Онлайн доклады

Онлайн доклады

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической  конференции офтальмологов

Конференция

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической конференции офтальмологов

ХVII Ежегодный конгресс  Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Конгресс

ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Конференция

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Симпозиум

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Симпозиум

Сложные и нестандартные случаи в хирургии катаракты. Видеосимпозиум в формате 3D

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

Симпозиум

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Конференция

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Оренбургская конференция офтальмологов - 2020 XXXI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новые технологии в офтальмологии. VIII Всероссийская научно-практическая конференция посвященная дню рождения академика С.Н. Федорова

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Международный вебинар по глаукоме в области медико-хирургического лечения

Новейшие и инновационные подходы в медико-хирургическом лечении глаукомы

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2020 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVI Международного офтальмологического конгресса

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые возможности оборудования NIDEK для диагностики патологии глазного дна

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Новые технологии лазерной рефракционной хирургии

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Конференция

Лечение глаукомы: Инновационный вектор

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Роговица IV. Диагностика и лечение. Научно-практическая конференция с международным участием

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической  конференции офтальмологов

Конференция

«Живая хирургия» в рамках XXVII научно-практической конференции офтальмологов

ХVII Ежегодный конгресс  Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Конгресс

ХVII Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты. Семнадцать мгновений зимы»

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Конференция

Пироговский офтальмологический форум. Ежегодная научно-практическая конференция

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

Симпозиум

Школа рефракционного хирурга. Сателлитный симпозиум компании «Алкон»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

«Живая хирургия» компании «НанОптика»

Все видео...
Год
2016

Гемодинамические и морфологические изменения в тканях глаза при регионарной ишемии-реперфузии и возможности их коррекции (экспериментальное исследование)


Органзации:
В оригинале: ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней им Гельмгольца»



Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Общая характеристика работы


Актуальность темы
    Ретинальная ишемия - частая причина снижения и потери зрения, развивающаяся на фоне сосудистых заболеваний (окклюзии ретинальных сосудов, диабетической ретинопатии, оптической нейропатии и т. д.) (Курышева Н. И. и соавт., 2012; Шеремет Н. Л. и соавт., 2012; Нероев В. В. и соавт., 2013; Sun C. et al, 2013). В связи с этим остаётся актуальным вопрос изучения ишемического поражения сетчатки в эксперименте у животных для более глубокого понимания патогенеза и выбора методов лечения данной патологии.

    Известно, что транзиторные нарушения кровообращения глаза включают два периода: отсутствие кровотока (ишемия) и его восстановление (реперфузия), которые являются частью одного патологического процесса – ишемии-реперфузии. В период реперфузии образуются активные формы кислорода, высвобождаются воспалительные интерлейкины, что ведет к повреждению мембран клеток, миграции лейкоцитов в очаг воспаления с усилением повреждения тканей (Carden D. L., Grander D. N., 2000).

    Для создания экспериментальной модели транзиторной ишемии сетчатки используют окклюзию церебральной артерии, лигирование сонных артерий, фотокоагуляцию ретинальных сосудов и введение эндотелина-1 (Гундорова Р. А. и соавт., 2008; Каламкаров Г. Р. и соавт., 2008; Steele E. C. et al, 2008; Ueda K. et al, 2010; Yuan Y-Z., 2010). В зарубежных публикациях представлено моделирование ишемического поражения, основанного на повышении внутриглазного давления (ВГД) выше уровня системного артериального давления (Joachim S. C., 2011; Suk-Yee Li et al, 2011; Zhang Z. et al, 2012, Liu X. Q. et al, 2013). До сих пор ведётся поиск наиболее адекватной экспериментальной модели ишемии-реперфузии глаза, отвечающей требованиям одновременно высокой экономичности, воспроизводимости и эффективности. Создание такой модели позволит исследовать гемодинамические, нейротрофические и структурные изменения в сетчатке в постишемическом периоде, что является необходимым для понимания патогенеза и определения новых направлений терапии ретинальной ишемии.

    В настоящее время продолжается разработка и внедрение различных способов медикаментозной коррекции ишемического-реперфузионного повреждения глаза (Liu X. Q. et al, 2012; Tong N. et al, 2012; Vin A. P. et al., 2012; Chan C. M. et al, 2013; Huang W. et al., 2013).

    Внимание клиницистов в последние годы привлекает ряд положительных эффектов антиоксиданта ресвератрола, который применяется в лечении сердечно-сосудистых, нейродегенеративных, метаболических расстройств. В экспериментальных исследованиях за рубежом наряду с антиоксидантным действием продемонстрированы противовоспалительные и антиангиогенные свойства ресвератрола (Hua J. et al., 2011; Petrovski G. et al., 2011; Vang O. et al., 2011). Рядом авторов установлены нейропротекторные свойства ресвератрола на основании морфофункциональных методов исследования при моделировании ишемии-реперфузии сетчатки (Li C. et al., 2012; Liu X. Q. et al., 2012; Kim S. H. et al., 2013; Vin A. P. et al, 2013). Однако влияние этого антиоксиданта на регионарную гемоциркуляцию и нейротрофические факторы сетчатки специальному исследованию не подвергалось.
Цели и задачи исследования
    Цель. Изучить особенности глазного кровотока, нейротрофические и морфологические изменения в тканях глаза и возможность их коррекции при моделировании регионарной ишемии-реперфузии в эксперименте на крысах.

    Задачи

    1. Разработать в эксперименте на крысах модели регионарной ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД и с использованием субконъюнктивальной инъекции раствора эндотелина-1.

    2. С помощью ультразвукового исследования сосудов орбиты в режиме трёхмерной реконструкции и энергетического картирования разработать в эксперименте 3D схему кровоснабжения глаза крысы.

    3. Изучить особенности гемодинамики в сосудах глаза в эксперименте на крысах в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании регионарной ишемии-реперфузии глаза.

    4. Исследовать динамику основных маркеров клеточного апоптоза, нейротрофических и воспалительных факторов в сыворотке крови и тканях оболочек глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании регионарной ишемии-реперфузии.

    5. Изучить морфологические изменения в тканях оболочек глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии-реперфузии в эксперименте на крысах.

    6. Изучить влияние ресвератрола на гемодинамические, нейротрофические и структурные изменения в тканях глаза в эксперименте при моделировании регионарной ишемии-реперфузии.
Научная новизна исследования
    В эксперименте на крысах созданы новые модели регионарной ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД при введении воздуха в переднюю камеру и с использованием субконъюнктивальной инъекции раствора эндотелина-1.

    Разработана 3D схема кровоснабжения глаза крысы на основании 3D реконструкции изображения сосудистых структур орбиты в режиме энергетического картирования.

    Впервые с использованием комплекса инструментальных, лабораторных и морфологических исследований определены ишемически-реперфузионные изменения в тканях глаза у крыс при моделировании регионарной ишемии-реперфузии глаза путем повышения ВГД и с использованием субконъюнктивальной инъекции раствора эндотелина-1.

    Впервые изучены особенности глазного кровотока у крыс при моделировании регионарной ишемии-реперфузии в тканях глаза в раннем и позднем постишемическом периоде.

    Впервые в эксперименте на крысах определены маркёры апоптоза, нейротрофические и воспалительные факторы в норме и их изменения в сыворотке крови и тканях оболочек глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании регионарной ишемии-реперфузии.

    Установлено положительное влияние ресвератрола на гемодинамику в сосудах глаза. На модели регионарной ишемии-реперфузии у крыс доказаны ретинопротекторные, нейропротекторные и противовоспалительные свойства ресвератрола при длительном его применении (от 1 до 2 месяцев).
Теоретическая и практическая значимость
    1. Созданы экспериментальные модели регионарной ишемии-реперфузии глаза для изучения патогенеза и разработки методов лечения ишемической патологии сетчатки. Полученные модели являются простыми, легко воспроизводимыми и не требуют дорогостоящего оборудования.

    2. На основании гемодинамических, лабораторных и патоморфологических исследований получены данные об особенностях течения раннего и позднего постишемического периода при регионарной ишемии-реперфузии глаза, которые позволят разработать в клинической практике более четкие алгоритмы ведения пациентов с сосудистой патологией глаза.

    3. Экспериментальное обоснование эффективности длительного перорального применения антиоксиданта ресвератрола является основанием для последующего изучения его применения в клинической практике при ишемических поражениях глаза.
Методология и методы исследования
    Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне экспериментального исследования с использованием инструментальных, морфологических и статистических методов
Основные положения, выносимые на защиту
    1. Создание в эксперименте на крысах двух моделей регионарной ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД и субконъюнктивального введения раствора эндотелина-1.

    2. Регистрация нарушений гемодинамики в орбитальных сосудах в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии-реперфузии глаза и возможность их коррекции ресвератролом.

    3. Доказательство нейротрофических и воспалительных изменений в тканях глаза (активация системы проницаемости митохондриальных мембран, клеточного апоптоза и увеличение концентрации маркеров воспаления в комплексе сетчатка- хориоидея) в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии-реперфузии и возможность их коррекции ресвератролом.

    4. Доказательство морфологических изменений в тканях переднего и заднего отрезка глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии-реперфузии и возможность их коррекции ресвератролом.

    5. Установлено положительное влияние длительного перорального применения антиоксиданта ресвератрола на состояние глазного кровотока, нейротрофические и структурные изменения в тканях глаза при экспериментальной регионарной ишемии-реперфузии.
Степень достоверности и апробация результатов
    Степень достоверности и апробация результатов определяется репрезентативным объёмом выборки исследований, выполненных с использованием современных методов обследования и применением корректных методов статистической обработки.

    Работа прошла апробацию на межотделенческой конференции ФГБУ МНИИ ГБ им. Гельмгольца Минздрава России. Основные материалы диссертационной работы доложены на научно-практических конференциях: SIDUO XXV Конгресс (Германия, Берлин 2014); Международный офтальмологический конгресс «Белые ночи» (Санкт-Петербург, 2015); VII Российский общенациональный офтальмологический форум «РООФ 2015» (Москва, 2015); VII Съезд Российской ассоциации специалистов ультразвуковой диагностики в медицине (РАСУДМ) (Москва, 2015); II Европейский съезд молодых учёных (Испания, Овьедо, 2016).
Публикации
    По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 5 – в журналах, рецензируемых ВАК РФ и 2 патента РФ: патент на изобретение РФ №2577242 "Способ создания модели транзиторной ишемии сетчатки" от 11.02.2016 и патент на изобретение РФ №2577449 «Способ моделирования транзиторной ишемии сетчатки у крыс» от 15.02.2016.
Структура и объем диссертации
    Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 205 источников (66 отечественных и 139 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 24 рисунками. Работа выполнена в отделе ультразвуковых исследований (начальник д.м.н., профессор Киселёва Т. Н.), на базе научного экспериментального центра (заведующая к.б.н. Щипанова А. И.), отдела патологической анатомии и гистологии (начальник д.м.н., профессор Хорошилова-Маслова И. П.) и отдела иммунологии и вирусологии (начальник д.м.н., профессор Слепова О. С., совместно с к.б.н. Балацкой Н. В.) ФГБУ «МНИИГБ им. Гельмгольца» Минздрава России.

Содержание работы


Материал и методы исследования
    Исследование проведено на 110 крысах породы Wistar со средней массой 200 – 250 гр. Возраст животных составлял от 3 до 5 месяцев.

    Все инвазивные вмешательства проводились при сочетании общей анестезии по стандартной схеме из расчета дозы вещества на массу тела, принятой в лабораторной практике для работы с крысами и местной анестезии 0,4% раствором оксибупрокаина (инокаин). Эксперимент состоял из трех этапов. Первый этап включал оценку состояния кровотока в орбитальных сосудах до начала приема антиоксиданта ресвератрола и через 30 суток после начала его применения. На втором этапе проводилось моделирование ишемии-реперфузии путём повышения ВГД до 110 мм.рт.ст. на 30 минут (патент РФ на изобретение №2577449 от 15.02.2016) и субконъюнктивального введения раствора ЭТ-1 в дозе 0,2 мл 4*10 -6 моль/л (М) (патент РФ на изобретение №2577242 от 11.02.2016). Третий этап включал оценку состояния переднего отрезка глаза, ультразвуковое исследование глаза и орбиты в B-режиме, оценку глазного кровотока, лабораторные и морфологические исследования биоматериала после эвтаназии животных.

    Согласно задачам исследования на первом этапе все животные были разделены на две группы: в 1 группу вошли 50 интактных крыс (50 глаз), во 2 группу - 60 крыс (60 глаз), которые получали ресвератрол перорально в дозе 20 мг/кг с питьевой водой в течение 30 суток.

    На втором этапе исследования все животные 1 группы были разделены на три подгруппы: 20 животных (20 глаз), которым моделирование ишемии-реперфузии проводилось путём повышения ВГД на одном глазу (1А подгруппа), 20 животных (20 глаз), у которых моделировали ишемию-реперфузию с помощью одностороннего субконъюнктивального введения эндотелина-1 (ЭТ-1) (1Б подгруппа) и 10 интактных крыс (20 глаз) составили контрольную (1В) подгруппу.

    Животные 2-й группы, получавшие ежедневно ресвератрол, были разделены на две подгруппы. 2А подгруппу составили 30 крыс (30 глаз), которым осуществляли моделирование односторонней ишемии-реперфузии путём повышения ВГД. В 2Б подгруппу вошли 30 крыс (30 глаз), у которых моделирование ишемии-реперфузии проводилось с помощью одностороннего субконъюнктивального введения ЭТ-1. После моделирования регионарной ишемии-реперфузии животные 2 группы продолжали получать антиоксидант до момента эвтаназии. Всем животным автор самостоятельно выполнял осмотр с помощью бинокулярной лупы для оценки состояния переднего отрезка глаза и прямую офтальмоскопию для подтверждения появления ишемии сетчатки. Выраженность кератопатии и реакция переднего отрезка глаза оценивалась по шкале в условных баллах по 5 критериям (светобоязнь и блефароспазм, отёк роговицы, отёк радужки, кровь в передней камере, неоваскуляризация роговицы). Критериями исключения из эксперимента явились: отслойка сетчатки, эндофтальмит, гипопион и цилиохориоидальная отслойка, возникшие в постишемическом периоде.

    Ультразвуковые методы исследования проводились на многофункциональной ультразвуковой диагностической системе Voluson E8 Expert (GE Healthcare) до начала приема ресвератрола, через 30 суток после начала перорального применения антиоксиданта, в первые минуты после моделирования ишемии-реперфузии и через 3, 7 и 30 суток.

    Применение мультичастотного объемного линейного датчика RSP 6–16-D позволило определить основные орбитальные сосуды в режиме энергетического картирования (ЭК) с трехмерной реконструкцией изображения. Определение показателей гемодинамики осуществлялось с помощью ЭК и импульсной допплерографии. Регистрировали спектр допплеровского сдвига частот (СДСЧ) и основные количественные показатели кровотока: максимальную систолическую скорость (Vsyst), конечную диастолическую скорость (Vdiast) и индекс резистентности или периферического сопротивления (RI).

    Перед оценкой гемодинамических параметров автором самостоятельно проводилось измерение системного артериального давления (АД) под общим наркозом с помощью системы неинвазивного измерения АД c хвостовой манжетой IITC (США) (Mouse Rat Blood Pressure System IITC Life Science Inc., USA).

    Животных выводили из эксперимента под наркозом путём декапитации через 3, 7 и 30 суток после моделирования ишемии-реперфузии.

    Лабораторные методы исследования. Данный раздел работы выполнен на базе отдела иммунологии и вирусологии Института (руководитель – д.б.н., профессор Слепова О. С.) совместно с к.б.н. Балацкой Н. В. Материалом для исследований послужили сыворотка крови (СК) и гомогенаты тканей комплекса сетчатка-хориоидея крыс. Определяли следующие показатели: факторы митохондриального (BAX/BCL-2) и внешнего пути апоптоза (sFas/FasL), показатель повреждения нервной ткани - глиофибриллярный кислый протеин (GFAP), маркёр воспаления (МСР-1), нейротрофический фактор мозга (BDNF) и фактор роста нервов (NGF).

    Методы гистологического исследования. Патогистологическое исследование проводилось на базе отдела патологической гистологии и анатомии ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России (руководитель отдела д.м.н., профессор Хорошилова-Маслова И. П.). Энуклеацию глазного яблока у крыс производили через 3, 7 и 30 суток после ишемии-реперфузии. Энуклеированные глаза фиксировали в растворе Боуэна. После макроскопического исследования вырезали колодку глазного яблока, которую обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 0,5-1,5 мкм готовили на микротоме Leicа RM2235 (Германия) и окрашивали гематоксилин-эозином. Препараты исследовали и фотографировали с помощью светового микроскопа на микросистеме Leicа (Германия) при увеличении ×40, ×100, ×200, ×400.

    Статистический анализ выполнен автором самостоятельно с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и “Statistica 6.0” (Stat. Soft. Inc, США). Для оценки статистической значимости применяли t-критерий Стьюдента и тест Манна-Уитни. Разница считалась достоверной при p<0,05.
Результаты собственных исследований
     Оценка состояния переднего отрезка глаза после моделирования ишемии-реперфузии. Результаты обследования переднего отрезка глаза по бальной шкале показали травматичность метода моделирования ишемии-реперфузии путём повышения ВГД. Отмечались симптомы повреждения переднего отрезка глаза: светобоязнь, блефароспазм, отёк роговицы, радужки и гифема через 3 суток и появление неоваскуляризации роговицы у всех животных к концу периода наблюдения (через 30 суток) (Табл. 1). При моделировании ишемии-реперфузии путём субконъюнктивального введения ЭТ-1 наблюдали меньшую степень повреждения переднего отрезка глаза в раннем и позднем постишемическом периоде. Применение ресвератрола в течение длительного времени (от 1 до 2 месяцев) способствовало снижению выраженности и исчезновению ряда симптомов повреждения переднего отрезка глаза, наблюдалось уменьшение степени отёка, быстрое рассасывание гифемы и снижение неоваскуляризации роговицы (Табл. 1).

    Оценка гемодинамики в орбитальных сосудах у крыс до моделирования ишемии-реперфузии. Соотношение результатов исследования в серой шкале с объемной цветовой картой потоков крови в режиме ЭК с трехмерной реконструкцией изображения позволило правильно оценить прижизненную пространственную топографию хода сосудов в орбите. Для точного определения глазных артерий сравнивали место визуализации потока крови с проекцией зрительного нерва. Если поток крови располагался кнутри от зрительного нерва, то его определяли как верхнюю глазную артерию (ВГА), если кнаружи – как нижнюю глазную артерию (НГА). В аксиальной плоскости сканирования идентифицировали задние длинные цилиарные артерии (ЗКЦА), если сосудистая структура визуализировалась вблизи заднего полюса глаза и параллельно ему, при этом поток крови был направлен в сторону глаза. При проведении аксиальной плоскости сканирования через задний полюс глаза в проекции зрительного нерва определяли центральную артерию сетчатки (ЦАС).

    В результате выполненного анализа трехмерной реконструкции сосудистой системы глаза и орбиты крысы с учетом литературных данных разработана 3D схема кровоснабжения глаза крысы. В отличие от представленной ранее схемы 2D показано, что задняя цилиарная артерия (ветвь нижней глазной артерии) первоначально в орбите отдает ЦАС, затем у заднего полюса глаза - две ЗДЦА. Предложенная схема имеет существенное значение для точной регистрации показателей гемодинамики в сосудах глаза.

     Средний уровень нормального артериального давления (АД) в хвостовой артерии установлен на основании анализа данных 1-й контрольной группы и составлял для систолического АД в среднем 121,1±9,5 мм. рт.ст. (M±σ), для диастолического - 80±14,3 мм.рт.ст (M±σ). После статистической обработки полученных данных у здоровых интактных крыс были определены параметры средних показателей кровотока в сосудах орбиты в норме. Анализ показателей кровотока в ЦАС у здоровых крыс через 30 дней после приёма ресвератрола показал достоверное увеличение максимальной систолической скорости кровотока (Vsyst) на 35,6% (p<0,05), конечной диастолической (Vdiast) на 25,4% (p<0,001) и снижение RI на 13,5% (p<0,05) по сравнению с показателями в группе контроля. Аналогичные изменения гемодинамики отмечали в ЗДЦА, НГА и ВГА, в которых регистрировали увеличение Vsyst в среднем на 30,6%, 26,8% и 32% соответственно (p<0,05); увеличение Vdiast на 25,4% в ЗДЦА, 22,5% в НГА (p<0,001); на 19% в ВГА (p<0,05) и достоверное снижение индекса периферического сопротивления во всех артериях (p<0,05) по сравнению с контролем.

    Таким образом, через 30 суток после начала перорального применения антиоксиданта ресвератрола наблюдалось увеличение скорости кровотока (Vsyst и Vdiast) и снижение индекса периферического сопротивления во всех исследуемых артериях, что свидетельствовало об улучшении гемоперфузии глаза.

    Оценка гемодинамики в орбитальных сосудах при моделировании ишемии-реперфузии. Средний уровень системного АД в хвостовой артерии у животных 1А и 2А подгрупп до проведения ультразвукового исследования во все сроки достоверно не отличался от показателей в подгруппе контроля (p>0,05) (табл. 2). Исследование гемодинамики в сосудах глаза показало снижение показателей скорости кровотока (Vsyst и Vdiast) в ЦАС и ЗДЦА через 3 суток после ишемии в обеих подгруппах. В позднем постишемическом периоде (через 30 суток) имело место выраженное снижение Vsyst в ЦАС на 33,7%, в ЗДЦА на 36,2% по сравнению с контролем (p<0,05) (табл. 2). Однако показатели кровотока в НГА и ВГА в 1А подгруппе достоверно не отличались от таковых в контрольной 1В подгруппе, что может свидетельствовать о преимущественном нарушении кровотока в сосудах малого калибра (ЦАС, ЗДЦА) при моделировании ишемии-реперфузии путем повышения ВГД.

    У крыс 1Б подгруппы, где моделирование ишемии-реперфузии осуществляли с помощью субконъюнктивального введения ЭТ-1, выявлено статистически достоверное снижение показателей скорости кровотока в ЦАС, ЗДЦА, НГА в раннем постишемическом периоде (через 3 суток) в среднем на 37,03%, 26,85% и 14,52% соответственно (p<0,001) и увеличение RI в этих сосудах по сравнению с контрольной подгруппой (p<0,001). Через 7 суток у этих животных регистрировали статистически достоверное повышение Vsyst (p<0,05) и RI (p<0,001) в ЦАС (табл. 3), в ЗДЦА, НГА и ВГА (p<0,001) по сравнению с таковыми показателями в подгруппе контроля, что свидетельствовало об отсроченной гиперперфузии глаза в этот период наблюдения. В отдалённом постишемическом периоде (через 30 суток) отмечали достоверное снижение Vsyst в ЦАС в среднем на 57,41%, в ЗДЦА на 30,11%, на 42,9% в НГА и 21,7% в ВГА по сравнению с подгруппой контроля (p<0,05) (табл. 3).

     При длительном применении антиоксиданта ресвератрола (в течение 1-2 месяцев) в 2А подгруппе показатели Vsyst и Vdiast в ЦАС и ЗДЦА были достоверно выше на протяжении всего периода наблюдения (p<0,001) по сравнению с показателями скорости кровотока в подгруппе животных, не получавших антиоксидант. В 2Б подгруппе Vsyst и Vdiast во всех артериях достоверно превышали таковые в 1Б подгруппе через 3 и 30 суток после ишемии. У животных, получавших ресвератрол, гиперперфузии (увеличение скорости кровотока) в орбитальных артериях через 7 суток не наблюдалось.

    Результаты лабораторных методов исследования тканей глаза и сыворотки крови в эксперименте на крысах до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии. Анализ результатов исследования в раннем постишемическом периоде (через 3 суток) показал повышение маркёров апоптоза, в частности, белков-регуляторов проницаемости митохондриальной мембраны BAX/BCL-2 (рис. 1а, б), достоверное снижение концентрации нейротрофического фактора (фактора роста нервов NGF) (p<0,001), вероятно, из-за ослабления его продукции или активного потребления, и повышение концентрации хемоаттрактантного протеина MCP-1 (маркера воспаления) в тканях глаза. Через 7 суток после ишемии регистрировали усиление активности факторов BAX/BCL-2 внутриклеточной и внешней sFas/FasL рецепторной систем апоптоза, наиболее выраженное у животных с ишемией-реперфузией, индуцированной введением ЭТ-1 (рис. 1в, г). В этот период наблюдали максимальную концентрацию маркёра повреждения нервной ткани (GFAP) в сыворотке крови, что могло свидетельствовать о нарушении проницаемости гематоофтальмического барьера, а повышение концентрации MCP-1 - об усилении воспалительной реакции в комплексе сетчатка-хориоидея. Достоверное повышение концентрации нейротрофического фактора мозга BDNF и фактора роста нервов NGF указывало на активацию защитных нейропротекторных механизмов в тканях глаза в ответ на повреждающий фактор ишемии-реперфузии. В позднем постишемическом периоде (через 30 суток) отмечалось увеличение концентрации маркёров внешнего и внутреннего апоптоза BAX/BCL-2 и sFas/FasL (Рис. 1в, г), маркёра воспалительной реакции MCP-1, нейротрофических факторов BDNF и NGF в комплексе сетчатка-хориоидея и GFAP в сыворотке крови у крыс в 1А и 1Б подгруппах. Лабораторные тесты показали наличие выраженного апоптоза, воспалительных и нейротрофических изменений в тканях глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при двух способах моделирования ишемии-реперфузии.

    Применение ресвератрола в суточной дозе 20 мг/кг в течение длительного времени (1-2 месяца) в подгруппе 2А способствовало статистически достоверному увеличению уровня NGF в комплексе сетчатка-хориоидея в раннем постишемическом периоде (через 3 суток) (p<0,001), снижению показателей маркёров апоптоза (sFas/Apo-1//sFasL) на 76,5% и 72,3% соответственно (p<0,001), BCL-2 на 74% по сравнению с подгруппой 1А (p<0,05) (рис. 2а), снижению уровня маркёра воспаления МСР-1 (p<0,001) и концентрации GFAP (p<0,001) в сыворотке крови в позднем постишемическом периоде (через 30 суток).

     У крыс 2Б подгруппы применение антиоксиданта способствовало снижению уровня BCL-2 через 3 суток (p<0,001) и BAX на 75,6% (p<0,001) в тканях глаза через 30 суток (рис. 2б). В течение всего периода наблюдения отмечали статистически достоверное снижение концентрации маркёра воспаления MCP-1 (рис. 4а, б) и фактора повреждения нервной ткани GFAP у животных 2Б подгруппы по сравнению с 1Б подгруппой (p<0,05) (рис. 3а, б). Результаты лабораторных методов исследования сыворотки крови и тканей глаза показали снижение факторов апоптоза, воспалительных и нейротрофических изменений в комплексе сетчатка-хориоидея у животных 1Б и 2Б подгрупп, получавших ежедневно ресвератрол в течение длительного времени. При двух способах моделирования ишемии-реперфузии в эксперименте были установлены ретинопротекторные, нейропротекторные и противовоспалительные свойства ресвератрола в раннем и позднем постишемическом периоде.

    Результаты морфологического исследования тканей глаза в эксперименте на крысах до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии Выявлены ишемические изменения тканей переднего отрезка глаза (отёк и инфильтрация роговицы и радужки лимфоцитами), отек сетчатки и апоптоз ганглиозных клеток в раннем постишемическом периоде и уменьшение числа рядов обоих ядерных слоёв сетчатки с атрофией фоторецепторного слоя в позднем постишемическом периоде, что указывает на воспроизводимость представленных способов моделирования регионарной ишемии-реперфузии и возможность их применения для дальнейшего изучения патогенеза ишемически-реперфузионного повреждения сетчатки и оценки эффективности способов его коррекции.

    Уменьшение апоптоза ганглиозных клеток, атрофии фоторецепторного слоя и сохранение клеток ядерных слоёв на фоне длительного приёма ресвератрола (1-2 месяца) в суточной дозе 20 мг/кг подтверждает его ретино- и нейропротекторные свойства.

Выводы

    1. В эксперименте на крысах разработаны две модели регионарной ишемии-реперфузии глаза: путем повышения ВГД при введении воздуха в переднюю камеру и с использованием субконъюнктивального введения раствора эндотелина-1.

    2. Разработана прижизненная 3D схема кровоснабжения глаза крысы, которая показывает, что задняя цилиарная артерия (ветвь нижней глазной артерии) первоначально в орбите отдает центральную артерию сетчатки, затем у заднего полюса глаза - две задние длинные цилиарные артерии. Предложенная схема имеет существенное значение для точной регистрации показателей гемодинамики в сосудах глаза в эксперименте.

    3. С помощью ультразвуковых допплеровских методов установлено стойкое снижение кровотока в центральной артерии сетчатки и задних длинных цилиарных артериях в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД и ухудшение гемодинамики во всех орбитальных артериях при моделировании с помощью субконъюнктивального введения эндотелина-1.

    4. Особенностью модели регионарной ишемии-реперфузии с введением эндотелина-1 является усиление скорости кровотока (гиперперфузия) во всех исследуемых артериях через 7 суток, что свидетельствует о снижении сосудосуживающего эффекта вазоконстриктора в этот период.

    5. В эксперименте установлены лабораторные маркёры ишемического повреждения тканей глаза в раннем постишемическом периоде: увеличение факторов апоптоза BAX и BCL-2, повышение концентрации моноцитарного хемоаттрактантного протеина (MCP-1) в комплексе сетчатка-хориоидея, свидетельствующие о выраженной активации клеточного апоптоза и воспалительной реакции в оболочках глаза.

    6. Увеличение концентрации маркеров внешнего пути апоптоза sFas/FasL, МСР-1, нейротрофического фактора BDNF и фактора роста нервов NGF в тканях комплекса сетчатка-хориоидея через 7 суток после ишемии указывает на усиление процессов апоптоза и воспалительной реакции одновременно с активацией защитных нейропротекторных механизмов в этот период. Установлены максимальные уровни факторов апоптоза (BAX/BCL-2, sFas/FasL), маркеров воспаления (MCP-1) и нейродегенерации (GFAP) в позднем постишемическом периоде.

    7. На основании данных патоморфологических исследований установлены признаки ретинальной ишемии в виде отёка сетчатки и апоптоза ганглиозных клеток в раннем постишемическом периоде. В позднем постишемическом периоде при моделировании ишемии-реперфузии путём повышения ВГД наблюдается преимущественная атрофия наружного фоторецепторного слоя сетчатки, связанная с нарушением хориоидального кровообращения в задних длинных цилиарных артериях, а при моделировании путём введения эндотелина-1 – полное разрушение нейрональных элементов, что согласуется с нарушением кровообращения во всех артериальных сосудах глаза.

    8. В эксперименте установлены ретинопротекторные, нейропротекторные, антиангиогенные и противовоспалительные свойства ресвератрола на основании уменьшения степени неоваскуляризации роговицы, улучшения состояния гемодинамики глаза, снижения концентрации факторов клеточного апоптоза и маркеров воспаления в тканях глаза и уменьшения уровня факторов повреждения нервной ткани в сыворотке крови при регионарной ишемии-реперфузии.

Практические рекомендации

    1. Разработанные способы моделирования ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД и с помощью субконъюнктивального введения 0,2 мл 4*10 -6 М раствора эндотелина-1 могут быть использованы для оценки эффективности и выбора способов лечения ишемии сетчатки в эксперименте.

    2. Разработанная 3D схема кровоснабжения глаза крысы с помощью трехмерной ультразвуковой реконструкции сосудов орбиты в режиме энергетического картирования представляет дополнительные данные о прижизненной анатомической структуре, топографии васкуляризации глаза и орбиты и расширяет возможности ультразвуковых исследований при моделировании офтальмопатологии в эксперименте.

    3. Экспериментальное обоснование ретинопротекторных, нейропротекторных, антиангиогенных и противовоспалительных свойств антиоксиданта ресвератрола является основанием для последующего его применения в клинической практике в комплексном лечении сосудистых и нейродегенеративных заболеваний сетчатки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

    1. Киселёва, Т. Н. Экспериментальное моделирование ишемического поражения глаза / Т. Н. Киселёва, А. В. Чудин // Вестник РАМН. - 2014. -№11-12. - С. 97-103.

    2. Киселёва, Т. Н. Методы исследования микроциркуляции глаза у экспериментальных животных / Т. Н. Киселёва, А. В. Чудин, К. А. Рамазанова // Вестник офтальмологии. - 2014. -Т. 130, №5. - С. 100-103.

    3. Киселёва, Т. Н. Влияние ресвератрола на микроциркуляцию и структурные изменения глаза при моделировании ишемии-реперфузии сетчатки в эксперименте / Т. Н. Киселёва, А. В. Чудин, А. И. Щипанова, И. П. Хорошилова-Маслова // Российский офтальмологический журнал. - 2016. – Т. 9, №3. - С. 50-56.

    4. Нероев, В. В. Допплеровские методы в оценке влияния антиоксидантов на гемодинамику глаза в эксперименте / В. В. Нероев, Т. Н. Киселева, А. В. Чудин, Щипанова А.И. // Ультразвуковая и функциональная диагностика. – 2015. –№5. Часть II. – С. 121.

    5. Нероев, В. В. Влияние антиоксиданта растительного происхождения (ресвератрола) на глазной кровоток в эксперименте / В. В. Нероев, Т. Н. Киселёва, А. В. Чудин, А. И. Щипанова, К. А. Рамазанова// Вестник офтальмологии. - 2016. – Т. 132, №2. - С. 55-61.

    6. Kiseleva, T. N. Ultrasound methods of ocular blood flow in experiments on rats / T. N. Kiseleva, A.V. Chudin, K. A. Ramazanova, M. V. Ryabina, O. V. Zolotych, V. V. Neroev // Final Programme and abstract booklet SIDUO XXV Congress. - Berlin, 2014. – P. 89.
Изобретения по теме диссертации
    7. Пат. 2577242 Российская Федерация, МПК G09B 23/28 (2006.01) Способ создания модели транзиторной ишемии сетчатки крыс / Нероев В. В., Киселёва Т. Н., Чудин А. В., Безнос О. В., Хорошилова И. П., Щипанова А. И., Слепова О. С. , Балацкая Н. В; заявитель и патентообладатель ФГБУ "Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения РФ. – № 2015114834/14; заявл. 21.04.15; опубл. 10.03.2016, Бюл. № 7. – 2 с.

    8. Пат. 2577449 Российская Федерация, МПК А61F 9/00 (2006.01) Способ моделирования транзиторной ишемии сетчатки крыс / Киселёва Т. Н., Чудин А. В., Хорошилова И. П., Щипанова А. И., Слепова О. С. , Балацкая Н. В; заявитель и патентообладатель ФГБУ "Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения РФ. – № 2015114835/14; заявл. 21.04.15; опубл. 20.03.2016, Бюл. № 8. – 2 с.

Список сокращений

    ВГА – верхняя глазная артерия

    ВГД–внутриглазное давление

    ЗДЦА – задние длинные цилиарные артерии

    ЗЦВ – задняя цилиарная вена

    НГА – нижняя глазная артерия

    СК – сыворотка крови

    ТК – комплекс тканей сетчатка-хориоидея

    ЦАС – центральная артерия сетчатки

    ЦВС–цилиарная вена сетчатки

    ЭТ-1– эндотелин-1

    BAX– белок, вызывающий апоптоз за счет активации системы проницаемости митохондриальных мембран.

    BCL-2– внутриклеточный белковый фактор, негативный регулятор апоптоза.

    BDNF (brain-derived neurotrophic factor) - нейротрофический фактор мозга.

    sFAS–растворимая форма рецептора внешнего пути апоптоза.

    FasL–растворимый лиганд внешнего пути апоптоза.

    GFAP (glial fibrillary acidic protein) – глиальный кислый фибриллярный белок.

    MCP– 1– моноцитарный хемоаттрактантный протеин.

    NGF (nerve growth factor) - фактор роста нервов.


Город: Москва – 2016
Темы: 14.01.07 – глазные болезни
Дата добавления: 01.12.2018 12:29:53, Дата изменения: 01.12.2018 12:29:54