Влияние ожирения на развитие инсулинорезистентности и окислительного стресса в эксперименте

    

    Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, число страдающих диабетом в мире за последние 40 лет выросло в четыре раза, сообщил генеральный директор Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) Тедрос Адханом Гебрейесус. От сахарного диабета 2-го типа (СД2) страдает почти полмиллиарда людей во всем мире, сообщают американские ученые. Повышение числа больных происходит за счет СД типа 2 [1–3]. Во многих исследованиях показано, что при СД развитие гипергликемии и ее воздействие на сосудистую стенку опосредуется свободными радикалами [4–7]. При этом установлено, что в механизмах повышения концентрации свободных радикалов, в частности перекисного окисления липидов (ПОЛ) при диабете, участвует не только гипергликемия, но и гипоинсулинемия [8–11]. Однако закономерности развития инсулинорезистентности и изменений свободнорадикальных процессов при ожирении (ОЖ) изучены недостаточно. Не изучены также молекулярные механизмы взаимосвязи между развитием окислительного стресса и формированием инсулинорезистентности при ожирении.

    Цель

    Изучение влияния абдоминального ожирения на формирование периферической инсулинорезистентности и развитие окислительного стресса у крыс.

    Материал и методы

    Эксперименты проведены на 90 белых крысах-самцах и не рожавших самках линии Вистар. Схема дизайна исследования представлена на рис. 1. В первой группе крыс (30 особей) сахарный диабет вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения 2,5% раствора антибиотика стрептозотоцина (производство фирмы «Sigma») в дозе 60 мг/кг веса животного на фоне 24–48-часового голодания. Во вторую группу входили 40 крыс, на которых проводили моделирование сахарного диабета аналогично первой группе [12–14], однако вводили стрептозотоцин в комплексе с обогащенной липидами диетой [15–17]. Развившийся диабет у крыс соответствовал по течению СД 2-го типа у человека [18–21]. Это подтверждается повышением уровня глюкозы и гликированного гемоглобина при сохраненной секреции С-пептида.

    В состав диеты входило 8% белков, 30% жира, 62% углеводов. В возрасте 3 мес масса тела крыс, находившихся на подобной диете, составила 180 г, что на 20 г больше по сравнению с животными контрольной группы. Контрольная группа состояла из 20 крыс с массой тела 160 г (см. рис. 1). Контрольным животным вводили эквивалентное количество физиологического раствора. Оценивали динамику основных показателей углеводного и липидного обменов: определяли концентрацию глюкозы, уровень гликозилированного гемоглобина, концентрацию лактата и пирувата, содержание С-пептида, а также инсулин-связывающую активность эритроцитов, утилизацию глюкозы эритроцитами и концентрацию холестерина и триглицеридов. Методом спиновых меток и зондов у крыс при экспериментальном диабете проводили анализ структуры мембран волокон хрусталика.

    Взятие крови у животных проводили до введения стрептозотоцина и через 7 дней после введения антибиотика. После завершения эксперимента крыс выводили из исследования путем передозировки анестезирующим препаратом «Рометар» (фирма «Биовета», Чешская Республика). Производили взятие крови из сердца.

    На проведение исследований получено разрешение Локального Этического комитета ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (Протокол № 161 от 30 января 2017 г.). Содержание животных и постановку экспериментов проводили в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 11.10 1983 г. и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., а также с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals».

    Статистическую обработку материала осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента. При изучении характера взаимоотношений исследуемых параметров использовали коэффициент корреляции Спирмена. Различия считали достоверными при p<0,05. Все средние значения в таблицах представлены в виде M±SD.

    Степень переокисления липидов в плазме крови и в мембранах эритроцитов определяли по концентрации тиобарбитуровой кислоты (ТБК) активных веществ, гидроперекисей (ГП) и малонового диальдегида (МДА) с помощью стандартных наборов фирмы BioVision, USA на иммуноферментном анализаторе StatFax 3200.

    Активность фермента каталазы, концентрацию лактата, пирувата и С-пептида определяли с помощью наборов на биохимическом анализаторе.

    Результаты

    Полученные результаты показали, что через 7 сут после введения стрептозотоцина в плазме крови у диабетических крыс отмечается статистически достоверное увеличение концентрации глюкозы в плазме крови более чем в 3,52 раза. Гипергликемия была более выражена у диабетических крыс при абдоминальном ожирении (табл. 1). Отмечались изменения в показателях липидного обмена: уровень общего холестерина повышался в 1,84 раза (p<0,01), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) – на 77% (p<0,001), липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) – на 24%; при этом уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) снижался (особенно значительно у крыс с абдоминальным ожирением) (p<0,001).

    У диабетических крыс возрастало содержание ТБК-активных соединений более чем в 2 раза, мочевины – на 42% по сравнению с контролем (p<0,05). При этом резко снижалась активность ферментов антиоксидантной защиты, например, содержание СОД у диабетических крыс на 7-е сутки введения препарата снизилась в 1,79 раза, активность каталазы, расщепляющей пероксид водорода, – на 35% (p<0,05). По данным, представленным в табл. 1, видно, что инсулинсвязывающая активность (ИСА) рецепторов на мембранах эритроцитов снижается в 1,7 раза (рис. 2), во всех группах эксперимента снижаются также показатели утилизация глюкозы эритроцитами (рис. 3)(p<0,01). Полученные данные подтверждают тезис о том, что после введения стрептозотоцина у крыс на 7–10-е сутки наступают клинико-биохимические изменения, характерные для сахарного диабета человека [22–24]. После введения стрептозотоцина у крыс с ожирением масса увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контрольной группой, а также с крысами с СД 2-го типа без ожирения. Масса абдоминального жира у диабетических крыс с ожирением превысила показатели также и у интактных животных в 2,5 раза (см. табл. 1). Уровень глюкозы в крови у крыс с СД 2-го типа и ожирением натощак был повышен по отношению к контролю в 3,6 раза.

    Обсуждение

    Результаты исследования свидетельствуют, что у крыс, получающих стрептозотоцин в комплексе с обогащенной липидами диетой, развивался СД с абдоминальным ожирением. Резко выраженная гипергликемия у этих крыс сопровождалась снижением инсулинсвязывающей активности (ИСА) эритроцитов, например, ярко выраженное снижение ИСА отмечается у крыс с СД2 во второй группе, где гормональная активность возрастает более чем 1,7 раза (p<0,001) (см. рис. 2). Повышается также степень утилизации глюкозы эритроцитами (см. рис. 3), что может свидетельствовать, по-видимому, о формировании периферической инсулинорезистентности. Отмечались однонаправленные изменения в показателях гликированного гемоглобина (HbA1C), однако степень увеличения HbA1C по отношению к контролю у диабетических крыс была в 3,5 раза выше, чем гликемия натощак. Литературные данные свидетельствуют о том, что HbA1C является более чувствительным маркером повышения гликемии [25–27]. Содержание лактата и пирувата в сыворотке крови крыс с СД 2-го типа с ожирением и СД2 без ожирения было достоверно повышено по отношению к показателям контрольных животных, что связано с развитием гипоксии тканей при сахарном диабете. Гипоксия обусловлена недостаточным поступлением кислорода и глюкозы в клетку при СД 2-го типа, а также глюкозотоксичностью [28–30]. Эти изменения свидетельствуют о значительных нарушениях в обмене углеводов в условиях недостаточного действия инсулина. Вследствие этого концентрация лактата у диабетических крыс увеличивается более чем в 4 раза по сравнению с контролем, содержание пирувата возрастает в 3 раза (p<0,05). Уровень С-пептида у диабетических крыс не отличается от показателей контрольных животных (см. табл. 1), что свидетельствует о сохранении функции β-клеток в поджелудочной железе у крыс с СД2 [27, 30].

    У диабетических крыс с ожирением на 7-е сутки после введения стрептозотоцина происходят более выраженные изменения в липидном обмене крови по сравнению с показателями у крыс с СД2 без ожирения. Развивается гиперхолестеринемия, гипертриглицеридемия, возрастание уровня липопротеинов (см. табл. 1). Повышение содержания холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ) отрицательно коррелирует с параметрами утилизации глюкозы эритроцитами (r=–0,7). При этом снижение уровня ЛПВП и гипертриглицеридемия сопровождаются повышением содержания ЛПОНП, что свидетельствует об отсутствии ингибирующего влияния инсулина на продукцию и формирование ЛПОНП [7]. У диабетических крыс с ожирением отмечалось снижение потребления глюкозы эритроцитами на 8% по сравнению с крысами без ожирения и с крысами в контрольной группе (p<0,05). Как видно из табл. 2, при снижении связывания 125I инсулина в условиях гипергликемии происходит нарушение процессов утилизации глюкозы эритроцитами. При этом, как показано в исследованиях, проведенных нами in vitro, понижается как базальная, так и стимулируемая инсулином утилизация глюкозы клетками (рис. 4).

    Наблюдается отрицательная корреляционная

    взаимосвязь между уровнем глюкозы крови и процессами утилизации глюкозы эритроцитами (r=–0,62; p<0,05).

    Дислипидемия у диабетических крыс с абдоминальным ожирением приводит к значительным повышениям уровня ТБК активных веществ в сыворотке крови, таких как МДА и диеновых конъюгатов (ДК) (см. рис. 4), это, по-видимому, приводит к нарушению функции мембран эритроцитов и снижению утилизации глюкозы в эритроцитах (p<0,05). Например, содержание МДА возрастает в мембранах эритроцитов (Эр) у крыс СД2 в 1,8 раза, гидроперекиси – в 1,5 раза, в то время как утилизация глюкозы эритроцитами снижается в 1,93 раза, активность фермента-антиоксиданта CuZn-COД снижается в 1,83 раза (p<0,05) (см. табл. 2). Достоверное снижение инсулинсвязывающей активности (ИСА; см. рис. 2) и утилизации глюкозы эритроцитами (см. рис. 3)в этих группах (свидетельствует о наличии инсулинорезистентности (ИР). У диабетических крыс с абдоминальным ожирением гипергликемия сопровождается снижением степени утилизации глюкозы эритроцитами, снижением активности ферментов-антиоксидантов происходит на фоне повышения концентрации ТБК-активных веществ (МДА, гидроперекисей (ГП) (см. табл. 2; рис. 5).

    При исследовании методом спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) у диабетических крыс, страдающих ожирением, по сравнению с крысами с ожирением без СД, но также имеющих повреждение в структуре мембраны волокон хрусталика, обнаруживаются увеличение гидрофобности и изменение топографии поверхности, сопровождающиеся уменьшением количества активно реагирующих с малеимидом тиоловых групп. Уже на начальной стадии помутнения хрусталика структурные параметры достигают численных значений, характерных для поздних стадий развития катаракты. Инициирующим фактором помутнения хрусталика глаз при катаракте у крыс с СД и ожирением является, по-видимому, сдвиг осмолярности в клетках мембран волокон хрусталика в результате накопления в них нерастворимых форм сорбитола и фруктозы.

    Таким образом, СД2 с абдоминальным ожирением и СД2 без ожирения сопровождаются структурно-функциональными нарушениями в мембранах клеток, коррелирующими с показателями глюкозо-инсулинового гомеостаза и уровнем ТБК-активных соединений, следовательно, при СД 2-го типа у крыс, сопровождающимся ожирением, метаболические изменения носят более выраженный характер. У крыс с ожирением стрептозотоцин-индуцированный диабет наряду с дислипидемией, повышением степени переокисления липидов при низкой активности ферментов антиоксидантов приводит к формированию инсулинорезистентности. Об этом свидетельствуют возрастание степени гипергликемии, снижение активности инсулиновых рецепторов и потребления глюкозы клетками на фоне развития окислительного стресса. Инициирующим фактором помутнения хрусталика глаз при катаракте у крыс с СД и ожирением является, по-видимому, сдвиг осмолярности в клетках мембран волокон хрусталика в результате накопления в них нерастворимых форм сорбитола и фруктозы.

    Выводы

    1. Абдоминальное ожирение у крыс с СД 2-го типа и СД 2-го типа без ожирения сопровождается структурно-функциональными нарушениями в мембранах клеток, коррелирующими с показателями глюкозо-инсулинового гомеостаза и степенью перекисного окисления липидов.

    2. При абдоминальном ожирении у крыс с СД2 наряду с возрастанием уровня гипергликемии, снижением инсулинсвязывающей активности рецепторов мембран эритроцитов и потребления глюкозы клетками развивается периферическая инсулинорезистентность.

    3. Абдоминальное ожирение у крыс с СД2 сопровождается дислипидемией, повышением степени перекисного окисления липидов, снижением антиокислительной активности ферментов, что свидетельствует о развитии окислительного стресса.

    4. Абдоминальное ожирение у крыс с СД2 приводит к развитию помутнения хрусталика глаз, что инициируется, по-видимому, сдвигом осмолярности в клетках мембран волокон хрусталика в результате накопления в них нерастворимых форм сорбитола и фруктозы.

    

    Информация об авторах
    Микаелян Нина Погосовна, д.б.н., профессор, ninmik@ yandex.ru, https://orcid.org//0000-0003-1422-014

    Шестопалов Александр Вячеславович, д.м.н., профессор, al-shest@yandex.ru, https://orcid.org//0000-0002-1428-7706

    Микаелян Анжела Артуровна, аспирант, poppysinclair8@ gmail.com, https://orcid.org//0000-0002-5527-5752

    Комаров Олег Самуилович, д.б.н., профессор, komolsam@ mail.ru, https://orcid.org//0000-0002-1685-8832

    Гурина Алла Евгеньевна, к.м.н., докторант, allagurina@ yandex.ru, https://orcid.org//0000-0002-6562-9964

    Autors' information

    Nina P. Mikaelyan, D.Bi.Sci., Professor, ninmik@yandex.ru, https://orcid.org//0000-0003-1422-014

    Alexander V. Shestopalov, Dr. of Sci. (Med.), Professor, al-shest@ yandex.ru, https://orcid.org//0000-0002-1428-7706

    Anzhela A. Mikaelyan, postgraduate student, poppysinclair8@ gmail.com, https://orcid.org//0000-0002-5527-5752

    Oleg S. Komarov, D.Bi.Sci., Professor, komolsam@mail.ru, https://orcid.org//0000-0002-1685-8832

    Alla E. Gurina, MD, doctoral student, allagurina@yandex.ru, https://orcid.org//0000-0002-6562-9964

    Вклад авторов в работу

    Н.П. Микаелян: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    А.В. Шестопалов: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    А.А. Микаелян: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, постановка эксперимента, статистическая обработка данных, написание текста.

    О.С. Комаров: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных.

    А.Е. Гурина: сбор, анализ и обработка материала, постановка эксперимента, статистическая обработка данных, написание текста.

    Author's contribution

    N.P. Mikaelyan: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of the material, statistical data processing, writing, editing, final approval of the version to be published.

    A.V. Shestopalov: significant contribution to the concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.

    A.A. Mikaelyan: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis, and processing of the material, conducting the experiment, statistical data processing, writing.

    O.S. Komarov: collection, analysis and processing of the material, statistical data processing.

    A.E. Gurina: collection, analysis, and processing of the material, conducting the experiment, statistical data processing, writing.

    Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторе.

    Авторство: Все авторы подтверждают, что они соответствуют действующим критериям авторства ICMJE.

    Согласие пациента на публикацию: Экспериментальное исследование проводилось только на животных, пациенты к работе не привлекались, вследствие чего письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial, or non-profit sector.

    Authorship: All authors confirm that they meet the current ICMJE authorship criteria.

    Patient consent for publication: The experimental study was conducted only on animals, patients were not involved in the work, so no written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: There is no conflict of interest.

    Поступила 29.04.2022

    Переработана: 28.09.2022

    Принята к печати: 18.10.2022

    Originally received: 29.04.2022.

    Final revision: 28.09.2022

    Accepted: 18.10.2022