Рис. 1. Сравнительная сканирующая электронная микроскопия центрального отдела сетчатки в норме (А) и после воздействия коллагеназы (B). Фотографии произведены с одинаковым увеличением: а) макулярная область сетчатки в норме. Поверхность ВПМ покрыта сплошным тонким слоем эпиретинального СТ, под которым непосредственно сама ВПМ не просматривается. Слой эпиретинального СТ имеет менее плотную «упаковку» волокон СТ и их разрежение в области центральной ямки. Центральная ямка указана стрелкой; b) парамакулярная область сетчатки после воздействия коллагеназы. Под воздействием коллагеназы произошло неполное растворение эпиретинального СТ. Эпиретинальный слой СТ дезорганизован и большей частью отсутствует, произошло обнажение ВПМ. На поверхности ВПМ (на фотографии обозначена буквами «ВПМ») сохранились отдельные разреженные локусы остатков эпиретинального СТ. На поверхности обнажившейся ВПМ видны отдельные эритроциты. В верхнем правом углу фотографии представлен для сравнения фрагмент интактной нормальной ВПМ с аналогичным увеличением
Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия центрального отдела сетчатки в норме (фото а, с) и после воздействия коллагеназы (фото b, d). Фотография произведена тех же областей сетчатки, что показаны на рис. 1, но с последующим возрастающим увеличением. Прямоугольниками выделены области последующего увеличения. Фото а, с – центральная область сетчатки, покрытая эпиретинальным СТ в норме. Фотографии выполнены с возрастающим увеличением. Прямоугольником на фотографии выделена область, увеличенная на фото с. Определяется слой эпиретинального СТ, покрывающий ВПМ и состоящий из плотно «упакованных» волокон СТ (фото а). Более толстые и рыхло «упакованные» волокна эпиретинального СТ имеют вид «жемчужных нитей» и располагаются поверх существенно более тонких и плотно «упакованных» волокон (фото с). Фото в, д – центральная область сетчатки после воздействия коллагеназы. Фотографии выполнены с возрастающим увеличением. Прямоугольником на фото в выделена область, увеличенная на фото d. В верхнем правом углу фото b, d приведены фрагменты интактной ВПМ с аналогичным основному фото увеличением. В верхней левой части на фото в – остатки эпиретинального СТ после воздействия коллагеназы. Эпиретинальное СТ утратило волокнистую и приобрело пористую «творожистую» структуру, через которую стала видна ВПМ. Под воздействием коллагеназы в ВПМ образовалось множество «пор» – результат частичного растворения ВПМ под воздействием коллагеназы
Коллагеназа – фермент, обладающий узкой специфической направленностью по отношению к коллагену. Нерастворимый коллаген расщепляется на две растворимые части в пропорции 1:3 к первоначальному размеру целой молекулы [8]. В дальнейшем фрагменты молекул коллагена денатурируются с помощью той же коллагеназы или другими тканевыми протеиназами до мельчайших пептидов [1].
Интравитреальное введение коллагеназы впервые применено Даниличевым В.Ф. в 1996 г. для ускорения рассасывания гемофтальма [1]. В хирургическом лечении отслойки сетчатки коллагеназа применяется с 2001 г. [3]. В 2006 г. предоперационное интравитреальное введение коллагеназы стало использоваться в хирургическом лечении пациентов с сахарным диабетом [2]. В 2010 г. продемонстрирована возможность применения коллагеназы в хирургическом лечении макулярных отверстий [6].
В основном работы по применению коллагеназы носят практический характер. Имеются единичные экспериментальные исследования по морфологическим изменениям внутриглазных структур после применения коллагеназы [7, 4]. Таким образом, актуальным является дальнейшее изучение воздействия коллагеназы на внутриглазные структуры.
Цель
Исследование потенциального воздействия бактериальной коллагеназы на эпиретинальные структуры и внутреннюю пограничную мембрану (ВПМ).
Материал и методы
Экспериментальные исследования произведены на донорских глазах человека, предоставленных глазным банком Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» под руководством докт. мед. наук Борзенка С.А. Предварительно из донорских глаз была забрана роговица для пересадки.
Для оценки воздействия коллагеназы применена сканирующая электронная микроскопия. Изучение произведено сканирующим электронным микроскопом Cam Scan S-2 (Cambridge Instruments, Великобритания). Исследования выполнены в общефакультетской лаборатории электронной микроскопии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (МГУ им. М.В. Ломоносова). Заведующий лабораторией Давидович Г.Н. Морфометрия выполнялась с использованием масштабного маркера, который изменяет свою длину в процессе компьютерного увеличения.
Основная задача эксперимента состояла в определении принципиальной возможности возникновения микроанатомических изменений в эпиретинальных структурах и ВПМ после воздействия коллагеназы и определении характера этих изменений.
Для исследования воздействия коллагеназы производилось анатомирование двух глаз от одного донора для приготовления двух препаратов. Предварительно выделялось стекловидное тело (СТ) единым блоком и производилась последующая круговая резекцией заднего полюса глаза с формированием препарата, включающего область диска зрительного нерва, макулярную и парамакулярную области. Один из приготовленных препаратов использовался в качестве контроля, препарат парного глаза подвергался воздействию коллагеназы. Приготовленный блок помещался в раствор коллагеназы при 37° С, содержащий 100 КЕ коллагеназы на 1 мл и помещался в термостат с температурой 37° С на один час. Контрольный и исследуемый препараты фиксировались в растворе глутаральдегида, производилась последующая дегидратация в спиртах восходящей концентрации с последующим высушиванием и напылением на их поверхность золота для последующего проведения сканирующей электронной микроскопии. Для исследования именно микроанатомических изменений был выбран метод сканирующей электронной микроскопии. В отличие от трансмиссионной электронной микроскопии, с помощью которой возможно исследовать объект размером 1,5-3 мм (1500-3000 мкм) в плоском срезе, но с максимальным увеличением, сканирующая электронная микроскопия позволяет получить меньшее увеличение, по сравнению с трансмиссионной электронной микроскопией. Качественное изображение объекта может быть получено с разрешением 0,5-0,2 Мкм. Вместе с тем возможно проведение одномоментного исследования объекта диаметром 3,5 см (35000 мкм). Кроме этого, сканирующая электронная микроскопия обладает чрезвычайно большой глубиной резкости 0,6-0,8 мм (600-800 мкм). При этом производится сканирование исследуемой поверхности объекта, что позволяет получать микрофотографии с характерным трехмерным эффектом для объектов со сложным рельефом. Возможность получения сканов большой глубины резкости с больших площадей исследуемой поверхности делает сканирующую электронную микроскопию идеальным инструментом исследования микроанатомических взаимоотношений. Настоящее исследование полностью выполнено автором данной работы.
Результаты
В контрольном препарате, после удаления основного СТ, на поверхности сетчатки остался тонкий слой эпиретинального СТ. Эпиретинальное СТ состоит из плотно переплетенных волокон полностью покрывающих ВПМ. Под слоем эпиретинального СТ ВПМ не просматривается (рис. 1а, 2а, с). Эпиретинальное СТ имеет свою структурную особенность: поверхностный слой, обращенный в сторону витреальной полости, образован волокнами существенно большего диаметра, в сравнении с волокнами в нижележащем слое. Поверхностные волокна существенно менее плотно упакованы и имеют характерный вид «жемчужных нитей» и толщину около 0,25 мкм (рис. 2а, с). Над макулярной областью эпиретинальный слой СТ имеет очевидное разрежение в сравнении с близлежащей парамакулярной областью (рис. 1а), макулярная область указана стрелкой. В исследуемом препарате наблюдается очевидный эффект воздействия коллагеназы на эпиретинальное СТ. Под воздействием фермента произошло неполное растворение эпиретинального СТ. Мембраноподобный монослой эпиретинального СТ полностью утратил свою первоначальную структуру. Произошла его полная микроанатомическая дезорганизация. Выявлено субтотальное обнажение поверхности ВПМ. Остатки эпиретинального СТ представляют собой участки локально агрегированного детрита в виде отдельных неплотно организованных фрагментов без признаков какой бы то ни было первоначальной структурной микроанатомической организации(рис. 1в). Под воздействием коллагеназы эпиретинальное СТ приобретает «творожистую» структуру (рис. 2в – верхняя левая часть фото).
Кроме воздействия на эпиретинальное СТ выявлен эффект воздействия коллагеназы непосредственно на ВПМ. Обнаружено образование микродефектов в поверхности ВПМ(рис. 2b, d), что может быть признаком частичного растворения поверхностных коллагеновых структур, образующих ВПМ. Выявлен эффект «расползания» поверхностного слоя ВПМ и образование в нем множественных дефектов – «пор». Размер их колеблется от 0,1 до 0,7 мкм.
В результате ферментной деструкции нарушается волокнистая организация в сравнении с нормальным эпиретинальным СТ, представленным на рис. 1a. В результате ферментного воздействия на поверхности ВПМ появилось множество дефектов неправильной формы. Максимальный размер отверстия 0,8 мкм (рис. 2b, d). Видны очевидные различия между интактной ВПМ и поверхностной структурой ВПМ, подвергшейся воздействию коллагеназы. Под воздействием коллагеназы в результате частичного растворения ВПМ в последней образовались множественные отверстия.
Обсуждение
После удаления основного СТ в процессе препарирования донорского глаза человека на поверхности сетчатки остается тонкий слой эпиретинального СТ. Полученные данные согласуются с многочисленными практическими интраоперационными наблюдениями, при которых в ходе хирургического вмешательства, после отделения стекловидного тела от поверхности сетчатки и его последующего удаления, на поверхности сетчатки регистрируется так называемое резидуальное (остаточное) СТ. Таким образом тонкий эпиретинальный слой стекловидного тела имеет очевидно более прочную механическую связь с поверхностью сетчатки, нежели с кортикальным слоем основного СТ. В этой связи, возможно, имеет смысл введения дополнительного анатомического определения в анатомии СТ – «эпиретинальное СТ». Эпиретинальное СТ имеет свою специфическую структуру. Поверхностный слой, обращенный в сторону витреальной полости, образован волокнами существенно большего диаметра, в сравнении с волокнами в нижележащем слое. Эти волокна существенно менее плотно организованы и имеют характерный вид «жемчужных нитей» и толщину около 0,25 мкм. Нижележащие волокна СТ (расположенные ближе к поверхности ВПМ) имеют существенно меньшую толщину и гораздо более высокую плотность организации. Над макулярной областью эпиретинальный слой СТ имеет очевидное разрежение в сравнении с близлежащей парамакулярной областью. Следует обратить внимание на то, что отделение основного кортикального стекловидного тела в процессе препарирования происходит по границе слоя эпиретинального СТ, образованного толстыми и менее плотно организованными волокнами СТ, имеющими вид «жемчужных нитей». Коллагеназа оказывает очевидное воздействие на эпиретинальные структуры – эпиретинальное СТ и ВПМ. Выявлены очевидные различия в степени воздействия коллагеназы на поверхностный слой эпиретинального СТ и ВПМ. Эпиретинальное СТ в существенно большей мере подвержено воздействию коллагеназы. Под ее воздействием происходит растворение и полная дезорганизация монослоя эпиретинального СТ. Существенно меньшие микроанатомические изменения происходят под воздействием коллагеназы с ВПМ. Изменения, возникающие в ВПМ, указывают только на поверхностное воздействие коллагеназы, в результате чего ее общая анатомическая микроструктура ВПМ не изменяется, но в ее поверхности возникают микродефекты – «поры». Возможно образование «пор» в ВПМ под воздействием коллагеназы связано с ее биомеханическими особенностями. Коллагеновые волокна, образующие ВПМ, имеют гораздо более плотную организацию, и, соответственно, ВПМ обладает существенно большей прочностью в сравнении со структурной прочностью слоя эпиретинального СТ. Воздействие коллагеназы приводит к снижению прочности поверхностных слоев ВПМ, при сохранении прочности ниже лежащих, в результате чего возникают множественные тангенциальные силы (возможно аналогичные тангенциальным тракциям, вызывающим макулярные отверстия), под воздействием которых происходит формирование множественных дефектов – «пор» в ВПМ. Различия в степени воздействия коллагеназы на эпиретинальный слой СТ и на ВПМ дают основания высказать тезис о том, что интенсивность ферментного воздействия зависит от степени плотности организации коллагеновых волокон объекта воздействия. Чем менее плотно упакованы коллагеновые волокна в тканимишени (слой эпиретинального СТ), тем более выраженное воздействие оказывает коллагеназа. При более плотной упаковке коллагеновых волокон в ткани-мишени (ВПМ образована чрезвычайно плотно организованными коллагеновыми волокнами) интенсивность воздействия коллагеназы снижается. Таким образом выявляется зависимость между протеолитическим эффектом фермента и плотностью организации коллагеновых волокон в ткани-мишени.
Заключение
Результаты экспериментальных исследований демонстрируют очевидную допустимость использования коллагеназы для растворения эпиретинального СТ и возможной частичной деструкции ВПМ в клинической практике. Необходимо формирование более четкого анатомического определения в отношении так называемого резидуального СТ и возможное введение дополнительного анатомического определения «Эпиретинальное стекловидное тело».
Сведения об авторе:
Лыскин Павел Владимирович – канд. мед. наук, врач-офтальмолог отдела витреоретинальной хирургии и диабета глаза ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФ
