Онлайн доклады

Онлайн доклады

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция с онлайн-трансляцией

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция с онлайн-трансляцией

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической  конференции офтальмологов

Конференция

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической конференции офтальмологов

ХVII Ежегодный конгресс  Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Конгресс

ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Конференция

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Симпозиум

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Симпозиум

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

Симпозиум

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Конференция

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция с онлайн-трансляцией

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция с онлайн-трансляцией

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической  конференции офтальмологов

Конференция

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической конференции офтальмологов

ХVII Ежегодный конгресс  Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Конгресс

ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Конференция

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Симпозиум

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Все видео...
Год
2016

Обоснование применения нестероидной противовоспалительной терапии для профилактики развития пролиферативной витреоретинопатии


Органзации:
В оригинале: ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России



Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Общая характеристика работы


Актуальность темы
    Пролиферативная витреоретинопатия (ПВР) – это тяжелая патология глаза, которая характеризуется избыточным воспалением, формированием соединительнотканных мембран и приводит к слепоте. Она является одной из основных причин рецидива регматогенной отслойки сетчатки, которая встречается в 6,1-17,9 случаев на 100 тысяч населения (Mitry D., 2010). ПВР в послеоперационном периоде развивается в 16% случаев (Bonnet M., 1995; Kon C.H., 2000).

    В настоящее время самым эффективным способом лечения ПВР считают хирургический (Silicone Study Group 1992; de Silva DJ, 2008). Даже после тщательного удаления мембран с поверхности сетчатки, частота рецидивов ПВР в первые три месяца после операции составляет в среднем 45% (Нероев ВВ, 2012; Шишкин ММ, 2012; Bonnet M, 1995; Kon C.H, 2000). Заболевание диагностируют на поздних стадиях, когда мембраны сформированы и обширны. Поэтому в дополнение к уже существующим хирургическим методам назрела необходимость разработки терапевтических подходов для профилактики ПВР.

    В основе процесса развития заболевания лежит воспалительная реакция, характеризующаяся наличием альтерации, экссудации и пролиферации. В момент нарушения целостности сетчатки одним из первых активируется каскад арахидоновой кислоты. Из арахидоновой кислоты циклооксигеназы (ЦОГ-1 и ЦОГ-2) синтезируют провоспалительные простагландины, которые организуют процесс воспаления в поврежденной области. Провоспалительная ЦОГ-2 экспрессируется и клетками поврежденной сетчатки, и клетками идиопатических мембран (Maloney S., 2009), и образующимися на глазном дне при сахарном диабете мембранами (Kase S., 2010). Далее происходит увеличение проницаемости сосудов и выход провоспалительных клеток крови в преретинальное пространство. Клетки начинают синтезировать цитокины и факторы роста, что с одной стороны приводит к еще большему увеличению проницаемости сосудов, а с другой – стимулирует пролиферацию клеток ПЭС, глиальных и иммунных клеток на поверхности сетчатки и стекловидного тела (Sen H., 1988; Lagua H., 1975; Vinores S., 1990; Charteris D., 2002; Oberstein S., 2011; Johnsen E., 2012). Клетки синтезируют матрикс, а через 2 недели от начала развития ПВР у них появляется сократительная активность. Это момент формирования фиксированных складок отслоенной сетчатки с выраженным ее укорочением (Glaser B., 1987; Walshe R., 1992).

    Для уменьшения воспаления в клинике применяют стероидные препараты, которые блокируют действие фосфолипазы А2 и подавляют весь каскад метаболизма арахидоновой кислоты (Tano Y., 1980; Acar N., 2010; Chen W., 2011), включая образование липоксинов. Липоксин А4 подавляет воспаление и способствует его разрешению (Gronert K., 2010). Стероидные препараты имеют ряд побочных эффектов: повышение ВГД и ВЧД, развитие задней субкапсулярной катаракты, повышение уровня глюкозы в крови, снижение местного иммунитета (Майский В., 2006). К данной группе препаратов относится триамцинолона ацетонид, широко используемый в офтальмологии.

    Действие НПВС при интравитреальном введении не изучено. НПВС блокируют работу ЦОГ, синтез липоксина А4 сохраняется. Для исследования нами выбран лорноксикам – НПВС с выраженным обезболивающим, противовоспалительным и антиагрегантным действием. Препарат не оказывает токсического действия на сетчатку (Diakonis VF, 2013). В качестве положительного действия рассматриваем его способность уменьшать пролиферацию фибробластов и глиальных клеток (Гаврилова СА, 2008; Тихонович МВ, 2012). НПВС не имеют побочных эффектов стероидных препаратов.

    Можно предположить, что данные свойства лорноксикама будут эффективны для профилактики развития ПВР.
Цели и задачи исследования
    Цель исследования

    Изучить роль провоспалительных факторов в динамике развития пролиферативной витреоретинопатии и обосновать применение нестероидного противовоспалительного препарата (лорноксикама) для профилактики развития данного заболевания.

    Задачи исследования

    1. Доказать наличие провоспалительных, ростовых и нейротрофических факторов в эпиретинальных мембранах человека на поздних стадиях ПВР.

    2. Создать диспазную модель пролиферативной витреоретинопатии у крыс и разработать критерии оценки состояния глаза крыс в эксперименте.

    3. Обосновать преимущества применения нестероидной противовоспалительной терапии при ПВР по разработанным критериям в сравнении со стероидной терапией.

    4. Изучить динамику изменений экспрессии циклооксигеназ в сетчатке и хориоидее на разных сроках развития пролиферативной витреоретинопатии в диспазной модели у крыс.

    5. Провести сравнительный анализ изменений экспрессии циклооксигеназ в сетчатке и хориоидее в ответ на введение стероидного и нестероидного противовоспалительных препаратов при пролиферативной витреоретинопатии.
Научная новизна исследования
    1. Впервые доказано, что в развивающихся при ПВР эпиретинальных мембранах на поздних стадиях заболевания экспрессируются циклооксигеназы первого и второго типов, нейротрофины BDNF и NGF и эндотелиальный фактор роста сосудов, что способствует поддержанию воспаления в глазу и росту мембран. Наблюдается прямая корреляционная зависимость между экспрессией ЦОГ-1, VEGF и BDNF.

    2. Впервые создана модель пролиферативной витреоретинопатии у крыс на основе интравитреального введения диспазы и разработаны критерии оценки состояния глаза и изменений сетчатки в данной модели, основанные на офтальмоскопических и морфологических данных.

    3. Впервые исследовано действие нестероидного противовоспалительного препарата (лорноксикам) на состояние глаза и изменения морфологических показателей сетчатки и хориоидеи при развитии ПВР в диспазной модели у крыс.

    4. Впервые сравнили влияние нестероидного противовоспалительного препарата (лорноксикам) и стероидного противовоспалительного препарата (триамцинолона ацетонид) на состояние животных и их глаз, морфологические изменения сетчатки и хориоидеи, выраженность и частоту образования пролиферативных мембран.

    5. Впервые изучили изменения экспрессии циклооксигеназ в сетчатке и хориоидее на разных стадиях развития заболевания в диспазной модели ПВР у крыс и проанализировали действие нестероидного противовоспалительного препарата (лорноксикам) и стероидного противовоспалительного препарата (триамцинолона ацетонид) на неё.
Практическая значимость
    1. Выявлено, что в эпиретинальных мембранах при ПВР синтезируются провоспалительные факторы, на синтез и экспрессию которых можно влиять терапевтически.

    2. Разработана схема терапевтического лечения ПВР, которая эффективнее применяемых в настоящее время в офтальмологии терапевтических методов профилактики пролиферативной витреоретинопатии.

    3. Учитывая доказанный минимальный риск осложнений, возможность повторного введения, высокую эффективность профилактики ПВР, внедрение нестероидной противовоспалительной терапии в офтальмологическую практику позволит уменьшить количество рецидивов отслойки сетчатки после хирургического лечения и снизить частоту встречаемости и тяжесть послеоперационных осложнений.

    4. Нестероидный противовоспалительный препарат (лорноксикам) доступен для широкого внедрения в офтальмологическую практику.
Основные положения, выносимые на защиту
    1. Доказано, что на ранних стадиях развития пролиферативной витреоретинопатии происходит увеличение экспрессии провоспалительных циклооксигеназ в сетчатке и хориоидее, это сопровождается запуском целого каскада морфологических изменений. В образующихся на поздних стадиях данного заболевания мембранах также синтезируются провоспалительные циклооксигеназы, эндотелиальный фактор роста сосудов и нейротрофины, что поддерживает высокий уровень воспаления в глазу и способствует дальнейшему росту мембран.

    2. Обосновано применение нестероидной противовоспалительной терапии для профилактики развития пролиферативной витреоретинопатии на основании полученных в ходе исследования данных, отражающих преимущества использования НПВС в сравнении со стероидной терапией. Лорноксикам, блокируя действие циклооксигеназ и нормализуя их экспрессию в сетчатке и хориоидее, препятствует развитию эндофтальмита, предупреждает ремоделирование сетчатки на всех сроках ПВР, значительно снижает частоту образования мембран и выраженность в них фиброзных процессов.
Внедрение в практику
    Разработанная диспазная модель ПВР и критерии оценки состояния глаза при данной патологии у крыс внедрены и эффективно используются в практике на кафедре физиологии и общей патологии ФФМ МГУ. Их используют в научных целях для изучения фундаментальных вопросов воспаления и для разработки терапевтических подходов в лечении, также анализ получаемых результатов исследования включен в обучающий план кафедры физиологии и общей патологии ФФМ МГУ.
Апробация диссертации
    Основные положения диссертации доложены на VI всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2016), на 14ом международном конгрессе «EURETINA» (Лондон, 2014), на XI и XII международных научно-практических конференциях «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии» (Москва, 2014 и 2013), на международной конференции «ISOCB Ocular Cell Biology Conference» (Оксфорд, 2013), и на международном молодежном научном форуме «Ломоносов - 2012» (Москва, 2012).
Публикации
    По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них - 4 в центральных рецензируемых журналах из списка ВАК РФ, 2 иностранные публикации. Получено два патента РФ на изобретение № 2558991 приоритет от 31.01.2014 и № 2458656 приоритет от 17.06.2011.
Объем и структура диссертации
    Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов, результатов, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 173 страницах компьютерного текста, содержит 22 таблицы, 25 рисунков. Список литературы включает 265 источников, из них 6 отечественных и 259 зарубежных.

Содержание работы


Материалы и методы исследования
    Работа состоит из клинической и экспериментальной частей.

     1. В клиническую часть вошли 11 пациентов (11 образцов): 6 мужчин и 5 женщин в возрасте от 31-ого до 74-х лет (60,2±11,2 года) с РОС и наличием выраженной ПВР (на стадии от B до D3). У двух пациентов в анамнезе первичная отслойка сетчатки, у девяти – рецидив отслойки сетчатки. У всех пациентов локализация разрывов сетчатки периферическая. Длительность заболевания у пациентов варьировала от 4-х до 36-ти месяцев (13,2±8,8 месяцев). Пациенты с другой глазной патологией из исследования были исключены. Всем пациентам проводили стандартные офтальмологические обследования до и после операции. В полученных при хирургическом вмешательстве эпиретинальных мембранах ПЦР-анализом определяли мРНК циклооксигеназ (ЦОГ-1 и ЦОГ-2), эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF), мозгового нейротрофического фактора (BDNF) и фактора роста нервов (NGF).

    2. Экспериментальная часть исследования выполнена на трехстах половозрелых самцах беспородных крыс (300 глаз), массой 354±110 гр. В ходе эксперимента оценивали общее состояние животных: массу, внешний вид, активность; проводили общий осмотр глаза и его придатков; выполняли непрямую офтальмоскопию с видеорегистрацией глазного дна и стекловидного тела. Разработка диспазной модели пролиферативной витреоретинопатии у крыс Для разработки модели ПВР использовали протеолитический фермент, расщепляющий белки внеклеточного матрикса, диспазу. Раствор фермента в трех дозах 0,015U/мкл, 0,035U/мкл, 0,075U/мкл вводили интравитриально в объеме 2 мкл, контрольным животным вводили 0,9% NaCl эквивалентно, дополнительно исследовали интактный контроль. Эксперимент выполнен на 70 крысах. Энуклеацию проводили на 1-ой, 6-ой и 8-ой неделях эксперимента. Полученные срезы глаз окрашивали гематоксилин-эозином и азаном по методу Гейденгайна (на соединительную ткань). Оценка состояния сетчатки и хориоидеи осуществляли по разработанным оригинальным критериям: толщина отдельных слоев сетчатки и общая толщина сетчатки, толщина хориоидеи, продолжительность волнообразных изменений ядерных слоев сетчатки и её отслойки, наличие кист и розеток в сетчатке, выраженность деструкции фоторецепторов, наличие суб- и/или эпиретинальных кровоизлияний и суб- и/или эпиретинальных мембран (рис. 1).

    Высокие дозы фермента на поздних сроках эксперимента вызывали сильные деструктивные изменения сетчатки, когда не представлялось возможным выделить в ней конкретные слои. Скорость их появлений зависела от дозы фермента: максимальная доза вызывала деструкцию на 6-ой неделе эксперимента, а средняя доза - на 8-ой неделе. Минимальная доза диспазы не вызывала столь выраженных изменений сетчатки. Интравитреальное введение 2 мкл диспазы в дозе 0,015 U/мкл приводило к формированию в 100% случаев выраженных фиброзных мембран на 42 сутки эксперимента. Именно эта доза была выбрана для моделирования заболевания.

    Исследование действий противовоспалительных препаратов на динамику развития ПВР у крыс

    Протокол экспериментов. Для исследования эффективности противовоспалительной терапии при моделировании ПВР крысам через 20 мин после интравитреальной инъекции 0,015U/мкл диспазы вводили лорноксикам в дозе 8 мг/мл или триамцинолона ацетонид (ТА) в дозе 40 мг/мл. На вторые и третьи сутки лорноксикам вводили внутрибрюшинно в дозе 230 мкг/кг, ТА – внутримышечно в дозе 571 мкг/кг, контрольные крысы получали 0,9% NaCl эквивалентно, дополнительный контроль - интактные крысы. Энуклеацию проводили на 1-ый, 3-ий, 7-ой и 42-ой день эксперимента. Всего выполнили 130 экспериментов. Экспериментальные группы животных: Физ р-р - животные, получавшие 0,9% NaCl; Лорн – животные, получавшие лорноксикам; Триам – животные, получавшие триамцинолона ацетонид; Дисп - животные, получавшие внутриглазную инъекцию 2 мкл диспазы; Дисп+Лорн – животные с диспазной витреоретинопатией, получавшие лорноксикам; Дисп+Триам -животные с диспазной витреоретинопатией, получавшие ТА; ИК – интактные животные в качестве контроля.

    Схема и дозы вводимых препаратов выбраны исходя из рекомендованных для людей. Гистологические методы оценки состояния сетчатки глаз. Полученные срезы глаз окрашивали гематоксилин-эозином. Фотографирование срезов и обсчет проводили с использованием программы «AxioVision». Исследование экспрессии циклооксигеназ в сетчатке и хориоидее в диспазной модели ПВР у крыс, и влияния противовоспалительных препаратов на этот процесс

    Во всех группах изучали динамику продукции циклооксигеназ 1 и 2 типов, эксперимент выполнен на 100 животных. Протокол эксперимента описан выше. На депарафинизированные срезы наносили первичные антитела к ЦОГ-1 или ЦОГ-2 (кролик против крысы) фирмы Abcam и вторичные (козел против кролика), меченные пероксидазой. Активность собственных пероксидаз подавляли H2O2. В качестве отрицательного контроля использовали окрашенные вторичными антителами срезы сетчатки интактных крыс. Подсчет концентрации циклооксигеназ в слоях сетчатки и в хориоидее осуществляли в программе «ImagePro».

    Статистическую обработку результатов проводили в программах Microsoft Excel 2011, Statistica 10.0, IBM SPSS Statistics 22. Использовали метод χ-квадрат или точный критерий Фишера; дисперсионный анализ смешанной линейной модели; непараметрический U-критерий Манна-Уитни; метод ранговой корреляции по Спирмену. Различия считали значимыми при p<0,05.

Результаты исследования


Результаты анализа экспрессии ростовых, трофических и провоспалительных факторов в эпиретинальных мембранах
    В 11-ти образцах эпиретинальных мембран пациентов с тяжелыми формами течения как рецидивирующей, так и первичной ПВР методом ПЦР выявлена экспрессия мРНК ЦОГ-1 и ЦОГ-2, VEGF и BDNF. мРНК NGF обнаружили только в трех образцах. Экспрессия провоспалительных факторов не зависела от пола, возраста пациентов, частоты рецидивирования заболевания и исхода лечения.

    Впервые было выявлено, что чем больше в мембране экспрессировалось ЦОГ-1, тем больше в ней обнаруживали VEGF (Spearman R=0,71; р<0,05) и BDNF (Spearman R=0,74; р<0,01). Уровни продукции мРНК VEGF и BDNF также положительно связаны между собой (Spearman R=0,61; р<0,05). Ранее считалось, что зрелые мембраны имеют низкий уровень воспаления.

    Таким образом, было показано, что на поздних стадиях ПВР в мембранах синтезируются провоспалительные факторы и факторы, обеспечивающие сохранность и пролиферацию клеток - VEGF и BDNF, что поддерживает высокий уровень воспаления и ростовых процессов в больном глазу.

    Эти результаты позволили выработать рабочую гипотезу о том, что подавление синтеза простагландинов в ранний срок развития заболевания снизит уровень воспаления и уменьшит процессы фиброзирования и роста мембран.
Результаты действия противовоспалительных препаратов на динамику развития ПВР у крыс
     Введение диспазы сопровождалось развитием катаракты у четверти животных 25% (р<0,01) и гемофтальма более, чем у половины животных в группе (р<0,001).

    Лорноксикам на ранних сроках развития ПВР не влиял на частоту образования катаракты и гемофтальма. При использовании ТА для профилактики ПВР наблюдали тенденцию к увеличению частоты развития катаракты и гемофтальма на 18% (р=0,11) и на 15% (р=0,13) соответственно по сравнению с группой, получившей диспазу. В этой группе эндофтальмиты сопровождали развитие ПВР у четверти животных (p<0,05 по сравнению с группой Дис).

    Оба противовоспалительных препарата сдвигали момент образования волнистых изменений в сетчатке с первых на третьи сутки эксперимента. Лорноксикам сдерживал увеличение частоты встречаемости «розеток» в сетчатке при развитии ПВР (р<0,05). Препарат на 34% (р<0,05) уменьшил частоту поражения фоторецепторов, при этом состояние пораженных фоторецепторов в группе Дисп+Лорн было в 2 раза лучше (р<0,05), чем в группе Дисп, и выраженность их изменений была сопоставима с таковой у животных, получавших физ. р-р. Триамцинолона ацетонид не обладал данными действиями.

    Диспаза в месте непосредственного контакта с сетчаткой приводила к нарушению целостности ретинальных и/или хориоидальных сосудов, что сопровождалось кровоизлиянием. Нарушение гематоофтальмического барьера стимулировало развития мембран, которые образовывались эпи- и/или субретинально. ТА не повлиял на частоту развития мембран. Использование лорноксикама на 43% (р<0,05) снизило частоту развития мембран. В тех случаях, когда при применении лорноксикама мембраны образовывались, на 42 сутки эксперимента они всегда были меньше по размеру и почти не содержали выраженных фиброзных тяжей. Морфологически это многоклеточные структуры, похожие на молодые мембраны на 7 сутки у животных без лечения (рис. 2). Вероятно, хирургическое удаление данного типа мембран будет менее травматично для сетчатки.

    Большое внимание было уделено изучению состояния сетчатки и хориоидеи. Было выявлено, что интавитреальная инъекция физиологического раствора сопровождается утолщением сетчатки на 54 мкм (p<0,001), вызванным отеком всех её слоев, кроме ганглионарного. На 42 сутки отек спадает, и толщина сетчатки становится сопоставима с интактной. То есть нарушение целостности глазного яблока запускает слабую реакцию воспаления. При этом толщина хориоидеи не изменялась на протяжении всего эксперимента. Введение диспазы ухудшило состояние сетчатки и хориоидеи. Изменения появились с первых суток и нарастали с увеличением длительности эксперимента. На 1-ые сутки происходило увеличение ВЯС и НПС на 33% (p<0,05) и на 50% (p<0,01) соответственно, что было вызвано отеком ганглионарного слоя сетчатки. На 3-и сутки общая толщина сетчатки уменьшалась на 21% (p<0,05) по сравнению с группой ИК, в основном за счет уменьшения толщины НЯС, ВПС в 1,4 раза (p<0,05) и нейроганглионарного слоя в 1,5 раза (p<0,01) вследствие гибели фоторецепторов и ганглионарных клеток сетчатки. На 7-ые сутки после внутриглазной инъекции диспазы происходило значительное увеличение толщины всех слоев, кроме СПК и НГС, при этом общая толщина сетчатки увеличилась в 2 раза (p<0,05) по сравнению с ИК. Толщина хориоидеи увеличивалась в 3 раза (p<0,01). Однако в отличие от группы Физ р-ра, при использовании диспазы не происходило уменьшения толщины сетчатки к 42 суткам эксперимента. Толщина хориоидального слоя была больше на 68% (p<0,01), а толщина сетчатки – на 59% (p<0,05) по сравнению с группой ИК, что связано с процессами глиоза и фиброза в сетчатке.

    Использование ТА в диспазной модели ПВР у крыс уменьшало выраженность изменений слоёв сетчатки по сравнению с группой, получавшей только диспазу. Препарат сдерживал появление изменений толщины слоев сетчатки на 1-ые сутки. На 3-и сутки наблюдали уменьшение слоя хориоидеи и НГС сетчатки на 37% (p<0,01) и 29% (p<0,05) соответственно. К 7-ым суткам наблюдали общее утолщение сетчатки в 1,6 раза (p<0,01). В данном случае оно происходило из-за расширения СПК в 1,9 раза (p<0,01), НЯС в 1,5 раза (p<0,05) и ВЯС в 1,6 раза (p<0,05). Хориоидея также увеличивалась в размерах в 4 раза (p<0,001). К концу эксперимента в группе Дисп+Триам осталось только три крысы, у которых можно было анализировать сетчатку, у остальных животных наблюдался эндофтальмит. К 42 суткам НГС уменьшается по сравнению с ИК на 24% (p<0,05).

    Лорноксикам нивелировал действие диспазы, и толщины сетчатки и хориоидеи не менялись на протяжении всего эксперимента.

    Таким образом, применение лорноксикама на ранних стадиях ПВР препятствовало развитию эндофтальмита, предупредило ремоделирование сетчатки и хориоидеи на ранних и поздних стадиях заболевания, на 43% снизило частоту образования мембран и значительно уменьшило их фиброзирование. Использование ТА способствовало увеличению частоты развития катаракты, гемофтальма, в 8 раз увеличило количество случаев эндофтальмита, не предупредило отёк сетчатки, развившийся на седьмые сутки эксперимента, ухудшило состояние хориоидеи и НГС.
Результаты действия противовоспалительных препаратов на экспрессию циклооксигеназ в диспазной модели пролиферативной витреоретинопатии у крыс
    На 1-ые сутки после введения диспазы обнаружили ЦОГ-1 в ЭС, в НПС и во внутренних сегментах фоторецепторов, где в норме данный фермент отсутствует. ТА усилил действие диспазы на экспрессию ЦОГ-1 в ЭС, НЯС и ВЯС, и в НГС на 7%, 6%, 29% и 9% соответственно (p<0,05). В группе Дисп+Триам возросла экспрессия ЦОГ-1 в слоях, где в норме её нет: в хориоидее на 45% (p<0,05), во внутренних сегментах фоторецепторов на 38% (p<0,05) и в НПС на 16% (p<0,05) соответственно по сравнению с животными из группы ИК. Использование лорноксикама привело к возвращению экспрессии ЦОГ-1 к норме не только по распределению в слоях сетчатки, но и по концентрации в них.

    ЦОГ-2 также стала определяться во всех слоях сетчатки и в хориоидее после введения диспазы. При этом в НГС произошло увеличение экспрессии ЦОГ-2 по сравнению с группой ИК на 32% (p<0,05). Использование НПВС в дополнение к инъекции диспазы вернуло количество ЦОГ-2 во внутренних сегментах фоторецепторов к норме. Лорноксикам снизил экспрессию ЦОГ-2 в НГС на 9% по сравнению с группой, не получавшей лечения. ТА не повлиял на экспрессию данной изоформы фермента в НГС по сравнению с группой Дисп.

    На 3-и сутки эксперимента экспрессия ЦОГ-1 во всех группах соответствовала норме. ЦОГ-2 по-прежнему присутствовала во всех слоях сетчатки и в хориоидее в группе Дисп. Лорноксикам сдвинул момент увеличения экспрессии ЦОГ-2 в НГС с первых на третьи сутки и нормализовал содержание фермента в ЭС.

    На 7-ые сутки эксперимента в группе, получавшей диспазу, экспрессия ЦОГ-1 была снижена на 28% (p<0,05) в ВЯС по сравнению с группой ИК.

    Противовоспалительные препараты оказали протективный эффект на уровне данного слоя. В группе Дисп+Триам была увеличена продукция ЦОГ-1 в хориоидее в 1,5 раза (p<0,05), в ЭС в 2 раза (p<0,01), в слое внутренних сегментов фоторецепторов в 1,4 раза (p<0,05) и в НГС в 1,3 раз (p<0,05) по сравнению с базовым уровнем. Данные изменения могли быть вызваны ишемией сетчатки. При использовании лорноксикама для профилактики ПВР данных изменений в экспрессии ЦОГ-1 не наблюдали.

    Экспрессия ЦОГ-2 на 7-ые сутки после введения диспазы снижалась также в НЯС и ВЯС на 34% (p<0,01) и 31% (p<0,05) по сравнению с группой ИК соответственно, что, вероятно, было вызвано гибелью клеток в данных слоях. Противовоспалительные препараты на этот эффект диспазы не повлияли. На шестой неделе эксперимента экспрессия ЦОГ-1 была снижена во внутреннем ядерном слое на 30% (p<0,05) у всех групп животных, получавших диспазу. Картина экспрессии ЦОГ-2 мало отличалась от той, что была получена на седьмые сутки эксперимента.

    Во всех мембранах, развившихся вследствие ПВР, аналогично мембранам у людей обнаружили экспрессию циклооксигеназ первого и второго типов.

    Таким образом, введение диспазы с первых суток эксперимента изменяло экспрессию циклооксигеназ первого и второго типов в сетчатке и хориоидее.

    Противовоспалительные препараты оказали в основном эффект на экспрессию ЦОГ-1. При этом лорноксикам с первых суток нормализовал профиль экспрессии фермента, в то время как ТА, наоборот, увеличивал концентрацию ЦОГ-1 в сетчатке и хориоидее с первых по седьмые сутки эксперимента, что способствовало поддержанию высокого уровня воспаления в глазу и развитию пролиферативной витреоретинопатии.

Выводы

    1. Методом ПЦР-анализа было доказано, что на поздних стадиях ПВР в эпиретинальных мембранах человека экспрессируются провоспалительные циклооксигеназы (ЦОГ-1 и ЦОГ-2), эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF), нейротрофический фактор роста (BDNF) и фактор роста нервов (NGF). Выявлена положительная корреляционная зависимость между экспрессией ЦОГ-1, VEGF и BDNF.

    2. Созданная модель пролиферативной витреоретинопатии у крыс позволяет изучить течение заболевания с момента его инициации до поздних стадий. Интравитреальное введение 2 мкл раствора диспазы в дозе 0,015U/мкл запускает воспалительный процесс и на 42 сутки стабильно приводит к развитию выраженных фиброзированных мембран. Разработаны критерии оценки состояния глаз крыс, полностью характеризующие ПВР на ранних и поздних стадиях развития.

    3. В эксперименте in vivo доказано, что блокирование ЦОГ-1 и ЦОГ-2 с помощью лорноксикама в острую стадию ПВР оказывает выраженный противовоспалительный эффект, что препятствует развитию эндофтальмита, предупреждает ремоделирование сетчатки на всех сроках развития ПВР, на 43% снижает частоту образования мембран и выраженность в них фиброзных процессов. Ингибирование фосфолипазы А2 с помощью триамцинолона ацетонида приводит к увеличению частоты развития эндофтальмита и не сопровождается уменьшением проявлений признаков ПВР ни в острый, ни в хронический период заболевания.

    4. Методом иммуногистохимического окрашивания определено, что экспрессия ЦОГ-1 и ЦОГ-2 при моделировании ПВР имеет сложную динамику. В первые сутки концентрация обоих ферментов возрастает во всех слоя сетчатки. На третий день экспрессия ЦОГ-1 нормализуется; концентрация ЦОГ-2 уменьшается во всех слоях, за исключением эпителиального, где её содержание остается в 1,3 раза выше нормы. С седьмых суток эксперимента экспрессия ЦОГ-1 и ЦОГ-2 уменьшается в ядерных слоях сетчатки более чем на 30%.

    5. При введении нестероидного противовоспалительного препарата лорноксикама в условиях эксперимента in vivo сохраняется профиль экспрессии ЦОГ-1, соответствующий здоровому контролю, тогда как стероидный препарат триамцинолона ацетонид усиливает экспрессию ЦОГ-1 в слоях сетчатки, содержащих ядра клеток, и в хориоидее на ранних сроках развития ПВР.

    6. Доказано, что подавление циклооксигеназного звена воспалительной реакции является перспективной стратегией терапевтической профилактики развития пролиферативной витреоретинопатии.

Практические рекомендации

    1. Рекомендуется включение интравитреального введения в конце выполнения операции и системного применения в последующие два дня после операции нестероидного противовоспалительного препарата лорноксикама в схему терапевтической профилактики пролиферативной витреоретинопатии у людей, перенесших хирургическое лечение регматогенной отслойкой сетчатки и отслойки сетчатки, осложненной ПВР.

    2. Рекомендуется исключить интравитреальное использование триамцинолона ацетонида при наличии острого воспаления в глазу.

    3. Рекомендуется включить результаты по роли циклооксигеназ в функционировании сетчатки глаза и регуляции ими ростовых процессов в условиях изменяющейся синтетической активности в учебный курс офтальмологии, физиологии и фармакологии для студентов медиков и биологов.

    4. Рекомендуется созданную модель пролиферативной витреоретинопатии у крыс использовать как корректную модель изучения функционирования сетчатки и хориоидеи в условиях здоровья и при изменяющейся синтетической активности клеток сетчатки.

    5. Рекомендуется разработанную модель применять для оценки влияния лекарств на пролиферативные процессы в сетчатке, для разработки новых терапевтических стратегий пролиферативных заболеваний с последующей перспективой их использования в клинике.

Список работ, опубликованных по теме диссертации


Список литературы
    1. Тихонович М., Иойлева Е., Гаврилова С. Роль воспаления в развитии пролиферативной витреоретинопатии // Клиническая медицина. – 2015. – Т. 93, № 7. – С. 14–20.

    2. Ердяков А., Тихонович М., Ржавина Е., Гаврилова С. Характеристики сетчатки при развитии пролиферативной витреоретинопатии у крыс после внутриглазной инъекции конканавалина А и диспазы // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. – 2015. – Т. 101, № 5. – С. 572–585.

    3. Тихонович М., Лыскин П., Иойлева Е. и др. Экспрессия ростовых, трофических и провоспалительных факторов в эпиретинальных мембранах пациентов с тяжелой формой пролиферативной витреоретинопатии // Офтальмохирургия – 2015. – № 4. – С. 36–42.

    4. Тихонович М., Иойлева Е. Роль эндотелиального фактора роста сосудов в физиологии сетчатки // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2015. – № 12(187). – С. 244–249.

    5. Тихонович. М.В., Ердяков А.К., Ржавина Е.М. «Влияние лорноксикама на общее состояние глаза и образование эпиретинальных мембран в модели воспаления у крыс» // VI Всероссийская научная конференция молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии» сборник научных работ 2011. – М., -С. 239-240

    6. Тихонович М., Ердяков А., Ржавина Е. Влияние лорноксикама на состояние глаза и образование эпиретинальных мембран в модели воспаления // Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье: XIV Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей (с международным участием). – Издательство СПбГУ СПб., 2011. – С. 269–270.

    7. Тихонович М., Ердяков А., Ржавина Е. Влияние лорноксикама на общее состояние глаза и образование эпиретинальных мембран в модели воспаления у крыс//Материалы 6-й Всероссийской научной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы офтальмологии". – М., 2011. – С.

    8. Тихонович М. Неселективный блокатор циклооксигеназ в лечении патологий центрального отдела сетчатки с отечно-транссудативным компонентом // Материалы Международного молодежного научного форума Ломоносов-2012. – МАКС Пресс, 2012.

    9. Тихонович М., Лыскин П. Неселективный блокатор циклооксигеназ в лечении патологий хориоретинального интерфейса центрального отдела сетчатки с отечно-транссудативным компонентом // V Всероссийский с международным участием семинар-круглый стол "Макула" 2012. – Ростов-на-Дону, 2012. – С. 523–524.

    10. Тихонович М., Ржавина Е., Ердяков А. Влияние неселективного блокатора циклооксигеназ на развитие эпиретинального фиброза в моделях необратимой ишемии глаза и диспазовызванной пролиферативной витреоретинопатии // Механизмы функционирования висцеральных систем. VIII Всероссийская конф. с междунар. участием. – СПб., 2012. – С.238.

    11. Тихонович М., Ржавина Е., Ердяков А. Влияние неселективного блокатора циклооксигеназ на общее состояние глаза и сетчатки в моделях воспаления//Современные технологии лечения витреоретинальной патологии. – М., 2013. – С. 191-192.

    12. Ердяков А., Ржавина Е., Тихонович М. Влияние лорноксикама на общее состояние глаза и сетчатки в различных моделях воспаления // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: Материалы V Междунар. науч.-практ. конф., г. Ростов-на-Дону, 3–5 октября 2013 г. – Издательство ЮФУ г. Ростов-на-Дону, 2013. – С. 344–345.

    13. Tikhonovich M., Rzhavina E., Erdyakov A., Gavrilova S. Influence of nonselective cyclooxygenase inhibitor on the overall state of the eye in inflammatory models. // ARVO/ISOCB Ocular Cell Biology Conference. – Oxford, United Kingdom, 2013. – P. 89–89.

    14. Tikhonovich M., Gavrilova S. A rat model of proliferative vitreoretinopathy induced by dispase // 14 th EURETINA – London, United Kingdom, 2014

    15. Тихонович М., Иойлева Е., Гаврилова С. Разработка диспазной модели пролиферативной витреоретинопатии крыс // "Современные технологии в офтальмологии": "Современные технологии лечения витреоретинальной патологии". – 2014. – № 1. – С. 104–105.

    16. Тихонович М., Гаврилова С. Лорноксикам предупреждает развитие пролиферативной витреоретинопатии // Физиология кровообращения: VI Всероссийская с международным участием школа-конференция. – МАКС Пресс Москва, 2016. – С. 157–158.
Патенты РФ
    1. Тихонович. М.В., Лыскин П.В. Способ лечения оперированного незакрывшегося макулярного отверстия. Патент РФ на изобретение №2458656 от 20.08.2012 г.

    2. Тихонович М.В., Гаврилова С.А. Способ моделирования пролиферативной витреоретинопатии у крыс. Патент РФ на изобретение №2558991 от 10.08.2015 г.
Биографические данные
    Тихонович Марина Валерьевна, 1986 года рождения, в 2009 году с отличием окончила факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова по специальности «Лечебное дело».

    С 2009 по 2011 год проходила обучение в клинической ординатуре по специальности «офтальмология» на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. С 2011 по 2012 год обучалась в очной аспирантуре на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. С 2013 по 2016 год обучалась в очной аспирантуре на базе кафедры физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова.

    Автором опубликовано 23 печатных работы, 16 из которых по теме диссертации, получено два патента РФ на изобретение.

    За время обучения в аспирантуре автор принял участие в исполнении работ по четырем грантам, в одном из которых являлся руководителем проекта.

    Также за время прохождения аспирантуры Тихонович М.В. получила четыре награды, одна из которых – стипендия Правительства РФ.

Список сокращений

    ВПС – внутренний плексиформный слой

    ВЯС – внутренний ядерный слой

    мРНК – матричная РНК

    НГС – нейроганглионарный слой

    НПВС – нестероидное противовоспалительное средство

    НПС – наружный плексиформный слой

    НЯС – наружный ядерный слой

    ПВР – пролиферативная витреоретинопатия

    ПЦР – полимеразная цепная реакция

    ПЭС – пигментный эпителий сетчатки

    ЦОГ – циклооксигеназа

    ТА – триамцинолона ацетонид

    ЭС – эпителий слой

    BDNF - нейротрофический фактор роста

    NGF - фактор роста нервов

    VEGF - эндотелиальный фактор роста сосудов


Город: Москва – 2016
Темы: 14.01.07 – глазные болезни
Дата добавления: 01.12.2018 12:29:27, Дата изменения: 01.12.2018 12:29:28