Рис. 1. Анализ 3 экзона гена миоцилина у пациентов с ПОУГ из Башкортостана: I – SSCP анализ участка 3 экзона гена миоцилина в образцах ДНК пациентов с ПОУГ: А – дорожки 1,3,4 – образцы с нормальной подвижностью, дорожка 2 – образец с измененной подвижностью; Б – дорожки 1, 2, 4, 5, 6 – образцы с нормальной подвижностью, дорожка 3 – образец ДНК с измененной подвижностью; II – сиквенс образцов ДНК с конформационным полиморфизмом: А' – сиквенс образца ДНК 2 дорожки; Б' – сиквенс образца ДНК 3 дорожки
Рис. 2. ПДРФ анализ 3 экзона гена миоцилина: 1 – образец ДНК не подвергшийся рестрикции ферментом TaaI (контроль); 2 – образец ДНК, содержащий мутацию Q368X в гетерозиготном состоянии
Значительная доля случаев первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ) генетически обусловлена и составляет, по данным различных авторов, от 21 до 50% [9]. ПОУГ относится к группе заболеваний с наследственной предрасположенностью, развитие которых определяется взаимодействием определенных наследственных и средовых факторов [2].
Сложно выявление ранних признаков, которые предшествуют клинической манифестации ПОУГ. Диагностика глаукомы основывается на оценке совокупности симптомов, так как ни один из них не является специфичным, а существующие диагностические тесты – достаточно чувствительными [3, 4], в связи с чем изучение методов ранней диагностики ПОУГ на доклинической стадии представляет актуальную задачу.
Около 10% случаев глаукомы взрослых обусловлено наследуемыми мутациями в генах миоцилина (MYOC/TIGR) [16] и гена цитохрома P 450 (CYP1B1) [13]. Кодируемые этими локусами белки миоцилин и одна из белковых фракций цитохрома Р450 важны для нормального функционирования обменных процессов переднего отдела глаза, однако их роль в патогенезе глаукомы до настоящего времени не вполне ясна [1]. Идентификация мутаций в этих генах позволяет выявлять лица с высоким риском развития глаукомы и своевременно начинать лечение. Спектр описанных мутаций является специфичным для отдельных популяций и этнических групп [6, 11], что делает невозможным в целях диагностики опираться на данные, полученные в других регионах. Подобных исследований в Республике Башкортостан ранее не проводилось.
Цель
Исследование спектра и частоты изменений нуклеотидной последовательности генов миоцилина и цитохрома Р450 у больных ПОУГ из Республики Башкортостан и определение диагностического значения выявленных изменений.
Материал и методы
Всего было обследовано 257 чел., в т.ч. 138 пациентов с ПОУГ, 39 членов их семей и 80 чел. группы контроля.
Все пациенты были разделены на 2 группы. Первую группу составили 37 пациентов с ПОУГ с предположительно наследственной этиологией. В эту группу включали больных, если в родословной имелось хотя бы два случая ПОУГ при степени родства не менее 50%. Вторую группу (101 больной), составили пациенты с ПОУГ без отягощенного семейного анамнеза. Контрольную группу составили 80 человек в возрасте 70-80 лет с неосложненной возрастной катарактой без признаков глаукомы. Среди пациентов с ПОУГ мужчин было 85 (61,6%), женщин – 53 (38,4%) в возрасте от 31 до 82 лет. Офтальмологическое обследование проводилось при помощи общепринятых методов.
Молекулярно-генетическое исследование, включающее выделение геномной ДНК [12], амплификацию исследуемых участков генов методом полимеразной цепной реакции [1], анализ конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-анализ) [14], секвенирование проводилось совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.
Был проведен SSCP-анализ 1,2,3 экзонов гена миоцилина, скрининг мутации Q368X в гене миоцилина и мутации R368H в гене цитохрома Р 450 в 257 образцах ДНК. Для анализа гена миоцилина произведен подбор праймеров для избирательной амплификации экзонных последовательностей данных генов. Первичная последовательность (сиквенс) гена была получена из базы генетических последовательностей GenBank® Национального Института Здоровья, США (National Institute of Health). Идентификационный номер сиквенса NM_000261.
Были проанализированы те участки генов, где по литературным данным было выявлено наибольшее количество мутаций и которые были ассоциированы с клинической формой первичной открытоугольной глаукомы [10]. В качестве основного метода поиска мутаций был использован метод SSCP, преимуществом которого является его простота и достаточно высокая чувствительность [15]. В образцах ДНК пациентов с конформационными полиморфизмами определяли последовательность нуклеотидов с помощью секвенирования.
Результаты и обсуждение
SSCP-анализ 1 и 2 экзонов гена миоцилина не выявил изменений подвижности одноцепочечной ДНК в нашей выборке. В экзоне 3 гена миоцилина наблюдались два изменения подвижности одноцепочечной ДНК у двух пациентов с семейным анамнезом ПОУГ. Однако последующий секвенционный анализ не выявил каких-либо изменений в нуклеотидной последовательности ни в самом экзоне, ни в прилегающих к нему интронных областях (рис. 1).
При молекулярно-генетическом исследовании образцов ДНК больных нашей выборки в третьем экзоне гена миоцилина у одного пациента с ПОУГ обнаружена нонсенс-мутация – Q368X (с.1102С>Т). Наличие мутации Q368X было подтверждено ферментативным гидролизом эндонуклеазой TaaI (рис. 2).
Пациент – 50 лет, башкир по этнической принадлежности, с семейным анамнезом заболевания. Впервые обратился за помощью к офтальмологу по месту жительства в январе 2006 г., после того как ослеп левый глаз. Установлен диагноз: OU – Открытоугольная глаукома IV C. Острота зрения OD p.l.incerta; OS – 0. Постепенное снижение зрения отмечает в течение нескольких последних лет. К офтальмологам не обращался. Брат пробанда, 54 лет, ослеп на оба глаза в возрасте 48 лет вследствие глаукомы.
На мутацию Q368X приходится 40% от всех найденных в мире. При мутации Q368X в 1102 положении происходит замена цитозина на тимин и образование стоп-кодона, результатом которого является синтез укороченного белка. Синтезируемый с мутантной м-РНК протеин содержит 367 аминокислотных остатков вместо 504 и белок оказывается лишенным значительной части ольфактомедин-подобного домена, необходимого для нормального функционирования миоцилина. Мутантный белок становится нерастворимым, накапливается внутри клеток трабекулярной сети, вызывая их дистрофические изменения и последующую гибель посредством апоптоза. Следствием этих процессов является увеличение сопротивления оттоку внутриглазной жидкости и повышение внутриглазного давления [10, 12].
Таким образом, частота мутации Q368X, выявленная у больных ПОУГ из Башкортостана, составляет 0,004 и не отличается от данных полученных, при исследовании других популяций [10].
Ген цитохрома 450, картированный в 1996 г. [17], содержит 3 экзона и 2 интрона, из которых только экзоны 2 и 3 кодируют мультифункциональный фермент – цитохром Р450, относящийся к классу монооксигеназ, участвующий в создании новых функциональных групп (-OH, -NH2, -COOH) в сложных органических молекулах многих органов и тканей [8, 16]. Предполагается, что ген цитохрома Р450 может действовать как модификатор гена миоцилина [7].
В 2002 г. была идентифицирована мутация R368H гена цитохрома Р450, которая в гетерозиготном состоянии в сочетании с различными мутациями в гене миоцилина является причиной возникновения ПОУГ, причем манифестация заболевания происходит в конце первой – начале второй декады жизни [18]. ПОУГ, вызванная мутацией R368H, характеризуется более тяжелым течением (ранее начало заболевания, быстрое прогрессирование). Механизм действия данной мутации связан с конформационными изменениями четвертичной структуры молекулы цитохрома Р4501В1, и как следствие, со снижением активности фермента [19]. При мутации R368H происходит потеря сайта для рестриктазы TaаI (рис. 3). Был проведен скрининг мутации R368H в 138 образцах ДНК больных ПОУГ, а так же их родственников и в 80 образцах ДНК группы контроля.
Не выявлена мутация гена цитохрома Р450 ни у одного из обследованных. По-видимому, причиной развития ПОУГ у обследованных больных могут быть какие-либо другие мутации в гене цитохрома Р 450.
Заключение
Выявленная частота мутации Q368X гена миоцилина указывает на целесообразность её тестирования у лиц с семейным анамнезом ПОУГ. Отсутствие выявленной мутации R368H диктует необходимость продолжения поиска мутаций в гене цитохрома Р 450, характерных для населения Республики Башкортостан. Для определения формы глаукомы необходима тесная работа офтальмолога-клинициста и врача–генетика. При обследовании пациента обязательными являются генеалогический анализ, поиск мутаций при каждой клинической форме глаукомы, что позволяет своевременно поставить клинико-генетический диагноз наследственного заболевания глаза и наметить правильное консервативное или хирургическое лечение.
