Влияние нейротрофического фактора мозга - BDNF на органотипические культуры сетчатки

    Патология сетчатки, приводящая к значительному понижению зрения, слепоте и инвалидности, относится к важнейшим медико-социальным проблемам современной офтальмологии.
    Функциональная реабилитация сетчатки при патологии различного генеза остается актуальной задачей. Большие возможности для восстановления структуры и функции поврежденных тканей открывает перспектива использования нейротрофических факторов.
    В последние годы пристальное внимание специалистов различных профилей привлекает нейротрофический фактор головного мозга (brain-derived neurotrophic factor – BDNF).
    BDNF — это белок с молекулярной массой 13 килоДальтон, который принадлежит к классу цитокинов, семейству факторов роста и подсемейству нейротрофинов; выявляется в глиальных и, преимущественно, в нейрональных клетках. Впервые этот фактор был описан в 1987 г. [4].
    BDNF играет важную роль в развитии и функционировании ЦНС и имеет существенное значение в развитии ее различных патологических состояний. В работах, посвященных исследованиям нейродегенеративных заболеваний, ишемических повреждений и травм ЦНС установлено, что BDNF обладает выраженными нейрозащитными свойствами, угнетает клеточный апоптоз [7, 12], препятствует гибели нейронов [6, 8–9, 15, 17] и cтимулирует рост холинергических нервных волокон [10].
    В экспериментальных исследованиях по офтальмологии выявлено наличие рецепторов к BDNF на ганглиозных клетках сетчатки [13] и установлено, что при экспериментальной глаукоме происходит резкое снижение его содержания во внутриглазных структурах [16]. При проведении клинико-диагностических исследований установлено, что у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой и диабетической оптической нейропатией наблюдается снижение уровня BDNF в сыворотке крови и слезной жидкости, усугубляющееся по мере прогрессирования заболевания [2–3], и что при увеличении содержания BDNF во внутриглазных структурах возможно предотвращение дальнейшего развития повреждения ганглиозных клеток сетчатки [5, 11, 14].
    Для того чтобы оценить перспективы и возможность применения этого фактора в клинической офтальмологии, необходимо проведение дальнейших экспериментальных исследований, направленных на изучение влияния BDNF на состояние сетчатки. В настоящее время в качестве экспериментальных моделей некоторых видов патологии широко используются различные типы клеточных и тканевых культур. Наиболее перспективны для проведения исследований органотипические культуры сетчатки, обладающие следующими преимуществами: сохранность цитоархитектоники; отсутствие нейро-гуморальных воздействий; возможность создать модель, максимально соответствующую поставленным задачам [1].
    Цель работы — изучить влияние рекомбинантного BDNF на состояние органотипических культур сетчатки.

Материал и методы
    В работе были использованы 72 эксплантата сетчатки человека (постмортальный материал) и 46 эксплантатов сетчатки двухмесячных крыс (всего 118 эксплантатов).
    Изолированные глаза крыс промывали в 70% этиловом спирте и в двух сменах стерильного фосфатного буфера (DPBS; Sigma). Сетчатку выделяли в охлажденном DPBS, содержащем 0,8% глюкозы (Gl-DPBS). Выделенную сетчатку измельчали на фрагменты, размером 1–2 мм², эксплантаты промывали раствором антибиотиков и помещали в культуральную чашку с полной питательной средой (DMEM⁄F12 с добавлением цитокинов, антибиотиков и 5% сыворотки).
    Эксплантаты культивировали двумя способами: в прикрепленном виде в чашке Петри диаметром 30 мм и в роллере — флаконе, вращающемся со скоростью 60 об.⁄мин. При роллерном культивировании фрагменты сетчатки сворачиваются и формируются сферические трехмерные структуры — ретинальные тельца.
    К преимуществам данного метода относятся: максимальная сохранность цитоархитектоники и межклеточных взаимоотношений; отсутствие клеточного влияния культуральной среды. Несмотря на значительные преимущества роллерного метода культивирования, этот метод имеет и некоторые недостатки: отсутствие ясной морфологической картины в центре «ретинальных телец» и высокая трудоемкость. Вследствие этого основные результаты получены при культивировании в прикрепленном виде. Культивирование проводили в инкубаторе во влажной камере при температуре +37 °C и 5% содержании углекислоты в культуральной среде — DMEM⁄F12 (1 : 1), с добавлением цитокинов, антибиотиков и 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Смену среды производили каждые 2-3 суток.
    BDNF добавляли в культуральную среду в концентрации 100 нг⁄мл, эффективность которой была определена в предварительных экспериментах с культивацией клеток сетчатки и определением их жизнеспособности. Контролем служили эксплантаты, культивируемые без BDNF.
    Культивирование производилось в течение 30 суток, далее образцы фиксировали и хранили в забуференнном растворе антифриза до окрашивания антителами.
    Во время эксперимента состояние эксплантата и поведение клеток контролировали ежедневно с помощью инвертированного микроскопа с фазовым контрастом. Для количественной оценки роста культивируемых эксплантатов использовали индекс площади: отношение площади эксплантата, вместе с зоной выселяющихся клеток, к исходной площади эксплантата. Для оценки жизнеспособности клеток эксплантата сетчатки использовали флуорохромные красители — акридиновый оранжевый, который окрашивает живые клетки, и пропидий йодистый, который окрашивает ядерную ДНК гибнущих клеток. Посредством флуоресцентного микроскопа производили прямой подсчет жизнеспособных клеток и общего числа клеток на равновеликих участках и определяли их соотношение.
    По окончании эксперимента эксплантаты промывали фосфатным буфером и фиксировали 4% раствором параформальдегида в физиологическом растворе с добавлением 0,01 молярного фосфатного буфера, при значении рН — 7,4, в течение 20 мин при 4 °С. После промывания фиксированных прикрепленных эксплантатов в фосфатном буфере дно культуральной чашки подсушивали и эксплантаты с выселившимися клетками окружали гидрофобной полоской, после чего проводили их иммуногистохимическую окраску. Для этого применяли метод непрямого иммуногистохимического окрашивания с использованием коктейля моноклональных мышиных антител к маркеру коммитированных нейробластов – β-III-тубулину в разведении 1 : 100 (Chemicon, MAB1637) и поликлональных кроличьих антител к маркеру глиальных клеток — кислому глиальному фибриллярному белку – GFAP в разведении 1 : 80 (Sigma, G9269). Реакцию с первичными антителами проводили в течение 12 ч при 4 оС. После промывки в фосфатном буфере эксплантаты покрывали смесью вторичных антител к иммуноглобулину кролика, меченных техасским красным (красное свечение при зеленом освещении), и антител к иммуноглобулину мыши, меченных Су 2 (зеленое свечение при синем освещении), — оба в разведении 1 : 100.

Результаты и обсуждение
    В течение первых 5–7 суток культивирования происходило оседание и распластывание эксплантатов сетчатки человека по дну культуральной чашки; небольшое количество клеток выселялось из эксплантата на дно. При проведении исследования в фазовом контрасте на данном этапе эксплантаты сетчатки, при культивировании с BDNF и без него, по внешнему виду и по количеству выселившихся на дно клеток не отличались. По результатам анализа клеток сетчатки на жизнеспособность, на 7-е сутки в эксплантатах, культивируемых без BDNF, было выявлено наличие обширных очагов клеточной гибели, как внутри, так и на поверхности эксплантатов. В эксплантатах, культивируемых с BDNF, очаги клеточной гибели были значительно меньше (рис. 1).
    На 14-й день культивирования происходит дальнейшее выселение клеток из эксплантата на дно культуральной чашки и их расселение по значительной территории. При диаметре эксплантата 2 мм клетки расселялись на расстояние более 2 мм от первоначальных внешних границ эксплантата. По результатам окраски на жизнеспособность пропидий йодидом и акридином оранжевым, на 14-е сутки культивирования в эксплантатах сетчатки, культивируемых без BDNF, наблюдаются значительное расширение зон клеточной гибели внутри эксплантатов и разрушение неприкрепленных краевых участков эксплантатов (рис. 1а), нарушение структуры и некроз в краевых зонах эксплантата. В прикрепившихся эксплантатах при культивировании с BDNF, в отличие от контроля, очагов клеточной гибели найдено не было (рис. 1б). Выявлено небольшое количество погибших клеток в краевых участках эксплантата, не прикрепившихся к дну чашки. В эксплантатах, культивируемых с BDNF, начинают формироваться многочисленные длинные разветвленные отростки, выходящие за пределы эксплантатов, иногда достигающие соседних эксплантатов. В контроле формируется незначительное количество коротких отростков.
    На 17-е и особенно на 21-е сутки культивирования продолжается выселение клеток из эксплантата на дно чашки. В эксплантатах, культивируемых с BDNF, происходит дальнейшее увеличение числа отростков, их длины и разветвленности. В эксплантатах, культивируемых без BDNF, число и длина отростков практически не увеличиваются (рис. 2). Окраска на жизнеспособность показала, что в эксплантатах, культивируемых c BDNF, на 21-е сутки наблюдается небольшое расширение зон клеточной гибели, тогда как в контроле остается лишь небольшое количество живых клеток — вблизи кровеносных сосудов и на поверхности эксплантатов.
    На 30-е сутки культивирования в зоне расселения клеток из эксплантатов, культивируемых с BDNF, образуются пучки сильно разветвленных отростков, длина которых значительно больше, чем на 21-е сутки. На препаратах, иммуногистохимически окрашенных на GFAP и Tubulin, определяется наличие утолщений на тубулинпозитивных отростках (рис. 3). В эксплантатах, культивируемых в присутствии BDNF, было найдено большое количество GFAP-иммунонегативных – β-III-тубулин-иммунопозитивных с аксоноподобными тубулинпозитивными отростками, распространяющимися за пределы тела эксплантата. За пределами эксплантата волокна распространялись по поверхности выселившихся клеток, но за зону их локализации не выходили. Образование обширных сетей отростков вне эксплантата наблюдалось в местах наибольшей плотности выселившихся клеток. Проявления β-III-тубулина свидетельствуют о принадлежности данных клеток к нейрональному ряду. В контроле клетки, проявляющие β-III-тубулин, были обнаружены только в глубине эксплантатов и в очень незначительном количестве. Аксоноподобные β-III-тубулин-позитивные отростки были очень тонкие, определялись только в теле эксплантата и никогда не выходили за его пределы, в отличие от опыта.
    В эксплантатах сетчатки крыс, культивируемых с BDNF и без него, получены результаты, сходные с результатами, полученными на сетчатке человека.
    По результатам количественного анализа, индекс площади эксплантатов, культивируемых с BDNF, на 14-е, 21-е и 30-е сутки инкубации достоверно увеличивается соответственно на 25, 40 и 70% (рис. 4). В контроле этот показатель остается практически без изменений.
    Количественный анализ жизнеспособности клеток сетчатки показал, что в эксплантатах, культивируемых с BDNF, через 30 суток культивирования жизнеспособными остаются 64% клеток, в контроле клеточная жизнеспособность не превышала 10%.
    В условиях роллерного культивирования на 14-й день инкубации в эксплантатах сетчатки с BDNF наблюдалось образование длинных неразветвленных отростков, выходящих за пределы культивируемого образца при концентрации BDNF в культуральной среде — 100 нг⁄мл. В контроле и при меньшей концентрации BDNF (50 нг⁄мл) видимых различий обнаружено не было.

Выводы
    По результатам исследования установлено, что в органотипических культурах сетчатки человека и крысы при культивировании с BDNF в концентрации 100 нг⁄мл: увеличивается жизнеспособность клеток сетчатки; развиваются активная клеточная миграция и активный рост β-III-тубулин-иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы, выходящих за пределы эксплантата. Можно предположить, что эти тонкие аксоноподобные отростки являются регенерирующими аксонами выживших после эксплантации ганглиозных клеток сетчатки.
Поступила 04.04.08