Рис. 1. Первичная культура колониеобразующих фибробластоподобных клеток, выделенных из кадаверной ретробульбарной жировой ткани
Рис. 2. Первичная культура колониеобразующих фибробластоподобных клеток, выделенных из орбитальной жировой ткани, полученной при резекции леватора
Авторы использовали преимущественно орбитальную жировую клетчатку из верхних жировых пространств, удаляемую при выполнении косметической блефаропластики [4, 5] в объеме до 1,0 мл [3], однако другие фракции орбитальной жировой клетчатки также представляют интерес для изучения. Альтернативным материалом может служить кадаверная жировая ткань, о чем свидетельствует единичное упоминание о возможности выделения стволовых клеток из кадаверной подкожной жировой ткани [6]. По данным Y.Shi и соавторов, при выделении в течение 24 часов после смерти донора клетки сохраняли не только свою жизнеспособность, но и способность к направленной дифференцировке. Однако не обнаружено данных об использовании кадаверной жировой клетчатки орбиты для выделения стволовых клеток.
Цель
Определить материал и методику для выделения стволовых клеток из орбитальной жировой клетчатки человека для дальнейшего изучения и использования в регенеративной медицине и реконструктивно-пластической хирургии.
Материал и методы
Использовали кадаверную ретробульбарную жировую клетчатку от 11 доноров в возрасте 41-73 лет, предоставленную Глазным банком «МНТК «Микрохирургия глаза» имени акад. С.Н. Фёдорова» Минздрава России, для выделения фракции стволовых клеток. Временной интервал от момента смерти донора до начала работы с образцами ретробульбарной клетчатки в лаборатории составлял от 15 до 25 часов.
Выполняли различные пластические хирургические вмешательства в области орбиты, включая удаление глазного яблока, по показаниям и согласно общепринятым методикам. В ходе операций анализировали возможность доступа к различным порциям орбитального жира и допустимый объем его резекции.
Для последующего выделения фракции стволовых клеток резецировали орбитальную жировую ткань в объеме от 0,3 мл до 0,5 мл из различных жировых пространств в процессе следующих плановых операций: блефаропластика - 3, резекция леватора - 8, эвисцерация - 1, энуклеация – 1. Выделение стволовых клеток из полученных образцов проводили в сроки до 5 часов и спустя 24 часа после резекции.
Для контроля возможного негативного функционального и косметического эффекта в результате резекции жировой ткани проводили стандартное офтальмологическое обследование, дополненное экзофтальмометрией, до и после операции.
Выделение стволовых клеток из орбитальной жировой клетчатки человека проводили на базе Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» имени акад. С.Н. Фёдорова» Минздрава России с использованием следующей методики. Образец жировой ткани выдерживали в течение 2 часов в физиологическом растворе с добавлением смеси антибиотиков (пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл; MPBiomedicals, LLC, США). Все последующие этапы проводили в ламинарном боксе II класса безопасности MSC-Advantage (Scientific Technologies, Германия). Жировую ткань измельчали ножницами на фрагменты диаметром 1-2 мм. Полученную массу заливали раствором коллагеназы второго типа (MPBiomedicals, LLC, США) типа в сбалансированном растворе Хенкса (ПанЭко, Россия), в соотношении 1мг/мл на 1 г жировой ткани. Инкубировали в течение 60 минут при температуре 370С при постоянном помешивании в шейкере (Asys Thermostar, Biochrom, Ltd, Великобритания) при температуре 370С. После этого полученную кашицу переливали в пластиковую центрифужную пробирку, добавляли 5 мл DMEM/F12 (полная ростовая среда Игла в модификации Дульбекко и среда Хэма F12 в соотношении 1:1 по объему, ПанЭко, Россия) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Thermo Scientific, США) и центрифугировали в лабораторной центрифуге SL-40 R (Thermo Scientific, Германия) при 1000 об/мин в течение 5 минут. После этого верхнюю фракцию собирали и переносили в культуральный флакон, а среднюю удаляли из пробирки. Осадок ресуспендировали полной культуральной средой и переносили в тот же культуральный флакон, заливали DMEM/F12 с добавлением 2 ммоль L-глутамина (ПанЭко, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки и смеси антибиотиков (пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл; MPBiomedicals, LLC, США). Смену среды проводили на вторые сутки (при этом удалялись осевшие эритроциты и другие клетки стромально-сосудистой фракции, а также фрагменты жировой ткани), далее среду меняли каждые 3-4 дня.
Результаты
При работе с кадаверной ретробульбарной жировой клетчаткой получить фракцию колониеобразующих фибробластоподобных клеток удалось только в одном случае из 11 (рис. 1). Это и определило необходимость поиска альтернативного материала для выделения стволовых клеток орбитальной жировой ткани. С этой целью были определены операции, в ходе которых возможен доступ к различным порциям орбитальной жировой клетчатки. При блефаропластике верхних век и резекции леватора возможен забор жировой клетчатки в верхнем медиальном (между сухожилием верхней косой мышцы и медиальной связкой), верхнем среднем (между краем орбиты и верхней поверхностью мышцы, поднимающей верхнее веко) и верхнем латеральном (латеральнее места прикрепления верхней прямой мышцы глазного яблока) пространствах. При блефаропластике на нижних веках доступна орбитальная жировая клетчатка в нижнем медиальном (между медиальной связкой глаза и началом нижней косой мышцы), нижнем среднем (между нижней косой мышцей глаза и дном орбиты) и нижнем наружном (между наружной щечной связкой и фасциальной растяжкой нижней прямой мышцы, идущей к наружной связке век) жировых пространствах. Ретробульбарный жир вершины мышечной воронки хорошо доступен при эвисцероэнуклеации и энуклеации.
При всех перечисленных операциях, по данным стандартного офтальмологического обследования и экзофтальмометрии, возможна резекция жировой ткани в суммарном объеме до 0,5 мл без развития асимметрии и других негативных последствий для органа зрения.
С помощью описанной методики из всех резецированных фрагментов орбитальной жировой клетчатки удалось выделить фракцию колониеобразующих фибробластоподобных клеток (рис. 2). При сохранении образцов жировой ткани в физиологическом растворе со смесью антибиотиков при температуре +4 0C в течение 5 часов после резекции клетки были выделены из всех 11 образцов. Спустя сутки, при тех же условиях хранения, выделить интересующие нас клетки не удалось.
Заключение
Кадаверная ретробульбарная жировая ткань не представляется перспективным материалом для выделения фракции стволовых клеток, учитывая возраст доноров, сроки доставки материала в Глазной банк и отсутствие стабильного результата. Орбитальная жировая ткань человека, полученная интраоперационно, является оптимальным материалом для выделения стволовых клеток. При косметической блефаропластике, резекции леватора, энуклеации, эвисцероэнуклеации возможен доступ к различным порциям орбитальной жировой клетчатки. Резекция любой порции орбитального жира в объеме до 0,5 мл не сопровождается развитием негативных функционально-эстетических последствий для пациентов.
Указанный протокол выделения стволовых клеток позволяет получить фракцию колониеобразующих фибробластоподобных клеток из всех фракций орбитальной жировой клетчатки человека, полученной интраоперационно.