Год
2016

Прогностическая значимость диагностики молекулярно-генетических изменений и их корреляция с клинико-морфологическими характеристиками при увеальной меланоме


Органзации: В оригинале: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России
ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России



Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Общая характеристика работы


Актуальность темы и степень ее разработки
    Увеальная меланома (УМ) - злокачественная внутриглазная опухоль меланоцитарного генеза, представляющая угрозу не только для зрения, но и для жизни пациента. УМ составляет до 88% всех первичных внутриглазных злокачественных новообразований. В России заболеваемость УМ колеблется от 6,23 до 8 человек на 1 млн. взрослого населения в год по обращаемости (Бровкина А.Ф. с соавт., 2002; Саакян С.В. с соавт., 2002). Установлено, что через 5 лет у 50% пациентов с УМ после проведенного лечения диагностированы метастазы в печень (Bergman L. et al, 2006; Barak V. et al, 2011).

    УМ характеризуется агрессивным течением, высокой вероятностью метастазирования и летального исхода. Поиску факторов прогноза течения опухолевого процесса при УМ уделяется особое значение (Boldt H.C., 2006). Доказано, что такие анатомические, клинические и патоморфологические факторы, как локализация опухоли в цилиарном теле, большие размеры опухоли, экстрабульбарный рост, эпителиоидноклеточный (ЭК) и смешанноклеточный (СК) тип УМ и большое число митозов в клетке негативно влияют на витальный прогноз при УМ (Бровкина А.Ф. с соавт., 2000; Ширина Т.В., 2013). Выбор метода лечения также играет роль в выживаемости пациентов (Стоюхина А.С., 2011). В последние годы значимую роль приобретают молекулярно-генетические факторы прогноза, включающие потерю одной копии хромосомы 3 (моносомию хромосомы 3), дупликацию всего плеча хромосомы 8q и 8 и профиль экспрессии генов класса 2 (GEP2) (Манохина И.К., 2009; Prescher G. et al, 1996; Landreville S.A. et al, 2008; Onken M.D. et al, 2004;). Ряд авторов указывают на большее значение молекулярно-генетических факторов в определении метастатического потенциала первичной УМ (Саакян С.В. с соавт., 2013; Harbour J.W., 2009).

    Особое внимание уделяется мутациям в генах при УМ. Так, показана высокая частота мутаций в генах GNAQ/GNA11, отвечающих за дерегуляцию пути MAP-киназы (Van Raamsdonk C.D. et al, 2010). Мутации в пути RAS-RAFMEK-ERK и ассоциированное с ними метилирование гена RASSF1A, метилирование генов-семафоринов (SEMA3B), а также мутации в генах-транспортерах АТФ (ген ABCB1/MDR1) – все эти изменения могут влиять на патогенез УМ (Calipel A. et al, 2011; Landreville S.A. et al, 2011).

    Смертность при УМ остается высокой вследствие метастатической болезни, однако промежуток между диагностикой первичной опухоли и выявлением метастазов даже для пациентов с моносомией 3 может составлять от нескольких месяцев до десятков лет (Ehlers J.P. et al, 2006). На сегодняшний день не выработаны четкие критерии прогнозирования течения неопластического процесса при УМ, а также не разработан алгоритм по раннему выявлению метастатической болезни. Вышеперечисленные меры позволят проводить более эффективную диагностику, а также повысить продолжительность жизни больных УМ. Анализ молекулярно-генетических изменений (МГИ) проводится по ограниченному количеству генетических маркеров, что требует введения дополнительных критериев для оценки данных изменений (мутации в гене GNAQ/GNA11, определение полиморфизма различных аллелей гена ABCB1/MDR1, метилирование генов RASSF1A, SEMA3B и другие).
Цели и задачи исследования
    Цель исследования

    Прогнозирование течения увеальной меланомы на основе анализа герминальных и соматических хромосомных нарушений и мутаций в генах.

    Задачи

    1) Определить общую 5-летнюю онкологическую выживаемость при увеальной меланоме и ее взаимосвязь с соматическими молекулярно-генетическими изменениями (моносомия хромосомы 3, потеря гетерозиготности в хромосоме 1p, метилирование гена RASSF1A);

    2) Определить частоту соматических хромосомных изменений при увеальной меланоме;

    3) Определить герминальных и соматических мутаций в генах при увеальной меланоме;

    4) Выявить клинико-морфологические закономерности течения опухолевого процесса у больных с увеальной меланомой в соответствии с герминальными и соматическими молекулярно-генетическими изменениями;

    5) Выявить клинические, патогистологические и молекулярно-генетические особенности увеальной меланомы с высоким риском метастазирования.
Научная новизна исследования
    1) Определены клинико-морфологические и молекулярно-генетические особенности УМ с высоким риском метастазирования;

    2) Впервые на значительной выборке больных УМ показана частота таких МГИ, как полная и частичная моносомия хромосомы 3, потеря гетерозиготности в хромосомах 1p и 8p, метилирование генов RASSF1A и SEMA3B, мутации в онкогенах GNAQ и GNA11, мутации в различных аллелях гена ABCB1/MDR1.

    3) Проведенный комплексный анализ взаимосвязи вышеперечисленных изменений с клиническими и патогистологическими особенностями УМ позволил выявить благоприятные и неблагоприятные в отношении витального прогноза молекулярно-генетические факторы.

    4) Показана роль моносомии 3 в снижении продолжительности жизни пациентов с УМ, а метилирования гена RASSF1A – в ее увеличении.

    5) Впервые в мире в эксперименте in vivo показана роль генотипов полиморфного гена ABCB1/MDR1 в развитии УМ, при этом установлено, что наличие генотипа CC достоверно свидетельствует о худшем витальном прогнозе.
Практическая значимость
    На основании проведенного исследования доказано, что наличие моносомии 3 наблюдается при неблагоприятном, а метилирования гена RASSF1A – при благоприятном витальном прогнозе. Выполненные исследования показали значимость определения статуса хромосомы 3 и метилирования гена RASSF1A для прогнозирования выживаемости при УМ. Выявление данных МГИ при выполнении энуклеации, блокэксцизии или ТИАБ позволит спрогнозировать течение опухолевого процесса у пациента для определения его витального прогноза.

    Убедительно показана роль гена ABCB1 в развитии УМ и ассоциация пигментации опухоли, высоты опухоли и неблагоприятных морфологических типов УМ с генотипом СС полиморфного маркера C3435T гена АBСB1. Определена высокая частота мутаций в онкогенах GNAQ/GNA11 при УМ. Определение вышеперечисленных изменений в плазме крови пациента с УМ или у человека, находящегося в группе риска, позволяют выявлять УМ на доклинической стадии, а также прогнозировать возможность развития опухоли.
Методология и методы исследования
    Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне ретроспективного и проспективного когортного открытого исследования с использованием клинических, инструментальных, молекулярно-генетических и статистических методов.
Положения, выносимые на защиту
    1. Моносомия хромосомы 3 свидетельствует об ухудшении, а метилирование гена RASSF1A – об улучшении витального прогноза при УМ. Делеция 1р не влияет на витальный прогноз.

    2. С помощью доказательной медицины определены клинические, морфологические и молекулярно-генетические особенности УМ с высоким риском метастазирования.

    3. Проведенный анализ позволил определить частоту герминальных и соматических хромосомных молекулярно-генетических изменений при УМ.

    4. Моносомия хромосомы 3 и генотип СС сайта C3435T гена АBСB1 коррелируют с неблагоприятными прогностическими клиническими и патоморфологическими признаками.
Внедрение результатов исследования
    Результаты данного исследования внедрены в лекционную программу кафедры глазных болезней ФДПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова и в клиническую практику отдела офтальмоонкологии и радиологии МНИИ ГБ им. Гельмгольца для определения витального прогноза у группы пациентов с УМ.
Степень достоверности и апробация результатов
    Степень достоверности проведенных результатов исследования определяется достаточным и репрезентативным объемом выборок исследований и обследованных пациентов с использованием современных инструментальных и молекулярно-генетических методов исследования.

    Основные положения работы доложены и обсуждены на Spring Meeting of the European Ophthalmic Oncology Group (Paris, 2012; Ivalo, 2013; Krakow, 2014), на Научно-практической конференции с международным участием «Российский общенациональный офтальмологический форум» (Москва, 2012, 2013, 2014), на Междисциплинарном конгрессе по заболеваниям органов головы и шеи (Москва, 2013, 2014), Congress of the European Society of Ophthalmology (Copenhagen, 2013), на Межрегиональной видеоконференции молодых ученых "Актуальные вопросы офтальмологии" (Москва, 2014), на XXXVI Итоговой научной конференции ОМУ МГМСУ им. А.И. Евдокимова (Москва, 2014), на межотделенческой конференции ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России (Москва, 2014 год).
Публикации
    По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 7 - в центральной печати, 3 – в зарубежной печати.
Структура и объем диссертации
    Материал диссертации изложен на 135 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, 4 глав (обзора литературы, материала и методов исследования, две главы результатов исследования и их обсуждения), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 15 таблиц, 35 рисунков и 5 графиков. Список литературы включает 172 источника (30 отечественных и 142 зарубежных).

    Диссертация выполнена на кафедре глазных болезней ФДПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова (ректор - заслуженный врач РФ, д.м.н., проф. Янушевич О.О.) и в отделе офтальмоонкологии и радиологии (руководитель – д.м.н., проф. Саакян С.В.) ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России (директор – д.м.н. проф. Нероев В.В.)

Содержание работы


Материал и методы исследования
     Клиническое-инструментальное исследование выполнено у 278 пациентов, которым проведена энуклеация в период 2005 -2007 и 2012 гг. Средний возраст пациентов составил 52,9±11,9 лет. В настоящее исследование включены 134 пациента. Критерием отбора пациентов стало наличие ткани опухоли в базе Института и наличие образцов периферической крови, а также наличие хладагента в момент исследования. Пациенты разделены на 2 группы: ретроспективная – 104 пациента, получивших лечение в период 2005-2007 г., период их наблюдения до 2012 гг., и проспективная группы - 30 пациентов, получивших лечение в 2012 году.

    В ретроспективной группе возраст пациентов составил 22 – 84 года (средний возраст 53,7 ±12,2 лет). Распределение по полу: женщин - 66 (63,4%), мужчин – 38 (36,6%). Срок наблюдения составил 41-84 месяцев (в среднем 60,9 ±8,8 месяцев). В проспективной группе возраст пациентов составил 23 – 72 года (средний возраст 51,3±11,9 лет). Распределение по полу: женщин - 18 (60,0%), мужчины – 12 (40,0 %). Срок наблюдения составил 13-23 месяца (в среднем 17,4±3,1 месяца). Таким образом, обе группы однородные и достоверно различались только по длительности наблюдения.

    Диагностика УМ основывалась на данных стандартного офтальмологического обследования (визометрия, тонометрия, периметрия, биомикроскопия, офтальмоскопия (см. рис.1), гониоскопия). Весь комплекс клинических исследований в проспективной группе выполнен автором самостоятельно. Всем пациентам проводили эхографию глазного яблока. При непрозрачных оптических средах, малых размерах опухоли по показаниям проводили дуплексное сканирование в режиме ЦДК (см. рис.2) (аппарат GE Voluson 730 Pro, ФРГ) совместно с к.м.н., Амирян А.Г. в отделе ультразвуковых методов исследования (руководитель – профессор, д.м.н. Киселева Т.Н.), флюоресцентную ангиографию (к.м.н., Склярова Н.В.), оптическую когерентную томографию (к.м.н., Мякошина Е.Б.) (отдел офтальмоонкологии и радиологии, руководитель – проф., д.м.н. Саакян С.В.) и компьютерную томографию орбит (по стандартной методике по месту жительства). Во всех случаях при проведении патогистологического исследования удаленного глаза по стандартной методике верифицирована увеальная меланома (см. рис. 3 и 4). Исследования проводили совместно с к.м.н. Захаровой Г.П. (отдел патологической анатомии и гистологии глаза , руководитель – проф., д.м.н. Хорошилова И.П.) При сборе анамнеза выясняли факт проживания в местах с неблагоприятной экологической обстановкой, наличие профессиональных вредностей, отягощенной наследственности по онкологическим заболеваниям, сопутствующей патологии, времени от начала появления первых жалоб до обращения к врачу.

    Образцы тканей. После энуклеации пораженного глаза биопсийный материал опухоли и интактной хориоидеи, а также образцы периферической крови (консервант: 0.5М раствор ЭДТА) сохраняли при –20° С. Для исследования образцов ТИАБ материал собирали с цитологических препаратов.

    Исследования у ретроспективной группы пациентов (n=104) проводили на базе лаборатории молекулярной генетики Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (заведующий лабораторией – д.б.н., проф. Залетаев Д.В.) совместно с к.м.н. Скляровой Н.В. (отдел офтальмоонкологии и радиологии МНИИ ГБ им. Гельмгольца, руководитель отдела – профессор, д.м.н. Саакян С.В). У проспективной группы пациентов (n=30) исследования проводили на базе лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии НИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов (заведующий лабораторией – д.б.н., проф. Носиков В.В.) совместно с к.б.н. Логиновым В.И. и Бурденным А.М., по расширенной методике (полная и частичная моносомия 3, метилирование гена SEMA3B, мутации в генах GNAQ и GNA11, полиморфизм гена ABCB1).

     Геномную ДНК из образцов опухолей, условно нормальной хориоидеи и периферической крови выделяли с помощью протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией. При выделении ДНК из цитологических препаратов собранный со стекла материал обрабатывали лизирующим буфером, содержащим протеиназу К и полученный лизат использовали в качестве матрицы для постановки ПЦР. Потерю гетерозиготности (ПГ) в хромосомных районах 1p36, 1р31.3, 3p25.3, 3p21.3, 3p14.2, 3q12, 3q26.3, 3q28 идентифицировали с использованием набора высокополиморфных маркеров. Контролем служила ДНК лейкоцитов периферической крови. Для определения метилирования СpG-островков промоторных областей генов применяли метод метилчувствительной ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК из клеток УМ, предварительно гидролизованную рестриктазами HpaII (для генов RASSF1A, SEMA3B).

    На основе проведенного молекулярно-генетического анализа все пациенты ретроспективной группы (n=104) разделены на 4 подгруппы: 1 группа - с моносомией хромосомы 3 (n=45, 43,3%), 2 группа - с ПГ в хромосоме 1p (n=30, 28,8%), 3 группа – с метилированием гена RASSF1A (n=23, 22,1%) и 4 группа сравнения (n=29, 27,9%), у которых не выявлено ни одного из исследуемых МГИ. Отмечалось сочетание нескольких МГИ у ряда пациентов.

    По степени риска развития метастатической болезни все пациенты ретроспективной группы (n=104) были разделены на 2 подгруппы – с высоким (группа А) и низким (группа Б) риском. Для сравнения при выявлении полиморфизма гена ABCB1 выделена контрольная группа (n=60), которую составили относительно здоровые лица из различных регионов РФ, сопоставимые по полу и возрасту с проспективной группой (n=30).

    Диспансерное наблюдение осуществляли совместно с к.м.н. Амирян А.Г. в соответствии с приказом № 135 МЗ РФ от 19.04.1999 один раз в 3 месяца в течение первого года, затем один раз в 6 месяцев в течение второго года, в дальнейшем – один раз в год во взрослом консультативно-поликлиническом отделении МНИИ ГБ им. Гельмгольца. Пациенты, которые по различным причинам не могли приехать на осмотр, сообщали о себе по телефону, факсу и через родственников путем передачи справок от врачей по месту жительства. Часть данных получена путем запросов в департаменты здравоохранения по месту жительства пациентов.

    Статистическая обработка результатов выполнена автором самостоятельно. Для исследования выживаемости пациентов после лечения использовался статистический метод множительных оценок Каплана-Мейера, а для оценки различия между двумя выборками – двухвыборочный критерий Вилкоксона и регрессионная модель Кокса. Для анализа полученной информации все наблюдения разделены на 2 типа: цензурированные (незавершенные), в которых исход не наступил на момент окончания исследования (пациенты живы), либо пациенты выбыли из исследования (в том числе смерть от других причин) и нецензурированные (завершенные), при которых зафиксирована смерть пациента от метастатической болезни. Статистическую обработку результатов при оценке полиморфизма генов проводили с использованием закона генетического равновесия Харди-Вайнберга для аутосомных признаков. При сравнении частот встречаемости генотипов применяли критерий Пирсона, а для малых выборок – точный критерий Фишера. Комплексную оценку взаимосвязей между исследуемыми группами проводили с использованием логистической регрессии, определяя отношение шансов (OR) с 95%-ным доверительным интервалом (CI) с уровнем значимости принятым равным 0,05. Рассматривали также результаты статистически маргинально значимые (0,05 < P ≤ 0,1), что соответствует доверительному интервалу 94% (в отличие от стандартного доверительного интервала 95% при р = 0,05). Расчеты проводили в пакетах программ для Windows (Microsoft Excel, Statistica 6.1).
Результаты собственных исследований
    Особенности клинико-морфологической картины ретроспективной и проспективной групп

     В ретроспективной группе у 101 (97,1%) пациента проведено ликвидационное лечение (энуклеация), у 3 (2,9%) пациентов по показаниям выполнена блокэксцизия опухоли. У 4 (3,9%) пациентов ликвидационному лечению предшествовало органосохранное (курс брахитерапии с применением Ru/Rh офтальмоаппликаторов). По локализации выделяли меланому ЦХ зоны – 26 пациентов (25,0%), хориоидеи – 67 пациентов (64,4%), радужки – 4 пациента (3,9%) и ИЦХ зоны – 7 пациентов (6,7%).

    В проспективной группе у всех 30 пациентов проведена энуклеация. У 2 пациентов (6,7%) ликвидационному лечению предшествовало органосохранное (курс брахитерапии с применением Ru/Rh офтальмоаппликаторов в комбинации с транспупиллярной термотерапией). По локализации выделяли меланому ЦХ зоны – 5 пациентов (16,7%), хориоидеи – 22 пациента (73,3%) и ИЦХ зоны – 3 пациента (10,0%).

    При оценке клинической картины исследовали такие параметры, как возраст и пол пациента, высота и диаметр основания опухоли, гистологический тип, вовлечение в процесс ЦТ, наличие пигментации, гемофтальма, отслойки сетчатки, субретинального экссудата, видимых собственных сосудов опухоли, экстрабульбарного роста и отягощенного семейного анамнеза по онкопатологии. В проспективной группе изучали также параметры акустической плотности, выраженной в условных единицах, в различных отделах опухоли , и ее усредненное значение. В ретроспективной группе выявляли высокую долю УМ с вовлечением ЦТ (35,6%) и вторичной отслойкой сетчатки (71,1%). В проспективной группе доля УМ с экстрабульбарным ростом выше, чем в ретроспективной (16,7% против 10,6%). Также отмечали более высокую частоту отягощенного семейного анамнеза по онкологической патологии (36,7% против 18,3% в ретроспективной группе).

    Ассоциация клинико-морфологических особенностей с молекулярно-генетическими изменениями в клетках УМ

    В 13,5% случаев (n=14) определяли наличие у одного пациента как моносомии 3, так и ПГ в хромосоме 1р. В 5,8% случаев (n=6) выявлены моносомия 3 и метилирование гена RASSF1A. Сочетание ПГ в хромосоме 1р и метилирования гена RASSF1A у одного пациента обнаружено у 8,7% исследуемых (n=9). Наконец, сочетание трех МГИ выявлено у двоих пациентов (1,9%).

    Статистически значимые (p<0,05) ассоциации удалось выявить при сопоставлении пациентов из группы 1 и гистологических типов опухоли. Для данной группы характерно преобладание прогностически неблагоприятных типов – СК и ЭК (77,8%). Анализ ассоциаций гистологических типов УМ с опухолями из групп 2, 3 и 4 не выявил значимых отличий между различными типами УМ. В группе 4 отмечали преобладание веретеноклеточного (ВК) типа УМ (более 65%), что может косвенно свидетельствовать об относительно благоприятном течении процесса, значения статистически значимы (p<0,05). Несмотря на отсутствие МГИ в группе 4 частота ЭК и СК типов УМ составила 34,5%. Распределение типов УМ во всех группах представлено на рис. 5.

    Также в группе 1 выявлена ассоциация с вовлечением ЦТ в опухолевый процесс, фактором, ухудшающий витальный прогноз, что подтверждается в большинстве исследований (Damato B., 2007; Damato B. et al., 2009). В данной группе наблюдали больше половины (51,1%) пациентов с ЦХ и ИЦХ локализацией УМ, при этом ассоциация статистически значима (p=0,038). Данное отличие представляется значимым по сравнению с группами 2, 3 и 4, а также общей когортой пациентов, где преобладали новообразования хориоидальной локализации без вовлечения ЦТ. В группе 2 выявлена значимая ассоциация с экстрабульбарным ростом опухоли, одним из наиболее неблагоприятных прогностических факторов, увеличивающих вероятность развития метастатической болезни. Частота данного признака в группе 2 была максимальной по сравнению с другими группами и составила 16,7%. В группе 3 статистически значимых ассоциаций с клиническими и морфологическими группами не выявлено.

    Выживаемость больных УМ в зависимости от молекулярно-генетических изменений

     Работа выполнена совместно с к.м.н. Амирян А.Г. под руководством проф., д.м.н. Саакян С.В. При анализе общей пятилетней выживаемости пациентов ретроспективной группы (n=104) смертность составила 30,8% (n=32), при этом учитывалась только смертность от метастатической болезни (группа А). Живые на момент исследования (n=65, 62,5%) и умершие по другим причинам (n=7, 6,7%) составили 69,2% от общего количества пациентов в исследуемой группе (группа Б). Средний срок наблюдения в общей гр уппе пациентов составил 60,1±9,30 месяца, при этом средняя продолжительность жизни пациентов от ликвидационного хирургического лечения до гибели вследствие метастатической болезни – 62,9±10,10 месяца. Следует отметить, что в исследование вошли пациенты с «большими» УМ (средняя высота опухоли – 9,3±2,7 мм, диаметр основания – 15,7±3,6 мм). Отдельный интерес представляло изучение кумулятивной доли выживших в группе 1 (с моносомией 3) (n=45) по сравнению с группой без моносомии (n=59) (см. Рис. 6). Анализ данных показал, что в группе 1 смертность от метастатической болезни превысила выживаемость (53,2% против 46,8%, p=0,0005), что свидетельствует о значимой роли моносомии 3 в выживаемости пациентов с УМ.

    При анализе выживаемости в группах 2 (n=30) и в группе без ПГ в хромосоме 1р (n=74), смертность в группе 2 составила 36,7%, а в группе без ПГ – 28,4%. Различия в выживаемости в двух подгруппах не были статистически значимыми (p=0.064), что свидетельствует об отсутствии роли ПГ в хромосоме 1р в витальном прогнозе при УМ. Схожие данные получены при сопоставлении пациентов из группы 3 (n=23) и группы без метилирования (n=81) (смертность 26,1% и 32,1%, соответственно). Следует отметить, что в отличие от группы 2 данные различия статистически достоверны (p=0,037 по регрессионной модели Кокса), что свидетельствует о более благоприятном характере течения опухолевого процесса в новообразованиях с метилированием гена RASSF1A.

    В группе пациентов с сочетанием моносомии 3 и ПГ в хромосоме 1р (n=12) смертность составила 75%, что значительно превышает общую онкологическую смертность (p=0,001). При сочетании моносомии 3 и метилирования гена RASSF1A (n=6) мы выявляли смертность в двух третях случаев, то есть в 67,0% (p=0,03), а при сочетании ПГ в хромосоме 1р и метилирования гена RASSF1A (n=9) – в 22,2% случаев (p=0,068). Из двух пациентов, имевших все три МГИ, один умер от метастатической болезни через 51 месяц после лечения. Таким образом, сочетание МГИ при УМ ухудшает витальный прогноз.

    Проведен анализ выживаемости в группе пациентов с наличием хотя бы одной из исследуемых МГИ (n=75) и в группе 4 (n=29) (см. рис. 7). В группе пациентов с наличием МГИ выживаемость составила 62,7%, что несколько ниже, чем в общей когорте пациентов (69,2%). При этом в группе 4 выживаемость существенно выше и составила 86,2% (p=0,057), что обусловлено как отсутствием вышеупомянутых МГИ, так и преобладанием более благоприятных клеточных типов УМ (65,5% ВК меланом).

    При построении модели Кокса мы рассматривали влияние моносомии 3, ПГ в хромосоме 1р, метилирования гена RASSF1A, а также отсутствие любого из вышеупомянутых изменений на выживаемость (см. табл. 1). Наиболее значимый вклад в снижение выживаемости (t=3,47; p=0,0005) вносит наличие моносомии 3. ПГ в хромосоме 1р не оказывает статистически значимого влияния на выживаемость. Метилирование гена RASSF1A достоверно увеличивает выживаемость пациентов с УМ (t=-2,08; p=0,037). Отсутствие исследуемых МГИ также достоверно улучшает прогноз (t=-1,9; p=0,057). Клинические, патоморфологические и молекулярно-генетические особенности УМ с высоким риском метастазирования

     Работа выполнена совместно с к.м.н. Амирян А.Г. под руководством проф., д.м.н. Саакян С.В. Для выявления особенностей УМ у пациентов с метастатической болезнью по сравнению с группой контроля проведен анализ клинических, патогистологических и молекулярно-генетических характеристик. Пациенты, умершие в результате метастатической болезни, составили 30,8% (n=32, Группа А) от общего количества больных; пациенты, живые на момент исследования или умершие по другим причинам составили 69,2% (n=72, Группа Б).

    Средний возраст на момент начала лечения в группе А составил 56±9,4 лет, а в группе Б – 52±8,8 года. По полу и возрасту группы статистически не различались. Также не выявлено статистически значимых отличий между группами по таким параметрам, как высота и диаметр основания опухоли. Необходимо отметить, что в исследование вошли пациенты с «большими» УМ (средняя высота опухоли 9,3±2,7 мм) и соответствующими показаниями для проведения энуклеации. Таким образом, в данном исследовании не представляется возможным оценить роль размеров УМ как прогностического фактора в связи с однородностью выборки.

    Статистически значимые различия между группами выявлены в распределении патогистологических типов опухоли. Так, в группе А частота ВК типов УМ, характеризующихся наиболее благоприятным течением опухолевого процесса, на 12,9% меньше чем в группе Б и составила 34,3%. В то же время количество пациентов с неблагоприятными типами УМ (СК и ЭК) в группе А составило 2/3 (n=21; 65,7%) от общего количества пациентов в группе. Следует отметить, что доля ЭК УМ в обеих группах (А и Б) отличалась (21,9% и 20,8%, соответственно). В группе А доля УМ с вовлечением в опухолевый процесс цилиарного тела (ЦХ и ИЦХ локализации) достоверно выше, чем в группе Б (43,8% против 30,6%, см. рис. 8). Данный признак, как показано в ряде исследований, относится к наиболее неблагоприятным в отношении витального прогноза (Damato B., 2007; Damato B. et al., 2009).

    При сопоставлении двух групп по таким клиническим признакам, как наличие пигментации, гемофтальма, вторичной отслойки сетчатки, субретинального экссудата и видимых собственных сосудов, статистически значимые различия не выявлены. Необходимо отметить, что разница между группами А и Б по наличию вторичной отслойки сетчатки составила 17,4% (56,2% и 73,6%, соответственно), однако данная закономерность может носить случайный характер. При статистической обработке результатов оценки клинических параметров у пациентов учитывался такой фактор, как прозрачность сред глаза.

    Отдельный интерес представляет ассоциация с развитием метастатической болезни такого неблагоприятного фактора, как наличие экстрабульбарного роста. Большинство авторов рассматривают экстрабульбарный рост опухоли как фактор, значительно ухудшающий витальный прогноз (Gamel G.W. et al., 1992; Harbour J.W., 2009; McLean I.W. et al., 2004). Анализ пациентов из групп А и Б не выявил статистически значимых отличий между группами (p=0,074), при этом частота УМ с наличием экстрабульбарного роста в группах статистически не различалась (12,5% и 9,7%, соответственно; p=0,079). При более детальном анализе размеров экстрабульбарного роста показано, что в группе А из 4-х случаев в 3-х выявлены большие узлы размерами до 9х7 мм, а в одном – небольшие скопления клеток, в то время как в группе Б в 5 случаях из 7 обнаруживали небольшие экстрабульбарные узлы размерами до 1х2 мм.

    При сопоставлении различных нозологических форм онкологической патологии у родственников пациентов с УМ в группах А и Б выявлены значимые (p=0.002) отличия между группами. Так, процент отягощенного семейного онкологического анамнеза в группе А составил 31,2%, а в группе Б – 12,5%. Данные различия могут свидетельствовать о значимости семейного фактора в развитии метастатической болезни при УМ. В литературе данный фактор остается несколько недооцененным в связи с его субъективностью.

    Наибольшие различия между двумя группами получены при анализе статуса хромосомы 3. Так, доля УМ с моносомией 3 в группе А превысила таковую в группе Б практически в 3 раза (78,1% против 27,8%). Данные различия статистически значимы (p=0,0001). Несмотря на некоторое преобладание УМ с ПГ в хромосоме 1р в группе А (34,3% против 26,4%), отличия статистически незначимы (p>0,05). Вместе с тем доля УМ с метилированием гена RASSF1A в группах А и Б различалась и составила 18,8% и 23,6% соответственно (p=0,04), что свидетельствует о положительной роли данного фактора в развитии УМ. Отсутствие какого-либо из исследуемых МГИ выделено как отдельный прогностический фактор. При сопоставлении пациентов из группы А и Б выявлены статистически значимые различия между группами (p=0,035). Так, в группе А доля пациентов с отсутствием исследуемых МГИ составила 12,5%, в то время как в группе Б – 34,7%.

    Таким образом, для пациентов с УМ с высоким риском метастазирования характерно наличие больших размеров экстрабульбарных очагов, большая частота УМ с вовлечением цилиарного тела, преобладание СК и ЭК увеальных меланом и моносомии 3. У пациентов с УМ с низким риском метастазирования достоверно чаще отмечается метилирование гена RASSF1A.

    Влияние мутаций в онкогенах GNAQ/GNA11 на клинические и морфологические характеристики УМ

     Исследование выполнено совместно с к.б.н. Логиновым В.И. и Бурденным А.М. При ПДРФ-анализе мутации в генах GNAQ и GNA11 выявлены у 27 (90,0%) из 30 обследованных пациентов. Как следует из данных, представленных в таблице 2, мутации в 5 экзоне в гене GNAQ найдены у 5 пациентов (16,7%), в гене GNA11 у 50% обследованных пациентов. В 4 экзоне в гене GNAQ у 12 (40%) пациентов найдены гомозиготные мутации. В 4 экзоне гена GNA11 мутаций не найдено. В 93% случаев (25/27) мутации глутамина в 209-м положении и аргинина в 183-м положении в генах GNAQ и GNA11 взаимоисключающие, что согласуется с данными литературы (Van Raamsdonk C.D. 2009, 2010).

    В 3 случаях из 27 выявлены одновременно две мутации. В случае мутации в паре GNAQ (Gln209)/ GNA11 (Gln209) опухоль имела ЦХ локализацию. В другом случае при выявлении мутации в паре GNAQ (Arg183)/ GNAQ (Gln209) опухоль имела СК тип строения, у пациента присутствовал отягощенный семейный анамнез (у матери выявлен рак молочной железы). В третьем случае, при наличии мутаций в паре GNAQ (Arg183)/ GNA11 (Gln209) опухоль располагалась в хориоидее и имела СК тип строения. В одном случае удалось выявить 3 мутации в генах GNAQ (Arg183)/ GNAQ (Gln209)/ GNA11 (Gln209). У данного пациента опухоль располагалась также в хориоидее и имела ВК тип строения.

    В литературе активно обсуждается роль мутаций в генах GNAQ и GNA11 как механизмов, запускающих опухолевый процесс при УМ (Van Raamsdonk C.D. et al., 2009, 2010; Bauer J. et al., 2009). В нашем исследовании проведена оценка ассоциаций между мутациями в генах GNAQ и GNA11 и комплексом клинических и патоморфологических характеристик. Определена статистически значимая ассоциация частоты мутации глутамина в 209-м положении гена GNAQ с высокой отслойкой сетчатки (4/11 против 1/19, p=0,0472), в то время как с другими клиническими признаками значимых связей не выявлено. Частота мутации в экзоне 5 гена GNA11 в опухоли ВК типа 2,8 раза выше, чем ЭК типа (9/16, 56% против 1/5, 20%).

    Ассоциация мутаций в гене ABCB1/MDR1 с риском развития УМ

    Исследование выполнено совместно с к.б.н. Логиновым В.И. и Бурденным А.М. Впервые в эксперименте in vivo проведен анализ мутаций в генн ABCB1 при УМ. Распределение частот аллелей и генотипов сайта C3435T гена АBСB1 в контрольной группе и группе больных УМ представлено в таблице 3. В 80% случаев выявлен аллель С, что свидетельствует о высокой специфичности данного аллеля для УМ. При этом в опытной группе аллель С встречался почти в 2 раза чаще, чем в контрольной (80% против 41,7%). Показана достоверная ассоциация предрасполагающего генотипа СС гена АBСB1 с риском развития УМ. Так, частота данного генотипа в проспективной группе (n=30) оказалась в 4 раза выше по сравнению с группой контроля (n=60), в тоже время генотип ТТ у больных обнаружен не был. Ассоциация генотипа CТ с риском развития УМ отмечалась в 40% случаев от общего количества аллелей С, тем не менее, данная ассоциация статистически не значима (p>0,05). Можно предположить, что наличие аллеля С является неблагоприятным фактором при развитии УМ, в то время как аллель Т можно рассматривать как благоприятный фактор.

    Корреляция частот генотипов СТ и СС сайта C3435T гена АBСB1 с параметрами прогрессии УМ представлены на рис. 9.

Выводы

    1) Выявлено, что общая 5-летняя онкологическая выживаемость при УМ составила 69,2%. Наличие моносомии хромосомы 3 значимо снижает выживаемость до 46,8% (p=0,0005). Значимых различий в выживаемости при наличии потери гетерозиготности в хромосоме 1р и в группе сравнения не выявлено. Выживаемость при наличии метилирования гена RASSF1A значимо выше, чем в группе сравнения, и составила 73,9% (p=0,037).

    2) Установлена частота герминальных и соматических хромосомных и генных нарушений у больных увеальной меланомой: моносомия хромосомы 3 – 52,2% (полная - 37,3%, частичная - 14,9%), потеря гетерозиготности в хромосоме 1р – 29,1%, в хромосоме 8р – 20,0%; метилирование гена RASSF1A -23,9%, мутации в генах GNAQ/ GNA11 – 90,0%. Метилирование гена SEMA3B ни в одном из исследуемых образцов не выявлено, генотип СС сайта С3435Т гена ABCB1 выявлен в 60,0%, генотип СТ – в 40,0% случаев, генотип ТТ не выявлен.

    3) Выявлена группа неблагоприятных для витального прогноза при увеальной меланоме молекулярно-генетических факторов: взаимосвязь между цилиарной локализацией опухоли (51,1%; p=0,024), эпителиоидноклеточным и смешанноклеточным гистологическими типами увеальной меланомы (26,7% и 51,1%, соответственно; p=0,0384) и моносомией хромосомы 3 (p=0,001). Доказано, что экстрабульбарный рост увеальной меланомы значимо чаще сопровождается наличием потери гетерозиготности в хромосоме 1р (16,7%, р=0,04). Впервые удалось установить, что высота опухоли (р=0,0391), эпителиоидноклеточный и смешанноклеточный гистологические типы увеальной меланомы (p=0,0493) и умеренная пигментация опухоли (p=0,05) коррелируют с генотипом СС сайта С3435Т гена ABCB1.

    4) Установлен ряд молекулярно-генетических факторов, улучшающих витальный прогноз при увеальной меланоме. Прогностически наиболее благоприятный веретеноклеточный тип увеальной меланомы значимо чаще отмечался при наличии метилирования гена RASSF1A (р=0,023) и мутации в экзоне 5 гена GNA11 (р=0,03). Показано, что небольшая высота опухоли (7,4±1,4 мм; р=0,039), низкая встречаемость экстрабульбарного роста (6,2%; р=0,044) и сниженные значения акустической плотности в области верхушки опухоли (80,3±14,2 у.е.; р=0,041) коррелировали с метилированием гена RASSF1A. Ни в одном из исследуемых образцов увеальной меланомы нам не удалось обнаружить генотип ТТ сайта С3435Т гена ABCB1.

    5) Выявлено, что для больных увеальной меланомой с высоким риском метастазирования характерно наличие моносомии хромосомы 3 (78,1%, р=0,0001), преобладание смешанноклеточного и эпителиоидноклеточного варианта опухоли (65,7%, р=0,018), более высокая частота увеальной меланомы с вовлечением цилиарного тела (p=0,026), а также увеличенные размеры экстрабульбарных узлов (р=0,034).

Практические рекомендации

    1) При выявлении в ходе офтальмологического обследования пациентов таких признаков, как вовлечение в опухолевый процесс цилиарного тела и/или экстрабульбарного роста увеальной меланомы рекомендуется проведение молекулярно-генетического анализа на моносомию 3 и потерю гетерозиготности в хромосоме 1р, что свидетельствует о худшем витальном прогнозе.

    2) При сомнении в патогистологическом диагнозе или для проведения дифференциального диагноза рекомендуется комплексный молекулярно-генетический анализ полученного материала, включающий оценку статуса хромосом 3, 1р и 8.

    3) Для проведения скрининга лиц из группы риска (родственники пациентов с увеальной меланомой) рекомендуется проведение анализа статуса таких генов, как RASSF1A, ABCB1, GNAQ/GNA11. Определение последних двух маркеров возможно в лейкоцитах периферической крови.

    4) Создание генетических лабораторий при крупных офтальмоонкологических центрах и обучение персонала генетических лабораторий общего профиля для работы с образцами опухолей глаза и придаточного аппарата.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

    1. Saakyan S.V. Histopathological findings correlating with monosomy 3 and RASSF1A methylation in uveal melanoma / S.V. Saakyan, A.G. Amiryan, A.Yu. Tsygankov, N.V. Sklyarova // OOG 2013 Ivalo Spring Meeting Abstract book p.12.

    2. Saakyan S. Prognostic value of monosomy 3 and RASSF1A methylation in uveal melanoma / S. Saakyan, A. Amiryan, A. Tsygankov, N. Sklyarova // Congress of the European Society of Ophthalmology (SOE) 8–11 June, 2013, Copenhagen, Denmark - Abstract Book p.148.

    3. Саакян С.В. Молекулярно-генетические нарушения при увеальной меланоме / С.В. Саакян, А.Г. Амирян, А.Ю. Цыганков, Н.В. Склярова // Онкохирургия. – 2013. – Том 5. - спецвыпуск №1. - Стр.117.

    4. Саакян С.В. Мутации в онкогенах GNAQ и GNA11 у больных увеальной меланомой / С.В. Саакян, А.Г. Амирян, А.Ю. Цыганков, В.И. Логинов, А.М. Бурденный // Сборник научных трудов VI Российского общенационального офтальмологического форума. - М. - 2013. - Т.2. - стр. 543-546.

    5. Саакян С.В. Особенности клинического течения и витальный прогноз при увеальной меланоме у пациентов молодого возраста / С.В.Саакян, А.Г. Амирян, А.Ю. Цыганков // Вестник офтальмологии. – 2013. - №6. - стр. 4-9.

    6. Цыганков А.Ю. Ассоциация гена ABCB1 с риском развития увеальной меланомы у российских пациентов / А.Ю. Цыганков, С.В. Саакян // Сборник тезисов 36 итоговой научной конференции ОМУ МГМСУ им. А.И. Евдокимова. – 2014. - стр. 162-163.

    7. Саакян С.В. Мутации в онкогенах GNAQ и GNA11 у больных увеальной меланомой / С.В. Саакян, А.Г. Амирян, А.Ю. Цыганков, В.И. Логинов, А.М. Бурденный // Молекулярная медицина. – 2014. - №2. - стр. 34-37.

    8. Saakyan S.V. GNAQ/GNA11 mutations and ABCB1/MDR1 polymorphism in uveal melanoma: association with clinical and morphological features / S.V. Saakyan, A.G. Amiryan, A.Yu. Tsygankov, V.I. Loginov, A.M. Burdenny // OOG 2014 Krakow Spring Meeting Abstract book p.23.

    9. Цыганков А.Ю. Взаимосвязь полиморфизма гена ABCB1/MDR1 с клинико-морфологическими характеристиками при увеальной меланоме / А.Ю. Цыганков, С.В. Саакян, А.Г. Амирян, В.И. Логинов, А.М. Бурденный // Онкохирургия. - 2014. -т.6. - стр.65-66.

    10. Цыганков А.Ю. Влияние молекулярно-генетических изменений на прогноз при увеальной меланоме / А.Ю. Цыганков, С.В. Саакян, А.Г. Амирян, В.И. Логинов, А.М. Бурденный // Онкохирургия. - 2014. - т.6. - стр.66-67.

    11. Саакян С.В. Ассоциация гена ABCB1 с риском развития увеальной меланомы / С.В. Саакян, А.Г. Амирян, А.Ю. Цыганков, В.И. Логинов, А.М. Бурденный // Архив патологии. – 2014. - №2. - стр. 3-7.

    12. Цыганков А.Ю. Роль молекулярно-генетических факторов в выживаемости пациентов с увеальной меланомой цилиохориоидальной локализации / А.Ю. Цыганков, С.В. Саакян, А.Г. Амирян // Медицинский вестник Башкортостана. – 2014. – т. 9. -№2. - стр. 147-150.

    13. Саакян С.В. Мутации в генах GNAQ и GNA11 и полиморфизм гена ABCB1/MDR1 при увеальной меланоме / С.В. Саакян, А.Ю. Цыганков, А.Г. Амирян, В.И. Логинов, А.М. Бурденный // Сборник научных трудов VII Российского общенационального офтальмологического форума. - М. - 2014. – т. 1. - стр. 257-261.

Список сокращений

    УМ – увеальная меланома

    МГИ – молекулярно-генетические изменения

    ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

    ПЦР – полимеразная цепная реакция

    MAPK – митоген-активируемый протеин-киназный путь

    GNAQ – гуаниновый нуклеотид-связывающий протеин

    ОКТ – оптическая когерентная томография

    ТИАБ – тонкоигольная аспирационная биопсия

    ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота

    ПГ – потеря гетерозиготности

    ЦТ – цилиарное тело

    ЦХ – цилиохориоидальный

    ИЦХ - иридоцилиохориоидальный

    ПДРФ – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

    Arg – аргинин

    Gln – глутамин



Город: Москва – 2016
Темы: 14.01.07 – глазные болезни
Дата добавления: 01.12.2018 12:29:49, Дата изменения: 01.12.2018 12:29:50

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракци...

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационал...

Федоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практичес...

Актуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная ...

Современные тенденции развития офтальмологии - фундаментально-прикладные аспекты Всероссийская научно-практическая конференцияСовременные тенденции развития офтальмологии - фундаментальн...

Восток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологии

Академия ZiemerАкадемия Ziemer

Белые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Международного офтальмологического конгрессаБелые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Междун...

Новые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно-практическая конференцияНовые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии – 2019 ХVII Всероссийская научно-практическаяконференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии –...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2019»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Роговица III. Инновации  лазерной коррекции зрения и кератопластикиРоговица III. Инновации лазерной коррекции зрения и кератоп...

ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты»ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вме...

Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и иммунодефицитные заболевания»Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и ...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

«Живая» хирургия в рамках конференции  «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»«Живая» хирургия в рамках конференции «Современные технолог...

Сателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенациональ...

Федоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическ...

Актуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная...

Восток – Запад 2018  Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2018 Международная конференция по офтальмологии

«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»

Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Между...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизонты -  2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизон...

Сателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКОСателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКО

Top.Mail.Ru


Open Archives