Год
2016

Разработка и экспериментальное обоснование использования интравитреального имплантата для доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глаза


Органзации: 1НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФВ оригинале: ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России



Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Общая характеристика работы


Актуальность проблемы
    Создание новых систем и средств доставки лекарственных веществ (ЛВ) имеет важное значение для решения основных проблем медицины -повышения терапевтической эффективности, переносимости и безопасности лекарственной терапии. При лечении заболеваний заднего сегмента глаза существует проблема создания постоянной и достаточной концентрации лекарственных препаратов в очаге поражения в связи с особенностями анатомо-физиологического строения глазного яблока и наличием сложных гистогематических барьеров (Егоров Е.А., 2009; Edelhauser H.F. et al., 2008; Ranta V. P. et al., 2010). Поэтому существующие на сегодняшний день способы введения лекарственных препаратов для лечения различных витреоретинальных заболеваний не являются оптимальными (Аксенова Г.И. и соавт., 2012; Amrite A. C. et al., 2006; Del Amo E.M. et al., 2008; Desai H. G. et al., 2008).

    При применении препаратов в виде глазных капель абсорбция ЛВ ограничивается рядом защитных механизмов: слезообразованием, дренажом ЛВ слезоотводящим аппаратом глаза, метаболизмом препарата, испарением слезы, связыванием вещества слезными белками (Gipson J.M., et al., 2015; Moosa R.M. et al., 2014; Ranta V. P. et al., 2010). В результате, внутрь глаза проникает лишь 5 % инстиллированного ЛВ (Del Amo E.M. et al., 2008).

    Транссклеральная доставка ЛВ с помощью периокулярных инъекций обеспечивает создание более высоких концентраций препарата в тканях глазного яблока по сравнению с капельным путем введения (Mark R. et al., 2011). Тем не менее при данном способе введения ЛВ не достигает терапевтического уровня в стекловидном теле (СТ) и сетчатке (Robinson M.R. et al., 2006; Gilger B. et al. 2014). Cледует отметить, что интраокулярное введение ЛВ – это единственный способ, при котором возможно создание высокой концентрации препарата в витреальной полости и окружающих тканях (Choi Y.J. et al., 2006; Fischer N. et al., 2010; Patel A. et al., 2010).

    Однако для поддержания необходимой концентрации препарата в заднем сегменте глазного яблока требуются периодические повторные инъекции, что повышает риск развития осложнений (Jager R.D. et al., 2004; Edelhauser H.F. et al., 2006; Ghate D. et al., 2006; Frederici T.J. 2009).

    На сегодняшний день, одним из наиболее актуальных направлений в офтальмологии является разработка специализированных микроинвазивных нетоксичных систем доставки ЛВ с заданными характеристиками высвобождения действующего агента для обеспечения безопасной концентрации препарата в витреальной полости (Шишкин М.М. и соавт., 2010; Lee S.S. et al., 2010; Christoforidis J. B. et al., 2012).

    Различают следующие системы для интравитреальной доставки ЛВ: наносистемы, недеградируемые и биодеградируемые имплантаты. Несмотря на многообещающие перспективы использования липосом и полимерных наночастиц, применение их ограничено в связи с трудностью дозирования выделения ЛВ в терапевтической концентрации (Jong W. H. et al., 2008; Edelhauser Н. F. et al., 2010). Существующие недеградируемые имплантаты позволяют пролонгировать интравитреальное пребывание препарата, при этом они характеризуются непрерывным выделением действующего вещества, что может приводить к превышению допустимых терапевтических значений ЛВ в витреальной полости (Saettone M.F. 2002; Gaudana R. et al., 2009; Fischer N. et al., 2010). Стоит отметить, что общим недостатком всех недеградируемых систем является необходимость их последующего удаления, что повышает риск развития послеоперационных осложнений (Jaffe G.J. et al., 2006; Del Amo E.M. et al., 2008; Choonara Y.E. et al., 2010; Patel A. et al., 2013). Биодеградируемые имплантаты, в отличие от недеградируемых, с течением времени подвергаются полной резорбции в витреальной полости и не требуют их последующего удаления (Haller J.A. et al., 2011; Querques G. et al., 2014; Patel A. et al., 2013; Campochiaro P. A. et al., 2015). Однако они также характеризуются неконтролируемым выделением лекарственного агента, что требует длительного врачебного контроля ввиду возможного развития постинъекционных осложнений, связанных с превышением допустимой концентрации препарата в витреальной полости.

    Идеальная система доставки лекарственных средств должна быть инертной, устойчивой, биорезорбируемой, комфортной для пациента, обладать способностью к высвобождению ЛВ в течение определенного периода времени в необходимом месте и требуемом количестве, обеспечивая пролонгированное действие препарата в очаге поражения без превышения терапевтической концентрации с минимальными побочными эффектами (Хлусов И.А. и соавт., 2008; Аксенова Г.И., Гордеева В.В. и соавт., 2012; Jaffe G.J. et al., 2006). В настоящее время не существует оптимальных систем доставки ЛВ, удовлетворяющих всем необходимым требованиям. Кроме того, узкие показания для использования современных интравитреальных имплантатов ограничивают их применение в офтальмологии.

    Таким образом, не вызывает сомнений актуальность разработки и усовершенствования способов доставки ЛВ к структурам заднего сегмента глазного яблока с помощью биодеградируемых устройств, представляется перспективным разработка и исследование отечественного имплантата в качестве носителя ЛВ; при этом возникает необходимость изучения его свойств, способности имплантата обеспечивать контролируемое высвобождение ЛВ с целью создания дозированной концентрации препарата в витреальной полости и снижения риска развития различных осложнений.
Цели и задачи исследования
    Цель настоящего исследования – разработка и экспериментальное обоснование способа доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глаза с помощью биодеградируемого интравитреального имплантата для пролонгации пребывания лекарственного вещества в витреальной полости.

    Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

    1. Разработать биодеградируемый интравитреальный имплантат для доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глазного яблока.

    2. Определить время полной резорбции разработанного биодеградируемого имплантата и исследовать профиль высвобождения лекарственного вещества - дексаметазона из насыщенного имплантата в эксперименте in vitro.

    3. Провести клинико-морфологическое обоснование безопасности интраокулярного введения ненасыщенного и насыщенного дексаметазоном имплантатов и определить время их полной резорбции в эксперименте in vivo.

    4. Определить профиль высвобождения дексаметазона из насыщенного имплантата в эксперименте in vivo

    5. Доказать эффективность функционирования имплантата, насыщенного дексаметазоном, в качестве контейнера лекарственных веществ на примере патофизиологической модели фотоиндуцированного тромбоза центральной вены сетчатки в эксперименте in vivo.
Научная новизна
    1. Впервые разработан многослойный биодеградируемый имплантат на основе молочной кислоты, гликозаминогликанов и поливинилпирролидона для доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глазного яблока с периодическим высвобождением действующего агента, имеющий цилиндрическую форму, длиной 4,0 мм и диаметром 0,3 мм, обеспечивающий пролонгированное интраокулярное пребывание препарата в достаточной концентрации, не превышающей терапевтических значений в течение заданного промежутка времени.

    2. Впервые на основании данных исследования структуры имплантата, оценки процесса его деградации и динамики высвобождения дексаметазона из имплантата в эксперименте in vitro был разработан способ доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глаза с помощью биодеградируемого многослойного интравитреального имплантата.

    3. Впервые определено время резорбции имплантата – 31 день, изучен профиль высвобождения дексаметазона из данной многослойной биодеградируемой конструкции имплантата и доказано, что предложенный имплантат обеспечивает периодическое выделение действующего вещества с созданием его оптимальной концентрации в течение 1 месяца.

    4. Впервые в эксперименте in vivo доказано, что интраокулярное введение ненасыщенного и насыщенного дексаметазоном имплантатов не оказывает токсического влияния на структуры глазного яблока, подтверждена периодичность выделения лекарственного агента из насыщенного биодеградируемого имплантата, обусловленная его многослойной конструкцией, и доказана способность используемой конструкции осуществлять доставку лекарственного вещества к структурам заднего сегмента глаза в течение заданного промежутка времени.

    5. Впервые в эксперименте на фотоиндуцированной модели тромбоза ветви центральной вены сетчатки была показана эффективность лечения с помощью биодеградируемого имплантата, содержащего дексаметазон в дозе 300 мкг, в качестве контейнера для доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глаза.
Практическая значимость
    1. Разработанный многослойный биодеградируемый интравитреальный имплантат обеспечивает прерывистое, пролонгированное высвобождение лекарственного вещества, что открывает широкие перспективы для повышения эффективности лечения витреоретинальных заболеваний.

    2. Разработанный способ доставки лекарственных веществ с помощью биодеградируемого многослойного имплантата обеспечивает длительное пребывание лекарственного вещества в витреальной полости в течение заданного промежутка времени, в результате постепенного его выделения, без превышения терапевтической концентрации действующего агента.

    3. Интравитреальный имплантат являться биодеградируемой системой и не требует последующей эксплантации из глазного яблока.

    4. На патофизиологической модели фотоиндуцированного тромбоза ветви центральной вены сетчатки подтверждена эффективность предложенного способа доставки лекарственных веществ с помощью интравитреального биодеградируемого насыщенного дексаметазоном имплантата, что обосновывает возможность использования его в качестве носителя (резервуара) лекарственных средств.
Основные положения, выносимые на защиту
    1. Разработанный способ доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глазного яблока с помощью многослойного биодеградируемого имплантата обеспечивает возможность пролонгированного и периодического высвобождения лекарственного вещества в безопасной и эффективной концентрации в течение заданного времени, предотвращая риск повреждения внутриглазных структур избыточной концентрацией препарата.

    2. Отсутствие клинико-морфологических изменений со стороны оболочек и внутренних сред глаза в эксперименте in vivo подтверждает безопасность интраокулярного введения биодеградируемого многослойного имплантата.
Апробация работы
    Материалы диссертации доложены и обсуждены на IX Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов « Актуальные проблемы офтальмологии» (г. Москва, 18 июня 2014 г.), на Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения региональной офтальмологии» (г. Тамбов, 10 октября 2014г.), на научно-клинической конференции ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (г. Москва, 21 ноября 2014 г.), на XIII научно-практической конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии-2015» (г. Москва, 19 марта 2015 г.), на Всероссийской научно-практической конференции «25-летие филиала Тамбов» (г. Тамбов, 22 мая 2015г.), на Joint Congress of SOE/ААО 2015 (Австрия, г. Вена, 6 июня 2015 г.), на научно-клинической конференции ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (г. Москва, 4 сентября 2015 г.).
Формы внедрения
    Результаты проведенных исследований использованы при разработке патента на изобретение, изложены в докладах на научно-практических конференциях, публикациях, кандидатской диссертации.
Реализация результатов работы
    Результаты диссертационного исследования внедрены в лекционный материал при проведении занятий со студентами, клиническими ординаторами и курсантами в научно-педагогическом центре ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.
Публикации
    По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 7 в журналах рецензируемых ВАК РФ. Подана заявка на получение патента РФ на изобретение № 2015106895 от 02.03.2015.
Объем и структура диссертации
    Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 30 рисунками, содержит три таблицы. Указатель литературы включает 182 автора, из них 31 отечественных и 151 зарубежных.

    Интравитреальный биодеградируемый многослойный имплантат разработан ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России совместно с ООО «НЭП МГ». Разработка имплантата и исследование структуры и свойств устройства проводилось при непосредственном участии Новикова С.В. (заместитель директора по производству ООО «НЭП МГ»). Экспериментальные исследования in vivo выполнены на базе Калужского филиала ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (директор – д.м.н. Терещенко А.В.) под руководством зам. директора по научной работе – д.м.н., проф. Белого Ю.А., и под руководством руководителя лаборатории клеточных и физико-химических медицинских технологий ГБУ здравоохранения города Москвы «НИИ скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы» - д.м.н. Темнова А.А.; а также на базе испытательной лаборатории доклинических исследований «БИОМИР» АНО «Институт медико-биологических исследований и технологий» при поддержке д.б.н. Перовой Н.В.

    Морфологические исследования выполнены на базе лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (зав. центром – д.м.н. С.А. Борзенок) ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, при непосредственном участии зав. лабораторией, к.м.н. Шацких А.В.

Содержание работы


Материалы и методы исследования
     Объектом исследования является имплантат, разработанный на базе ООО Научно-экспериментальное производство «Микрохирургия глаза». Имплантат представляет собой устройство цилиндрической формы, длина 4,0 мм и диаметром 0,3 мм, для имплантации в витреальную полость с помощью инструментов 27 gauge, с толщиной каждого слоя около 10 мкм, количеством слоев в имплантате - 15. Слои соединены между собой с помощью поперечных сшивок.

    В работе исследованы образцы имплантатов в двух формах: ненасыщенный и насыщенный лекарственным веществом (дексаметазон) в дозе 300 мкг. Конструкция насыщенного имплантата предусматривает чередование 8-ми насыщенных препаратом и 7-ми ненасыщенных слоев таким образом, что первый и последний слои имплантата содержат лекарственное вещество. Дексаметазон распределен в насыщенных слоях в равных количествах. Устройство имеет следующий профиль растворения слоев: насыщенный слой – 3 суток, ненасыщенный – 1 сутки.

    Проведено 3 серии экспериментов исследования биодеградируемого интравитреального имплантата.

    Исследование структуры и свойств имплантата в эксперименте in vitro

    В первой серии выполняли изучение структуры имплантата при помощи сканирующей электронной микроскопии; изучение растворимости и времени резорбции ненасыщенного имплантата, изучение профиля высвобождения дексаметазона из насыщенного имплантата in vitro.

    Для оценки морфологических особенностей имплантата, и подтверждения его слоистой структуры проведена сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) 5 образцов. Исследование выполнено на базе ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», химического факультета. Подготовку препарата выполняли методом «замораживания-скалывания», препарат изучали на электронном микроскопе JEOL JSM-6610 (JEOL Ltd., Япония) при увеличении х300, х500, х1200.

    Исследование резорбции предложенного имплантата проводилось на базе ООО Научно-экспериментальное производство «Микрохирургия глаза» в фиксированном объеме 0,9% раствора NaСl равном 5,0 мл. Исследование выполнено на 5-ти ненасыщенных имплантатах, которые помещали в герметичные пробирки, содержащие 5 мл 0,9% раствора NaСl с фосфатным буфером pH=7,4. Затем пробирки устанавливали в горизонтальный шейкер инкубатор Unimax 1010 (Heidolph, Германия) с заданной температурой 37С° и частотой встряхивания 60 об/мин. Один раз в сутки производили замену 3,0 мл жидкости из пробирки на 3,0 мл физиологического раствора с сохранением заданной температуры и ее объема в пробирке. В ходе эксперимента проводили ежедневную визуальную (макроскопическую) оценку состояния полимерного матрикса и раствора: изменение цвета, наличие осадка или взвеси, состояние тестируемого образца (форма, размеры). Массу имплантата в сухом состоянии определяли на чашке аналитических весов Ohaus Analytical plus AP210 (Ohaus, Швейцария) с ценой деления 0,0001г. Контроль резорбции имплантата производили методом взвешивания образца на 1, 7, 14, 28 сутки. Определяли массу имплантата в сухом (m0 ) и гидратированном состоянии (m1 ) в вышеуказанные сроки, вычисляли средние арифметические значения массы (г) 5-ти имплантатов, после чего строили график зависимости потери массы образцов от времени. Замер времени резорбции имплантата проводился от начала эксперимента до его полного визуального исчезновения в пробирке.

    Исследование профиля высвобождения лекарственного вещества из насыщенного имплантата проводили на 5-ти образцах. Каждый имплантат помещали в герметичную пробирку с физиологическим раствором с фосфатным буфером pH=7,4 в объеме 5,0 мл при температуре 37С°. Пробирки устанавливали в горизонтальный шейкер инкубатор Unimax 1010 (Heidolph, Германия) с заданной температурой 37С° и частотой встряхивания 60 об/мин. Один раз в сутки производили замену 3,0 мл жидкости в пробирке на аналогичный объем физиологического раствора с сохранением заданной температуры и объема жидкости в пробирке. Забор исследуемой жидкости – аликвоты, осуществляли каждый день до момента полной резорбции имплантата.

    Для определения концентрации дексаметазона аликвоту исследовали с помощью спектрофотометрии (спектрофотометр Lambda EZ 201, Perkin Elmer Corporation, США) в ультрафиолетовой области спектра электромагнитного излучения с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения для дексаметазона λmax = 242 нм. Количественное определение дексаметазона проводили методом градуировочного графика. Полученные значения концентрации дексаметазона (нг/мл) использовали для построения графика профиля высвобождения лекарственного вещества из имплантата в зависимости от времени (каждые сутки).

    Исследование биосовместимости, безопасности, биодеградации имплантата и профиля высвобождения дексаметазона in vivo

    Экспериментальные исследования были проведены на базе Калужского филиала ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Эксперимент in vivo выполнен на лабораторных животных – 55 кроликов (85 глаз) породы Шиншилла весом от 2,0 до 3,0 кг.

    Исследование включало 3 серии экспериментов: первая серия - исследования действия ненасыщенного биодеградируемого имплантата на структуры переднего и заднего сегмента глазного яблока; вторая серия опытов -исследования действия насыщенного дексаметазоном биодеградируемого имплантата на структуры переднего и заднего сегментов глазного яблока; третья серия - изучение профиля высвобождения дексаметазона из имплантата в витреальной полости глаза кролика.

    В исследования безопасности интраокулярного введения имплантатов все животные были разделены на равные группы: в первой серии эксперимента - на первую и вторую, во второй серии экспериментов - на третью и четвертую. Распределение кроликов по группам представлено в таблице 1. Сроки выведения животных из эксперимента основаны на оценке времени деградации имплантата в эксперименте in vitro и составили 1, 7, 14, 28 и 35 сутки.

    Всем кроликам в оба глаза за 30 мин до операции для поддержания максимального медикаментозного мидриаза производили инстилляцию в конъюнктивальную полость 1-2 капель 1% раствора тропикамида. В качестве местной анестезии всем кроликам инстиллировали 1% раствор алкаина и ретробульбарно вводили 1,0 мл 2% новокаина. Веки фиксировали блефаростатом, глазное яблоко – фиксационным пинцетом, захватывающим лимбальную конъюнктиву. Инъекцию в переднюю камеру выполняли на 3 часах. Производили парацентез роговицы копьевидным ножом 2,0 мм и с помощью канюли 27 gauge вводили имплантат.

    При введении имплантата в полость СТ производили прокол оболочек глазного яблока портом 27 gauge на расстоянии 2 мм от лимба в направлении к экватору в верхне-наружном квадранте. Прямую канюлю 27 gauge проводили вглубь СТ параллельно хрусталику, вводили имплантат в верхней трети полости СТ. Извлекали порт 27 gauge. После проведения хирургического вмешательства склеротомическое отверстие герметизировали без наложения шва.

    Для оценки состояния внутриглазных структур перед имплантацией и в динамике на 1, 7, 14, 28, 35 сутки наблюдения проводили офтальмологическое обследование, включающее биомикроскопию переднего отрезка глаза на щелевой лампе фирмы «Opton» (Германия), офтальмоскопию с помощью бинокулярного офтальмоскопа фирмы «Heine» (Германия), фоторегистрацию изображений глазного дна с использованием диагностической ретинальной системы «RetCam-120» (США) и электроретинографию (ЭРГ) на электродиагностической системе «Tomey» (Япония). ЭРГ проводились животным, которым было произведено интравитреальное введение насыщенных и ненасыщенных ЛВ имплантатов. После проведения вышеуказанных исследований в те же сроки животных выводили из эксперимента путем воздушной эмболии, глаза энуклеировали и выполняли морфологические исследования.

    Исследование профиля высвобождения дексаметазона из насыщенного имплантата в витреальной полости глаза кролика проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на базе испытательной лаборатории доклинических исследований «БИОМИР» АНО «Институт медико-биологических исследований и технологий».

    Данное исследование проведено на 5 кроликах (5 глаз) породы Шиншилла с массой тела 2,0-2,5 кг. Всем кроликам вводили насыщенный дексаметазоном имплантат в витреальную полость по вышеописанной методике. Забор образцов СТ проводили на 1, 3, 7, 14, 21, 28, 35 сутки с помощью инсулинового шприца с инъекционной иглой 30 gauge. Введение иглы осуществляли в 2 мм от лимба в верхне-наружном квадранте, производили забор аликвоты в объеме 0,1 мл, которую помещали в стеклянные капилляры с заглушками объемом 0,4 мл. Образцы анализировали на жидкостном хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies, США) в течение 10 минут при аналитической длине волны 239 нм. Регистрация и обработка хроматограмм выполнены с помощью программного обеспечения Chem Station (Agilent, США).

    Исследование эффективности функционирования насыщенного дексаметазоном имплантата на модели фотоиндуцированного тромбоза ветви центральной вены сетчатки глаза кролика

    Экспериментальное исследование выполнено на отработанной модели фотоиндуцированного тромбоза ветви центральной вены сетчатки (ЦВС) на 10 половозрелых кроликах-самцах (10 глаз) породы Шиншилла с исходной массой тела 2,0-2,5 кг. Для фотодинамического моделирования тромбоза использовали фотосенсибилизатор хлоринового ряда – Фотодитазин в дозе 2,5 мг/кг веса. Фотодинамическое воздействие проводили на лазерном офтальмо-микрохирургическом комплексе «Алод-Алком» («Алком-Медика», Санкт – Петербург) с длиной волны 662 нм.

    С целью поддержания максимального медикаментозного мидриаза производили инстилляцию 1-2 капель 1% раствора тропикамида в конъюнктивальную полость. Операцию осуществляли под общей анестезией, включающей внутривенные инъекции 10% гексенала из расчета 10-15 мг/кг веса животного. Иммобилизировали животных путем тугого пеленания, внутривенно вводили Фотодитазин в выше указанной дозировке. Далее транспупиллярно проводили лазерное облучение вены в месте ее выхода из диска зрительного нерва (ДЗН) через 15 минут после введения фотосенсибилизатора. Плотность энергии составила 200 Дж/см², диаметр пятна лазерного излучения – 3,0 мм.

    Кролики были разделены на 2 группы: в 1-ой группе 5 кроликов (5 глаз) осуществляли введение насыщенного дексаметазоном имплантата в дозе 300 мкг в витреальную полость; во 2-й группе 5 кроликов (5 глаз) – интравитреальную инъекцию 0,1 мл 0,4% раствора дексаметазона, что соответствует дозе 400 мкг.

    Клиническую оценку состояния глаз кроликов проводили в течение 14 дней. Методы обследования включали офтальмоскопию с помощью бинокулярного офтальмоскопа фирмы «Heine» (Германия), фоторегистрацию изображений глазного дна с использованием диагностической ретинальной системы «Ret Cam-120» (США), оптическую когерентную томографию (ОСТ) на приборе «Stratus OCT3000» (Carl Zeiss, Германия) и электроретинографию (ЭРГ) на электродиагностической системе «Tomey» (Япония).
Результаты исследований
     Результаты исследований структуры и свойств имплантата в эксперименте in vitro

    Изображения СЭМ тестируемых имплантатов показали сложную пространственную организацию их микроструктуры: слоистое строение, соединение слоев поперечными сшивками, которые образуются из полимерной матрицы в ходе технологического процесса изготовления имплантата и расположены перпендикулярно к поверхности слоев. Размер одного слоя с поперечными сшивками составил около 10 микрометров.

    В результате проведенных экспериментальных исследований было установлено, что резорбция имплантата являлась следствием деструкции его полимерного остова. В течение всего срока исследования отмечали равномерное уменьшение размеров устройства с сохранением заданной формы и постепенным закруглением его краев. Исследования контроля резорбции показали постепенное уменьшение массы тестируемых имплантатов с течением времени, к 28-м суткам она составляла – 0,3 х 10 -3 г.

    На 32-е сутки имплантаты не были обнаружены в исследуемом растворе. На протяжении всего срока исследования каких-либо изменений цвета раствора, появления осадка, взвеси не обнаружено.

    Cпектрофотометрический анализ функции имплантата в качестве контейнера лекарственного вещества на примере дексаметазона подтверждал заданные характеристики его конструкции, предусматривающие профиль высвобождения препарата в течение 3-х суток с падением концентрации к середине 4-х суток (рис. 1).

    Цикл высвобождения лекарственного вещества повторялся 8 раз.

    Спустя 31 день активный агент высвобождался полностью. На основании вышеприведенных данных была установлена закономерность высвобождения ЛВ из имплантата. Данный процесс являлся предсказуемым и точным по продолжительности высвобождения: увеличение концентрации вещества в течение 3-х суток с пиком концентрации на 3-и сутки, латентный период – 1 сутки. Это достигалось за счет оригинальной конструкции имплантата, а именно: чередования насыщенных и ненасыщенных ЛВ слоев с заданными параметрами времени резорбции каждого слоя.

    Таким образом, биодеградируемый имплантат обладал рядом преимуществ: размеры и форма имплантата предусматривали его введение с помощью инструментов калибра 27 gauge; имплантат подвергался полной резорбции, что не требовало его последующего удаления из места введения; слоистая структура имплантата с наличием поперечных сшивок и возможность чередования слоев насыщенных и ненасыщенных ЛВ предотвращала возможность превышения терапевтической концентрации действующего вещества в растворе. В отличие от существующих биодеградируемых имплантатов, которые представляют собой монолитные полимерные конструкции с гомогенным распределением действующего вещества в матрице, характеризующихся непрерывным и неконтролируемым высвобождением активного агента, разработанный имплантат предотвращал избыточное выделение ЛВ за счет своей оригинальной многослойной конструкции.

    Результаты исследования биосовместимости, безопасности, биодеградации имплантата и профиля высвобождения дексаметазона in vivo

    После введения в переднюю камеру глаза кроликам 1-ой и 3-ей группы имплантаты оседали на поверхности радужной оболочки. Образцы занимали положение в нижней части передней камеры, при движении глазных яблок свободно перемещались. Резорбция имплантатов происходила в течение 31 -33-х дней. При офтальмоскопическом исследовании глазных яблок 1-ой и 3-ей опытной групп на всем протяжении эксперимента видимых изменений поверхности имплантатов обнаружено не было. В течение всего срока наблюдения отмечали постепенное уменьшение их длины, сглаженность краев. На 28-е сутки имплантаты имели овальную форму, уменьшены в размере – более, чем на ⅔ от исходной длины. К 33-м суткам имплантатов в передней камере глаза не было обнаружено.

    В одном из 10 глаз 1-ой группы на 7-е сутки отмечали фиксацию края имплантата к поверхности радужной оболочки у зрачкового края. Имплантат находился в нижней части передней камеры, при движении глазного яблока не смещался. Каких-либо воспалительных изменений внутриглазных структур, отложения фибрина, изменения структуры, цвета имплантата выявлено не было. В процессе динамического наблюдения резорбции данного имплантата отмечали постепенное уменьшение его размеров, с сохранением фиксации к поверхности радужки. На 21-е сутки принято решение о выведении данного кролика из эксперимента с целью морфологического исследования места фиксации имплантата.

    При биомикроскопии всех глаз кроликов 1- ой и 3-ей опытной, 1-ой и 3-ей контрольной групп в течение всего периода наблюдения отмечали прозрачность роговицы и влаги передней камеры, сохранялась живая реакция зрачка на свет, цвет и структура радужной оболочки не были изменены, хрусталик оставался прозрачным, глубжележащие среды и структуры глазного дна были без видимых патологических изменений. Ни в одном глазу первой группы не было выявлено воспалительной реакции, каких-либо изменений структур переднего сегмента глаза во время всего периода наблюдения.

    Морфологические исследования глаз 1-ой, 3-ей опытной и контрольной группы на протяжении всего эксперимента не выявили изменений структуры роговицы, радужки и цилиарного тела. При гистологическом исследовании глазного яблока кролика с фиксированным имплантатом на 21 -е сутки обнаружили срез имплантата с адгезией его к радужке, неполную биодеструкцию имплантата. В зоне контакта была обнаружена локальная реактивная воспалительная инфильтрация радужки без патоморфологических изменений других структур переднего сегмента глаза.

    При исследовании влияния ненасыщенного и насыщенного дексаметазоном имплантатов на структуры заднего сегмента глаза кролика во 2-ой и 4-ой группах сразу после интравитреального введения имплантаты определялись в передней трети СТ глаза кролика. На протяжении всего периода наблюдения происходила постепенная резорбция имплантатов в витреальной полости. При этом не обнаружили видимых изменений поверхности имплантатов, отмечали постепенное уменьшение их длины и сглаженность краев. На 33-е сутки имплантатов в СТ выявлено не было.

    Биомикроскопически в глазах контроля, 2-ой и 4-ой опытных и контрольной группах в 1-е сутки после интравитреального введения отмечали локальный отек конъюнктивы, незначительную смешенную инъекцию сосудов глазного яблока в месте склерального прокола, полностью проходившую на 3 сутки. В течение всего периода наблюдения видимых изменений структур переднего сегмента глаза, СТ и сетчатки отмечено не было. Снижение биоэлектрической активности сетчатки по данным ЭРГ выявили в опытных группах на 1-е сутки, что соответствовало таковым в контроле и свидетельствовало о незначительной реакции глаза на интравитреальное введение имплантатов. Через 1 месяц показатели биоэлектрической активности соответствовали нормальным значениям.

    Согласно результатам гистологического исследования структурных изменений и пролиферативных процессов со стороны сетчатки и других внутриглазных структур не отмечено.

    При определении профиля высвобождения дексаметазона из насыщенного имплантата в эксперименте in vivo c помощью метода ВЭЖХ его концентрация в 1-е сутки после интравитреального введения составила в среднем 136,8 ± 1,98 нг/мл. К 3-им суткам было отмечено увеличение концентрации препарата в СТ до 248,5 ± 3,04 нг/мл, на 7-е сутки она составила 190,0 ± 6,9 нг/мл. Значительное уменьшение уровня содержания дексаметазона в образцах выявлено на 14-е сутки - 48,6 ± 9,31 нг/мл. К 21-м суткам определяли повышение концентрации ЛВ в образцах до 218,5 ± 10,64 нг/мл. На 28-е сутки - снижение уровня содержания дексаметазона до 103,4 ± 8,48 нг/мл, а к 35-м суткам препарат не обнаружили в исследуемых образцах СТ. Полученные данные профиля высвобождения дексаметазона соответствовали о периодичности его выделения в лабораторных условиях.

    Повышение концентрации дексаметазона происходило в период растворения насыщенных ЛВ слоев, в то время как снижение концентрации дексаметазона на 14-е сутки объяснялось растворением ненасыщенного слоя. Лишь на 14-е сутки выявлено расхождение концентраций дексаметазона в растворе и исследуемых образцах СТ, что объяснялось наличием механизмов циркуляции внутриглазной жидкости и постоянным выведением вещества из витреальной полости глаза кролика.

    Таким образом, профиль высвобождения дексаметазона из насыщенного имплантата в условиях эксперимента in vivo подтвердил периодичность выделения ЛВ из изучаемого устройства, а также соответствие времени выделения препарата, заявленным характеристикам имплантата (в течение 33 дней).

    Результаты оценки эффективности функционирования насыщенного дексаметазоном имплантата на модели фотоиндуцированного тромбоза ветви ЦВС глаза кролика

    Согласно полученным результатам динамика уменьшения клинических проявлений тромбоза была более выражена в группе с введением имплантата по сравнению с группой, в которой проводили однократную интравитреальную инъекцию дексаметазона. Следует отметить, что в 1-е сутки в группе с интравитреальной инъекцией дексаметазона толщина сетчатки была меньше, чем в опытной группе, что объяснялось более высокой концентрацией препарата в витреальной полости. Уже к 3–им суткам в 1-й группе выявляли уменьшение количества геморрагий и отека сетчатки до 315 ± 8,4 мкм, в то время как во 2-й группе толщина сетчатки составила 344 ± 12 мкм. К 14-му дню наблюдения в опытной группе происходило разрешение отека, тогда как во второй группе в указанные сроки сохранялся отек сетчатки в области пораженной аркады, что было подтверждено данными ОКТ. Более выраженное уменьшение клинических проявлений тромбоза ветви ЦВС в опытной группе свидетельствовало о функционировании имплантата в качестве контейнера для доставки лекарственных препаратов и его способности к постепенному выделению действующего вещества. Конструкция имплантата позволяла предотвратить преждевременное выведение и инактивацию действующего агента и обеспечивала пребывание препарата в витреальной полости в достаточной концентрации для осуществления терапевтического эффекта.

    Таким образом, разработан имплантат для доставки лекарственных средств к структурам заднего сегмента глазного яблока. Данное устройство являлось биорезорбируемым инертным и биосовместимым, обладало способностью к периодическому высвобождению ЛВ, при котором периоды выделения препарата сменялись латентными периодами. В результате выделение лекарственного агента происходило через строго определенные промежутки времени, обеспечивая пролонгированное действие препарата в очаге поражения без превышения терапевтической концентрации и отсутствие побочных эффектов. Период полного растворения имплантата составил 33 суток.

    Анализ вышеприведенных результатов экспериментального исследования структуры и резорбции имплантата, процессов высвобождения препарата из имплантата, а также клинико-морфологических исследований свидетельствовал о безопасности интраокулярного введения ненасыщенного и насыщенного дексаметазоном имплантатов. Разработанный имплантат может быть использован в качестве носителя (резервуара) лекарственных средств. При этом заключение ЛВ в данную систему доставки обеспечивает интактность терапевтического агента до взаимодействия с пораженной тканью, предотвращает преждевременную деградацию вещества, позволяет осуществлять пролонгированное высвобождение лекарственного агента в необходимой дозе. Это обеспечит большую специфичность и эффективность лечения и позволит минимизировать нежелательные побочные эффекты.

Выводы

    1. Разраработан биодеградируемый многослойный интравитреальный имплантат, позволяющий осуществлять доставку лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глазного яблока и пролонгировать пребывание препарата в витреальной полости, с контролируемым высвобождением лекарственных веществ с заданной периодичностью: период выделения действующего агента – 3 суток, латентный период – 1 сутки, подвергающийся полной резорбции в течение 31 дня и не требующий его последующего удаления из места введения.

    2. Конструкция имплантата с чередованием насыщенных и ненасыщенных лекарственным веществом слоев обуславливает предсказуемое, периодическое и точное по продолжительности выделение действующего агента, предотвращая возможное превышение необходимой концентрации действующего вещества в растворе, что позволяет прогнозировать развитие терапевтического эффекта.

    3. В эксперименте in vivo доказано, что разработанный имплантат является инертной, биосовместимой интраокулярной системой доставки лекарственных веществ, подвергается полной резорбции в течение 31 – 33 дней, и не оказывает повреждающего влияния на структуры переднего и заднего сегментов глазного яблока кролика.

    4. Профиль высвобождения дексаметазона из насыщенног о имплантата в условиях эксперимента in vivo подтверждает способность имплантата к контролируемому высвобождению лекарственного вещества в течение заданного промежутка времени – до 35 суток.

    5. Выраженное уменьшение клинических проявлений тромбоза ветви центральной вены сетчатки после введения насыщенного дексаметазоном имплантата доказывает пролонгированное выделение препарата, достаточное для обеспечения терапевтического эффекта и подтверждает эффективность функционирования имплантата в качестве контейнера для доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глазного яблока.

Практические рекомендации

    1. Разработанный оригинальный многослойный биодеградируемый интравитреальный имплантат обеспечивает контролируемое, прерывистое, пролонгированное высвобождение лекарственного агента в течение определенного промежутка времени, что снижает риск развития побочных, токсических эффектов и способствует повышению эффективности лечения витреоретинальных заболеваний.

    2. Разработанный имплантат для доставки лекарственных веществ являлся биосовместимым, устойчивым, инертным устройством, резорбция которого происходит в полном объеме и соответствует срокам деградации имплантата в лабораторных условиях.

    3. На патофизиологической модели фотоиндуцированного тромбоза ветви центральной вены сетчатки подтверждена эффективность предложенного способа доставки лекарственных веществ с помощью интравитреального биодеградируемого насыщенного дексаметазоном имплантата, что обосновывает возможность использования его в качестве носителя (резервуара) лекарственных средств.

Список литературы


Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
    1. Белый Ю.А., Новиков С.В., Терещенко А.В., Колесник А.И. Способы доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глаза // Катарактальная и рефракционная хирургия.– 2014. -№2. – С. 10-14.

    2. Белый Ю.А., Новиков С.В., Колесник А.И. Интравитреальный имплантат для доставки лекарственных веществ к структурам заднего отрезка глаза // Восток-Запад: точка зрения. – 2014. – №1. – С. 23-24.

    3. Белый Ю.А., Новиков С.В., Колесник А.И., Колесник С.В. Интравитреальные системы доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глазного яблока // Вестник Тамбовского университета. – 2014. – Т. 19. – Вып. 4. – С. 1086-1088.

    4. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Новиков С.В., Колесник А.И. Доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глаза посредствам биодеградируемого имплантата // Инновационная офтальмология: сборник тезисов XII Международной научной конференции офтальмологов Причерноморья «Инновационная офтальмология, «BSOS-XII – Sochi -2014».– Сочи, 2014. – С. 111-112.

    5. Белый Ю.А., Новиков С.В., Колесник А.И., Юдина Ю.А. Интравитреальный имплантат для доставки лекарственных веществ к структурам заднего отрезка глаза // Вестник ОГУ. – 2014. - № 12 (173). -С.51-55.

    6. Новиков С.В., Белый Ю.А., Терещенко А.В., Колесник А.И., Колесник С.В. Интравитреальный имплантат для доставки лекарственных веществ к структурам заднего отрезка глаза // Современные технологии в офтальмологии. – 2015. – Выпуск №1 (5) «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии». – С. 94-96.

    7. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Новиков С.В., Колесник А.И., Колесник С.В. Доставка лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глаза посредством интравитреального имплантата // Вестник Тамбовского университета. – 2015. – Т. 20, вып. 3. – С. 517-521.

    8. Belyi I., Novikov S., Tereschenko A., Kolesnik A. A new biodegradable multilayer implant for drug delivery to the posterior eye segment // European Society of Ophthalmology: Abstracts. - Vienna, Austria, 2015. - P. 210.

    9. Белый Ю.А., Новиков С.В., Терещенко А.В., Колесник А.И., Колесник С.В. Доставка лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глаза при помощи интравитреального имплантата // Офтальмохирургия.- 2015.- №2.- С. 34-40.

    10. Колесник А.И., Белый Ю.А., Новиков С.В. Экспериментальное обоснование использования интравитреального имплантата в качестве контейнера для доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глаза (предварительное сообщение) // «Актуальные проблемы офтальмологии», 9-й: Сб. тр. научно - практ. конф. с международным участием. - М., 2014.– С. 209 – 212.

    11. Belyi I., Novikov S., Tereschenko A., Kolesnik A., Kolesnik S. A new biodegradable multilayer implant for intraocular drug delivery // European VitreoRetinal Society: Abstracts.– Italy, Venice.- 2015. URL: http://www.evrs.eu/new-biodegradable-multilayer-implant-for-intraocular-drugdelivery-iurii-belyi/17.09.2015

    12. Темнов А.А., Белый Ю.А., Новиков С.В., Шацких А.В., Колесник С.В., Колесник А.И. Экспериментальное исследование безопасности интраокулярного введения нового биорезорбируемого имплантата для доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глаза // Трансплантология. – 2015.-№4.- С. 13-21.

    13. Белый Ю.А., Темнов А.А., Новиков С.В., Колесник С.В., Колесник А.И. Оценка эффективности функционирования насыщенного дексаметазоном биодеградируемого имплантата на модели фотоиндуцированного тромбоза ветви центральной вены сетчатки глаза кролика // medline.ru. – 2015.-Т. 16.- С. 915-929.
Биографические данные
    Колесник Антон Игоревич, 1987 года рождения, в 2010 году окончил Оренбургскую Государственную Медицинскую Академию по специальности «Лечебное дело».

    С 2010 по 2012 год проходил обучение в клинической ординатуре по специальности «офтальмология» ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

    С 2012 по 2015 год обучался в очной аспирантуре на базе ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

    Автором опубликовано 13 работ по теме диссертации, получен приоритет на патент на изобретение РФ.

Список сокращений

    ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография

    ЛВ – лекарственное вещество

    ОКТ – оптическая когерентная томография

    СТ – стекловидное тело

    СЭМ – сканирующая электронная микроскопия

    ЭРГ – электроретинография


Город: Москва – 2016
Темы: 14.01.07 – глазные болезни
Дата добавления: 01.12.2018 12:29:21, Дата изменения: 01.12.2018 12:29:22

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракци...

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационал...

Федоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практичес...

Актуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная ...

Современные тенденции развития офтальмологии - фундаментально-прикладные аспекты Всероссийская научно-практическая конференцияСовременные тенденции развития офтальмологии - фундаментальн...

Восток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологии

Академия ZiemerАкадемия Ziemer

Белые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Международного офтальмологического конгрессаБелые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Междун...

Новые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно-практическая конференцияНовые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии – 2019 ХVII Всероссийская научно-практическаяконференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии –...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2019»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Роговица III. Инновации  лазерной коррекции зрения и кератопластикиРоговица III. Инновации лазерной коррекции зрения и кератоп...

ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты»ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вме...

Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и иммунодефицитные заболевания»Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и ...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

«Живая» хирургия в рамках конференции  «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»«Живая» хирургия в рамках конференции «Современные технолог...

Сателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенациональ...

Федоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическ...

Актуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная...

Восток – Запад 2018  Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2018 Международная конференция по офтальмологии

«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»

Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Между...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизонты -  2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизон...

Сателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКОСателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКО

Top.Mail.Ru


Open Archives