Крысы линии Campbell — экспериментальная модель животного с пигментной дегенерацией сетчатки. Существует множество экспериментальных моделей животных с пигментной дегенерацией сетчатки, в том числе линии собак, кошек, кур, свиней, мышей и крыс. Разнообразие моделей связано с разнообразием генетических форм заболевания [3, 4, 7].
Существующие методы лечения этой патологии на сегодняшний день недостаточно эффективны и требуют поиска новых подходов [6, 8].
Дальнейшие перспективы лечения заболеваний сетчатки с использованием клеточных технологий во многом обусловлены активным изучением стволовых клеток. Целью трансплантаций стволовых клеток является: стимуляция собственных стволовых клеток организма и усиление репаративной регенерации. Будучи трансплантированными, стволовые клетки способны встраиваться и дифференцироваться в зависимости от микроокружения [5, 6, 8].
Рис. 2. Срезы сетчатки нормальной крысы в возрасте 1 мес. Окраска бинсбензимидом и на рековерин
Рис. 3. Срезы сетчатки крыс линии Campdell на 25-й день постнатального развития. Окраска бинсбензимидом и на рековерин
Цель работы изучить влияние различных типов стволовых/прогениторных клеток (ретинального пигментного эпителия, нейрональных стволовых клеток и клеток цилиарного тела) при супрахориоидальном способе их введения на функциональное состояние и степень выраженности дегенеративных изменений сетчатки у крыс линии Campbell.
Материал и методы
Работа проводилась на 38 крысах (76 глаз) линии Campbell.
1-я часть работы включала изучение морфофункционального состояния
сетчатки у крыс линии Campbell в период постнатального развития, использовано 8 животных (16 глаз).
2-я часть работы включала изучение влияния различных типов стволовых/прогениторных клеток на морфофункциональное состояние сетчатки у крыс линии Campbell, использовано 30 животных (60 глаз). Это исследование включало 3 серии экспериментов, в которых в опытный глаз супрахориоидально вводили различные типы клеток в количестве 300 000 в 2 мкл среды (что является эффективной дозой для выбранного нами способа введения, которая была определена в серии предварительных исследований).
Рис. 4. Срезы сетчатки крыс линии Campbell на 34-й день постнатального развития. Окраска бинсбензимидом и на рековерин
Рис. 5. Срезы сетчатки крыс линии Campdell на 60-й день постнатального развития. Окраска бинсбензимидом и на рековерин
Во второй серии, включавшей 8 животных, вводили нейрональные клетки.
В третьей серии эксперимента, включавшей 10 животных, вводили клетки цилиарного тела.
В контрольный глаз вводился такой же объем сбалансированного физиологического раствора.
Перед началом введения клеточного материала всем животным давали наркоз. Методика проведения наркоза предварительно была отработана на нелинейных крысах в возрасте 25-30 дней, затем адаптирована по отношению к животным линии Campbell.
Для безопасного супрахориоидального введения клеточного материала и обеспечения точности его дозирования было использовано специальное оборудование штатив для фиксации животного и система для введения материала, которая состояла из шприца «Hamilton» (серия 750LT), иглы калибра 29G и канюли для супрахориоидального введения; шприц фиксировался в установке с микровинтом, позволяющим медленно и точно вводить необходимый объем клеточного материала. Голову животного фиксировали за основание носа так, что при необходимости было возможно осуществить ее поворот в ту или иную сторону. Специальные распорки, расположенные на штативе для фиксации, служили векорасширителями. На конъюнктиву накладывали два параллельных шва-держалки, обеспечивающих доступ к зоне инъекции и стабилизацию глазного яблока. Производили разрез конъюнктивы между швами. Иглой делали косой надрез склеры, в который помещалась канюля для супрахориоидального введения. Постепенно вращая микровинт и обеспечивая тем самым введение клеточной суспензии, медленно продвигали канюлю по направлению к зрительному нерву (рис. 1). Когда суспензия заканчивалась, канюлю медленно извлекали, вводя небольшое количество воздуха. Он не позволял введенной клеточной массе выйти под давлением через склеральный разрез. Благодаря косому входу края склерального разреза плотно смыкались, что не требовало наложения шва. После удаления швов-держалок накладывали швы на конъюнктиву 10:0. Производили инстилляции витабакта и индоколлира и подкожные инъекции дексазона.
Электроретинография
Регистрация ЭРГ производилась с помощью роговичного контактного электрода; референтный электрод при этом размещался подкожно на загривке у животного. Для количественной оценки интенсивности ответа производился анализ максимальной амплитуды b-волны ЭРГ. Другие компоненты ЭРГ (a-волна и off-ответ) в исследовании не учитывались в связи с тем, что, во-первых, они слабо выражены у данных экспериментальных животных и, во-вторых, при развитии дегенеративных изменений в сетчатке в постнатальном периоде у этих животных наблюдается пропорциональное уменьшение волн ЭРГ.
Морфологический анализ
Срезы толщиной 20 мкм изготавливались на криотоме, монтировались на предметном стекле и окрашивались иммуногистохимически на рековерин; в качестве фонового окрашивания использовалась окраска ядер с помощью бисбензимида. Измерение толщины наружного ядерного слоя (ONL-outer nuclear layer) проводилось на флуоресцентных микрофотографиях окрашенных срезов, сделанных в свете флуоресценции бисбензимида. Параллельные микрофотографии в свете флуоресценции рековерина использовались для верификации границ наружного ядерного слоя при сильной степени дегенерации.
Результаты и обсуждение
При исследовании срезов сетчатки животных линии Campbell было выявлено, что уже на 25-й день постнатального периода в наружном ядерном слое развиваются дегенеративные изменения появляются очаги дегенерации, не содержащие живых клеток (пустоты), толщина слоя уменьшается на 20-30% (рис. 2, 3), к 34-м суткам более чем на 50% (рис. 4), к 60-м на 80-90% и теряет свою непрерывность (рис. 5).
На основании полученных данных был определен оптимальный срок для введения клеточного материала 19-20-й день жизни животного (глаза открываются к концу второй недели).
По данным электроретинографии, на 34-й день постнатального развития амплитуда b-волны в опыте при введении клеток пигментного эпителия составляла в среднем 36,6% от нормы, при введнии нейрональных клеток 12,3% и при введении клеток цилиарного тела 7,6%.
Средняя амплитуда b-волны ЭРГ на контрольных глазах составляла при введении клеток пигментного эпителия 20,7% , нейрональных клеток - 6,75%, клеток цилиарного тела 7,3% (рис. 6).
Рис. 8. Микрофотографии срезов сетчатки крыс линии Campbell после введения клеток ретинального пигментного эпителия
Рис. 9. Микрофотографии срезов сетчатки крыс линии Campbell после введения нейрональных стволовых клеток
По результатам морфологических исследований, на 34-й день постнатального развития в опыте средняя толщина наружного ядерного слоя при введении клеток ретинального пигментного эпителия составила 31,6 мкм, при введении нейрональных клеток 29,7 мкм, при введении клеток цилиарного тела 26,2 мкм.
В контроле в парных глазах: при введении клеток ретинального пигментного эпителия толщина наружного ядерного слоя составила 29,6 мкм, при введении нейрональных клеток 25,5 мкм, при введении клеток цилиарного тела 24,7 мкм (рис. 7, 9)
Таким образом, клетки ретинального пигментного эпителия при супрахориоидальном способе введения оказывают выраженное стабилизирующее влияние на процессы, развивающиеся в наружном ядерном слое сетчатки крыс линии Campbell.
Заключение
Установлено, что нейрональные клетки и клетки ретинального пигментного эпителия при супрахориоидальном способе их введения на 19-й день постнатального развития в количестве 300 000 клеток в 2 мкл среды оказывают выраженное положительное влияние на функциональное состояние сетчатки крыс линии Campbell к 34-му дню постнатального развития, причем клетки пигментного эпителия оказывают более выраженный эффект. Клетки цилиарного тела оказывают слабоположительное влияние.
На основании результатов морфологического исследования толщины наружного ядерного слоя сетчатки крыс линии Campbell установлено, что все три типа стволовых/прогениторных клеток оказывают стабилизирующее влияние на процессы дегенерации сетчатки. Наиболее выраженный эффект проявляется при введении клеток ретинального пигментного эпителия, а наименее выраженный — при введении клеток цилиарного тела.
Выявлено, что введение стволовых/прогениторных клеток в супрахориоидальное пространство опытного глаза замедляет развитие процессов дегенерации парного глаза, что, возможно, связано со стимуляцией продукции факторов роста и активацией эндогенных стволовых клеток.
