликов содержали в конвенциональном виварии университета в индивидуальных клетках.

    Манипуляции на глазных яблоках проводили под топической анестезией 0,4% оксибупрокаина. Эвтаназию животных осуществляли путем передозировки золетилом (Директива Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63 по охране животных, используемых в научных целях).

    Исследование включало следующие опытные серии:

    – 1-я серия (сравнение) – интактные животные без моделирования патологии и экспериментальных воздействий;

    – 2-я серия (контроль) – животные, у которых моделировали щелочной ожог роговицы и инстиллировали в конъюнктивальную полость физиологический раствор;

    – 3-я серия (основная группа) – коррекция свободнорадикальных и иммунологических нарушений была представлена животными, у которых моделировали щелочной ожог роговицы и инстиллировали в конъюнктивальную полость раствор ЛФ (2,5 мг/мл).

    Животных выводили из эксперимента через 1, 3, 5, 7, 14, 21 и 28 суток после моделирования ожога роговицы. На каждую временную точку приходилось по 3 кролика, т.е. 6 глаз (n=6). Физиологический раствор и раствор ЛФ применялись 3 раза в день в виде инстилляций по 1 капле в каждый глаз каждый день.

    Экспериментальная модель щелочного ожога роговицы у кроликов воспроизводилась по модифицированному методу Обенбергера. На роговицу кроликов на 20 с помещали диск фильтровальной бумаги в виде круга диаметром 6 мм, смоченный 5% раствором гидроксида натрия.

    После эвтаназии животных проводилась энуклеация глазных яблок. Роговицу высекали с участком склеры в 1 мм от лимба, измельчали и гомогенизировали в изотоническом фосфатном буфере в пропорции 1:10. Полученный гомогенат центрифугировали при 1800 g (Eppendorf, Германия) в течение 10 мин. Супернатант замораживали при −80 ºС и хранили до выполнения анализа.

    Для определения свободнорадикального статуса роговицы оценивали концентрацию веществ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реактивных продуктов), карбонильных производных белков, активности супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (G-per).

    Выраженность иммунологических нарушений в роговице анализировали по уровню фактора некроза опухолей (ФНО-1α), интерлейкинов (ИЛ) 4, 10, трансформирующего ростового фактора бета-1 (TGF-1β), которые анализировали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческих наборов Cloud-Clone (КНР). Полученные значения пересчитывали на 1 мг белка, который определяли методом Брэдфорда с помощью коммерческого набора (Thermo Fisher, США).

    Полученные данные анализировали с помощью программы Statistica 10.0 (Stat Soft Inc., США). Характер распределения данных оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилка. Так как во всех случаях распределение данных было отличным от нормального, результаты представлены в виде медианы и нижнего и верхнего квартилей (МЕ [Q1; Q3]), а для оценки статистической значимости применялись непараметрические критерии – при сравнении более чем двух групп критерий Крускала–Уоллиса, в дальнейшем попарные сравнения выполняли с помощью критерия Манна–Уитни с поправкой Бонферрони; при сравнении двух групп – критерий Манна–Уитни U. При вероятности ошибки первого рода p<0,05 различия между группами считались статистически значимыми.

    Результаты

    У животных контрольной группы на 1-е сутки эксперимента отмечалась смешанная инъекция бульбарной конъюнктивы, которая сохранялась до 5–7 суток.

    На 2–7-е сутки отмечали отек роговицы вне зоны ожога.

    Полная эпителизация роговицы у животных контрольной группы наблюдалась с 8-х по 15-е сутки (в среднем на 10,2±2,4 сутки). Перфорации развились в 2 глазах на 13-е и 16-е сутки. На 28-е сутки на всех глазах наблюдалось развитие грубых помутнений роговицы.

    Применение раствора ЛФ человека ускоряло заживление роговицы кролика. В частности, восстановление нормального эпителия роговицы на фоне его применения у всех животных произошло к 7-му дню после ожога (рис. 1, 2). При этом ни у одного животного не было зафиксировано перфораций. Смешанная инъекция бульбарной конъюнктивы отмечалась с 1-х суток и сохранялась до 3–5 суток, отек роговицы вне зоны ожога наблюдался со 2-х по 6-е сутки. Кроме того, проведенное нами ранее гистологическое исследование показало, что применение раствора ЛФ приводит к восстановлению структуры стромы роговицы и снижению выраженности воспалительной инфильтрации зоны дефекта и лимба [14], что клинически проявлялось отсутствием неоваскуляризации и формированием менее грубых помутнений роговицы у животных основной группы.

    Моделирование щелочного ожога сопровождалось развитием окислительного стресса в роговице. Концентрация ТБК-реактивных продуктов повышалась с 1-х суток патологии, достигая максимума к 7-м суткам, при этом в 2,5 раза (p<0,05) превышая показатели нормы. Далее она постепенно снижалась и к 28 суткам достоверно не отличалась от значений у интактных животных (табл. 1).

    Содержание карбонильных производных белков также повышалось на 3, 5, 7 и 14-е сутки после моделирования ожога на 8,54, 29,55, 20,16 и 28,58% соответственно, статистически достоверно превосходя значения нормы, а затем оно снижалось, и на 21-е и 28-е сутки становилось даже ниже значений у интактных животных на 6,99 и 37,03% (p<0,05) соответственно.

    Отмечалось снижение активности антиоксидантных ферментов в роговице. Активность СОД уменьшалась на всех сроках наблюдения с минимальными значениями на 7-е сутки – на 46,79% (p<0,05) ниже значений нормы.

    Также значительно снижалась активность глутатионпероксидазы на 5, 7 и 14-е сутки на 25,46, 25,21 и 39,46% по сравнению с нормой соответственно (p<0,05).

    Уровень провоспалительного цитокина ФНО-1α достигал максимальных значений уже на 1-е стуки развития ожога и сохранялся повышенным к 28-м суткам эксперимента. Содержание противовоспалительного цитокина ИЛ-10 также увеличивалось с 1-го дня ожоговой травмы, достигая пика на 3-и сутки – в 2 раза превышая значения у интактных животных. При этом показатели данного цитокина оставались повышенными до 28 суток. Уровень TGF-1β также существенно увеличивался при щелочном ожоге на протяжении всего эксперимента, максимально превышая значения нормы на 5-е и 7-е сутки – соответственно на 76,08 и 63,03% (p<0,05). Концентрация противовоспалительного цитокина ИЛ-4 повышалась только на 3-и и 5-е сутки на 20,84 и 19,31% соответственно, а затем она снижалась, но на 7-е и 14-е сутки оставаясь все же значительно выше в сравнении с показателями нормы (p<0,05). Полученные результаты свидетельствуют о развитии окислительного стресса и воспалении при моделировании щелочного ожога роговицы (табл. 2).

    Применение ЛФ для коррекции свободнорадикальных и воспалительных нарушений приводило к следующим результатам. Он оказывал антиоксидантное действие, о чем свидетельствует меньшее повышение уровня ТБК-реактивных продуктов и карбонильных производных белков по сравнению с показателями контроля на всех сроках наблюдения (табл. 1). ЛФ также ускорял восстановление активности СОД, в частности, она снижалась только на 5, 7 и 14-е сутки и далее достоверно от значений нормы не отличалась. На 21-е и 28-е сутки уровень СОД был достоверно выше показателей животных контрольной группы. Кроме того, ЛФ повышал активность G-per, которая снижалась только на 7-е и 14-е сутки относительно группы интактных животных (табл. 1).

    При изучении влияния ЛФ на цитокиновый статус роговицы были получены следующие результаты. Уровень ФНО-1à также достоверно превышал показатели нормы на протяжении всего эксперимента. Более того, на 1, 3, 7, 14 и 21-е сутки он даже превышал показатели, зафиксированные у контрольных животных (табл. 2).

    Концентрация ИЛ-10 на фоне применения ЛФ была выше значений интактных животных на всех сроках наблюдения, а на 1, 5, 14-е сутки она достоверно превышала контрольные значения. Концентрация ИЛ-4 на фоне применения ЛФ повышалась на 7-е сутки эксперимента по сравнению с нормой, но уже на 14–28-е сутки была ниже ее. При этом уровень ИЛ-4 был ниже значений контроля на 3, 5, 21 и 28-е сутки, но выше него на 7-е сутки (табл. 2).

    Содержание TGF-1β на фоне лечения ЛФ с 1-х по 28-е сутки было выше показателей нормы. С 1-х по 5-е сутки концентрация данного фактора была ниже показателей контрольной группы, а с 7-х по 28-е сутки – выше их.

    Полученные результаты свидетельствуют о том, что ЛФ повышает уровень провоспалительного цитокина ФНО-1α и может разнонаправленно влиять на содержание противовоспалительных цитокинов.

    Обсуждение

    В настоящем исследовании изучено состояние свободнорадикального и иммунологического статуса роговицы при моделировании щелочного ожога роговицы и проведено тестирование возможности коррекции возникших биохимических нарушений с помощью ЛФ.

    Было показано, что при моделировании щелочного ожога происходит активация свободнорадикального окисления и развитие окислительного стресса, о чем свидетельствовало повышение уровня ТБК-реактивных продуктов, карбонильных производных белков, снижение активности антиоксидантных ферментов СОД и G-per. Максимальные изменения отмечались на 5–7-е сутки патологии.

    В норме повышенная продукция активных форм кислорода (АФК) компенсируется активацией защитных антиоксидантных ферментов, тогда как при ожогах данный баланс нарушается, что приводит к избытку свободных радикалов. Так, установлено, что сразу после воздействия щелочи на ткань роговицы усиливается синтез АФК [15, 16] и снижается экспрессия и активность антиоксидантных ферментов альдегиддегидрогеназы 3А1 в эпителии роговицы, СОД и G-per [17, 18].

    В нашем исследовании также было показано, что развитие щелочного ожога роговицы сопровождается развитием выраженной воспалительной реакции, которая проявлялась повышением концентрации в ткани роговицы как провоспалительного ФНО-1α, так и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10, TGF-1β) цитокинов. Аналогичные результаты были получены и рядом других авторов [19, 20].

    Считается, что при повреждении клеточных мембран, высвобождаются различные медиаторы, в том числе ИЛ, хемокины, и инициируется иммунологическая реакция в роговице [21].

    В настоящем исследовании для коррекции свободнорадикалных и иммунологических нарушений применялся ЛФ. Терапевтическая эффективность местного применения раствора ЛФ в концентрации 2,5 мг/мл в виде инстилляций по 1 капле 3 раза в день при экспериментальном щелочном ожоге роговицы в настоящем исследовании проявлялась ускорением эпителизации дефекта, профилактикой развития осложнений (перфораций). При этом ЛФ оказывал антиоксидантное действие, влияя на баланс цитокинов. В частности, он повышал уровень провоспалительного цитокина ФНО-1α, при этом не одинаково влиял на содержание противовоспалительных цитокинов, например, повышал ИЛ-10, снижал ИЛ-4 и разнонаправленно действовал в отношении TGF-1β.

    Заключение

    Таким образом, в настоящем исследовании было установлено, что развитие щелочного ожога роговицы сопровождается развитием окислительного стресса (повышением уровня ТБК-реактивных продуктов и карбонильных производных белков, снижением активности СОД и G-per), а также выраженной воспалительной реакции – повышением уровня ФНО-1α, ИЛ-10, TGF-1β. Применение ЛФ в инстилляциях оказывает выраженный терапевтический эффект, что проявляется ускорением заживления, профилактикой развития осложнений (перфораций роговицы), снижением выраженности окислительного стресса, изменением баланса про- и противовоспалительных цитокинов.

    Информация об авторах

    Кирсанова Ирина Владимировна, ассистент кафедры глазных болезней ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, kirsanova-iv@inbox. ru, https://orcid.org/0000-0002-2851-0972

    Мохова Светлана Алексеевна, студентка 6 курса педиатрического факультета ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, svetlanamohova2000@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-5502-1648

    Колесников Александр Вячеславович, д.м.н., доцент, заведующий кафедрой глазных болезней ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, kolldoc@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9025-5258

    Щулькин Алексей Владимирович, д.м.н., доцент, профессор кафедры фармакологии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, alekseyshulkin@rambler.ru, https://orcid.org/0000-0003-1688-0017

    Information about the authors

    Irina V. Kirsanova, assistant of the Department of Eye diseases Ryazan State Medical University, kirsanova-iv@inbox.ru, https://orcid.org/0000- 0002-2851-0972

    Svetlana A. Mokhova, 6th year student of the Pediatric Faculty Ryazan State Medical University, svetlanamohova2000@gmail.com , https://orcid. org/0000-0002-5502-1648

    Aleksandr V. Kolesnikov, MD, Dr. Sci. (Med.), Associate Professor Ryazan State Medical University, Head of the Department of Eye diseases Regional Clinical Hospitals names N.A. Semashko, kolldoc@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9025-5258

    Aleksey V. Shchul′kin, MD, Dr. Sci. (Med.), Associate Professor, Professor of the Department of Pharmacology Ryazan State Medical University, alekseyshulkin@rambler.ru, https://orcid.org/0000-0003-1688-0017

    Вклад авторов:

    Кирсанова И.В. – сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста, редактирование.

    Мохова С.А. – написание текста, редактирование.

    Колесников А.В. – концепция и дизайн работы.

    Щулькин А.В. – концепция и дизайн работы, написание текста, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Аuthor’s сontribution:

    Kirsanova I.V. – collection, analysis and processing of material, statistical data processing, writing, editing.

    Mokhova S.A. – writing text, editing.

    Kolesnikov A.V. – the concept and design of the work.

    Shchul′kin A.V. – the concept and design of the work, the writing of the text, the final approval of the version to be published.

    Финансирование: Авторы не получали финансирование при проведении исследования и написании статьи.

    Funding: The authors received no specific funding for this work.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Conflicts of Interest: None.

    Поступила: 15.05.2024

    Переработана: 05.08.2024

    Принята к печати: 07.08.2024

    Originally received: 15.05.2024

    Final revision: 05.08.2024

    Accepted: 07.08.2024