Год
2016

Клинико-экспериментальное изучение патогенеза ретинопатии недоношенных


Органзации: В оригинале: ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней им Гельмгольца»



Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Общая характеристика работы


Актуальность проблемы
    Несмотря на успехи современной неонатологии, в частности, оптимизацию схем кислородотерапии недоношенных детей, а также совершенствование технических приемов лазерного и хирургического лечения, ретинопатия недоношенных (РН) остается одной из ведущих причин необратимого билатерального нарушения зрительных функций у детей во всем мире (Катаргина Л.А., 2015; Сайдашева Э.Р., 2014, 2015; Dorfman A.L., 2011; Fulton A.B., 2009; Gilbert C., 2015; Hartnett M.E, 2010). Во многом это обусловлено относительным увеличением числа выживающих глубоко недоношенных детей с экстремально низкой массой тела при рождении, у которых РН развивается чаще, протекает тяжелее (РН 1 зоны, задняя агрессивная форма (ЗАРН)), нередко резистентна к общепринятым методам лечения и имеет худший функциональный и анатомический исход (Сайдашева Э.Р., 2014, 2015; Darlow B.A., 2013, 2015; Holmstrom G., 2016; Smith P., 2012; Quinn G., 2010).

    К ведущим факторам риска развития РН относят малый гестационный возраст (менее 35 недель ПКВ) и низкую массу тела (менее 1500 г) при рождении. Однако заболевание развивается только у 19-47% детей группы риска и только у 5,2-16,1% из них достигает «пороговой» стадии (Катаргина Л.А., 2016; Сидоренко Е. И., 2009; Good W.V., 2005). Нередки случаи асимметричного течения патологического процесса на парных глазах и совершенно различного течения заболевания у близнецов, что заставляет ученых продолжать активный поиск новых значимых факторов развития РН.

    На сегодняшний день многие аспекты патогенеза заболевания до конца не ясны и являются предметом многочисленных исследований, немалая часть которых базируется на эксперименте. Доказано, что ключевую роль в развитии РН играет дисбаланс регулирующих ангиогенез факторов, развивающийся вследствие того, что процесс васкуляризации сетчатки при преждевременном рождении ребенка «вынужден» осуществляться во внеутробных «экстремальных» условиях. В клинике и эксперименте изучаются патогенетическое значение оксидативного стресса, роль фоторецепторов, веретенообразных и глиальных клеток в патогенезе РН, нарушения взаимоотношений нейро- и ангиогенеза сетчатки в процессе развития заболевания, генетический аспект и другие потенциальные патогенетические факторы (Byfield G., 2009; Cavallaro G., 2013; Chen M., 2010; Dammann О., 2006, 2009; Hartmann J.S., 2011; Manzoni P., 2006; Saito Y., 2008).

    Имеется ряд работ, посвященных изучению иммунологического аспекта патогенеза заболевания (Катаргина Л.А., Слепова О.С., Белова М.В., 2011, 2012; Скрипец П.П., 2003; Sood B.G., 2010; Silveira R., 2011 ). Однако данные, характеризующие цитокиновый статус недоношенных детей с РН, достаточно противоречивы и не позволяют сделать однозначных выводов относительно значимости его оценки для прогнозирования развития и характера течения заболевания, что делает актуальным проведение дальнейших исследований, посвященных решению данного вопроса.

    «Золотым стандартом» лечения «пороговой» стадии активной фазы РН в настоящее время является коагуляция аваскулярных зон сетчатки. Однако регресс заболевания достигается не у всех детей даже в случае своевременно и адекватно проведенного вмешательства: эффективность коагуляции достигает 98% при классическом течении РН и лишь 70% - при ЗАРН (Асташева И.Б., 2010, 2013; Нероев В.В., 2013; Сайдашева Э.Р., 2015; Kim J., 2010; Mintz-Hittner H.A., 2012; Smith P., 2012; Quinn G., 2010), что делает актуальным поиск новых эффективных патогенетически обоснованных методов профилактики и лечения РН, повышающих частоту благоприятных исходов заболевания.

    Таким образом, изучение патогенеза РН продолжает оставаться крайне актуальной задачей современной детской офтальмологии, позволяя открывать новые подходы к профилактике, рациональной диагностике и повышению эффективности лечения заболевания.
Цели и задачи исследования
    Цель: изучение системных и местных факторов патогенеза РН в клинике и эксперименте с целью обоснования патогенетически ориентированного медикаментозного воздействия на ее развитие и течение.

    Задачи

    1. Исследовать системный цитокиновый статус недоношенных детей группы риска развития РН до клинической манифестации заболевания.

    2. Изучить взаимосвязь особенностей системного цитокинового статуса недоношенных детей группы риска до клинической манифестации РН с развитием и характером течения заболевания.

    3. Провести анализ влияния антиоксидантной терапии на клиническое течение РН и на динамику фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-А) в сыворотке крови недоношенных детей при ее развитии.

    4. Получить воспроизводимую модель экспериментальной ретинопатии недоношенных (ЭРН) на крысятах, адекватную современным представлениям о факторах развития РН в клинике.

    5. Изучить гистологические и иммуногистохимические признаки развития ЭРН и ряд аспектов патогенеза заболевания (показатели антиоксидантной системы и состояние гемато-ретинального барьера (ГРБ) на разных фазах развития ретинопатии в эксперименте).

    6. Изучить влияние антиоксидантной терапии на развитие и течение ЭРН и на динамику биохимических параметров стекловидного тела у крысят с ЭРН.
Научная новизна
    1. Впервые на большом клиническом материале (85 недоношенных детей) изучен развернутый системный цитокиновый статус (18 показателей различного биологического действия) недоношенных детей группы риска развития РН и проведен сравнительный анализ исследуемых показателей в клинических группах с разным прогнозом развития и течения заболевания.

    2. Впервые показано, что высокая концентрация IGF-II (выше 140 пг/мл) и низкая концентрация TGF-β (ниже 8000 пг/мл) в сыворотке крови недоношенных детей на сроках до клинической манифестации РН являются прогностически неблагоприятными факторами тяжелого течения заболевания, что позволяет рассматривать их в качестве новых значимых факторов патогенеза, а также мишеней лекарственной терапии РН.

    3. Установлено, что проведение антиоксидантной терапии недоношенным детям при появлении первых признаков сосудистой активности на глазном дне приводит к снижению стартово высокой сывороточной концентрации VEGF-А у детей с тяжелым течением заболевания, что способствует более позднему развитию экстраретинальной вазопролиферации.

    4. Разработана адекватная экспериментальная модель РН на крысятах, по условиям проведения эксперимента и фазности течения максимально приближенная к развитию заболевания у недоношенных детей в клинике, позволяющая изучать патогенез ретинопатии и вести поиск новых способов медикаментозного воздействия на ее развитие и течение.

    5. Впервые на модели ЭРН на крысятах показано, что применение экзогенного мелатонина, обладающего выраженными антиоксидантными свойствами, предотвращает развитие патологической вазопролиферации, а также нормализует уровень антиокислительной активности (АОА) и содержание общего белка в стекловидном теле опытных животных на всех сроках наблюдения.

    6. В клинике и эксперименте патогенетически обоснована целесообразность начала проведения антиоксидантной терапии до клинической манифестации ретинопатии.
Теоретическая и практическая значимость
    1. Выявлены прогностически неблагоприятные лабораторные критерии (сывороточная концентрация VEGF-A - выше 1300 пг/мл, IGF-I - ниже 24 пг/мг, IGF-II - выше 140 пг/мл, TGF-β - ниже 8000 пг/мл), позволяющие формировать группу недоношенных детей повышенного риска развития тяжелой РН до начала заболевания и корректировать тактику ведения данной группы детей на этапах выхаживания.

    2. Клинически и экспериментально обоснована целесообразность проведения антиоксидантной терапии на ранних сроках патологического процесса - до развития патологической экстраретинальной вазопролиферации при РН.

    3. В качестве нового патогенетически ориентированного терапевтического агента для профилактики и лечения РН, показавшего свою эффективность в эксперименте, представлен экзогенный мелатонин.
Методология и методы исследования
    Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне проспективного открытого сравнительного нерандомизированного исследования с использованием клинических, инструментальных и статистических методов.
Положения, выносимые на защиту
    1. Комплексный анализ системного цитокинового профиля недоношенных детей до клинической манифестации РН демонстрирует 100%-ную частоту определения ростовых факторов в довольно широком диапазоне значений концентрации, а также выявляет дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов, с превалированием провоспалительных, на фоне большого разброса уровня и частоты их определения.

    2. Высокие концентрации VEGF-А, IGF-II и низкие значения концентрации IGF-I и TGF-β в сыворотке крови недоношенных детей с развившейся в динамике «пороговой» стадией РН позволяют еще до появления офтальмоскопических признаков заболевания выделить группу детей с высоким риском неблагоприятного течения заболевания.

    3. Проведение антиоксидантной терапии на ранних сроках развития РН до начала процесса патологической экстраретинальной вазопролиферации снижает уровень VEGF-А в сыворотке крови, что приводит к относительно более позднему развитию «пороговой» стадии РН.

    4. В разработанной модели ЭРН наблюдающиеся сосудистые изменения сетчатки, которые развиваются за счет воздействия адекватно выработанного режима колебаний кислорода, последовательно воспроизводят РН 1-3 стадии активной фазы в клинике, что позволяет изучать звенья патогенеза заболевания, а также вести целенаправленную разработку новых медикаментозных средств воздействия на его развитие и течение.

    5. Экзогенный мелатонин способен предотвращать развитие патологической вазопролиферации при ЭРН, стабилизировать ГРБ и нормализовать уровень АОА в стекловидном теле опытных животных, что позволяет рассматривать его в качестве перспективного агента в профилактике и лечении РН в клинике.
Степень достоверности и апробация результатов работы
    Степень достоверности полученных результатов исследований определяется достаточным и репрезентативным объемом выборок исследований, работа выполнена с использованием современных методов обследования. Методы статистической обработки результатов адекватны поставленным задачам. Положения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, аргументированы и являются результатом многоуровневого анализа.

    Основные положения работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях с международным участием: «Актуальные вопросы детской офтальмологии», Москва, 2014 г., "VIII Российский общенациональный офтальмологический форум", Москва, 2015 г., «Ретинопатия недоношенных-2016», Москва, 2016 г.
Публикации
    По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 - в печатных изданиях, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованный ВАК РФ, и 1 патент № 2526827 от 2.07.14г. «Способ прогнозирования развития пороговой стадии ретинопатии недоношенных у детей без офтальмологических признаков заболевания» (опубликован 27.08.2014 г., бюллетень 24). Подана заявка на изобретение № 2015140577 от 23.09.2015 г. «Способ лечения экспериментальной ретинопатии недоношенных».
Внедрение в практику
    Результаты исследования внедрены в клиническую практику отдела патологии глаз у детей и детского консультативно-поликлинического отделений ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России.
Структура и объем диссертации
    Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Содержит 9 таблиц, 51 рисунок. Список литературы включает 246 источников, в том числе 36 отечественных и 210 зарубежных авторов.

Содержание работы


Материалы и методы исследования
    Работа выполнена на базе отдела патологии глаз у детей (руководитель – профессор, д.м.н. Л.А. Катаргина) ФГБУ «МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России (директор – профессор, д.м.н. В.В. Нероев), совместно с отделом иммунологии и вирусологии (руководитель – профессор О.С. Слепова), научно-экспериментальным центром (руководитель – к.б.н. А.И. Щипанова), отделением патологической анатомии и гистологии глаза (руководитель – профессор И.П. Хорошилова-Маслова), отделом патофизиологии и биохимии (руководитель – профессор Н.Б. Чеснокова).

    Набор клинического материала проводился на базе отделения реанимации и интенсивной терапии для детей неонатального периода (заведующая – к.м.н. Т.Н. Эверстова) и отделения патологии новорожденных (заведующий – М.В. Кыштымов) Детской городской клинической больницы №13 имени Н.Ф. Филатова (главный врач – профессор Чубарова А.И.).

    Клиническая часть

    Обследовано 85 недоношенных детей, находившихся на различных этапах выхаживания. Средний срок гестации при рождении детей составил 27,7 ± 2,2 недель (от 23 до 35 недель), средняя масса тела при рождении – 1086,1 ± 266,1 г (от 633 до 1790 г). Обследование детей включало динамическую офтальмоскопию и исследование системного иммунологического статуса.

    Офтальмологическое обследование проводилось согласно принятому в России протоколу скрининга РН (Федеральные клинические рекомендации, 2015). 15 детям при выявлении признаков начальной сосудистой активности на глазном дне неонатологами была назначена антиоксидантная терапия (ежедневные внутримышечные инъекции препарата «Гистохром» 0,02% 0,5 мл). Офтальмоскопическое обследование и лечение детей осуществлялось совместно с к.м.н. Е.Н.Демченко.

    Забор образцов венозной крови осуществлялся у всех детей при первом офтальмоскопическом обследовании одновременно с плановым динамическим контролем биохимических показателей. У 27 детей иммунологические показатели были исследованы в динамике (от 2 до 5 раз). Всего было получено и исследовано 130 образцов венозной крови. В 0,5 мл каждого из образцов путем мультиплексного анализа на проточном цитометре BD FACS Canto II было исследовано содержание 18 цитокинов – VEGF-А, IGF-I, IGF-II, TGF-β, IFN-α, IFN-γ, TNF-α, TNF-β, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12р70, IL-17, IL-18. Иммунологическое исследование сыворотки крови недоношенных детей проводилось совместно с совместно с сотрудником отдела иммунологии и вирусологии Н.С. Славинской под руководством профессора О.С. Слеповой.

    Экспериментальная часть

    Исследование выполнено на 144 крысятах породы Вистар. Протокол исследования утвержден локальным этическим комитетом.

    С целью воспроизведения ЭРН новорожденных крысят вместе с родившей их самкой на 14 суток помещали в инкубатор, где каждые 12 часов концентрация кислорода менялась от 60 до 15%. Затем крысят помещали в условия с нормальным содержанием кислорода (21%). На протяжении эксперимента в помещении поддерживали постоянный температурный (+26°С) и световой (12 часов день, 12 часов ночь) режимы. Контрольную группу составили крысята, находившиеся с момента рождения в условиях с нормальным содержанием кислорода. Соблюдение условий эксперимента и контроль за функционированием оборудования осуществлялись совместно с сотрудником научно-экспериментального центра старшим лаборантом Б.В. Витер под руководством к.б.н. А.И. Щипановой.

    Еще двум группам крысят, находившихся в опытных и контрольных условиях, с 1 по 14 сутки интраперитонеально вводили раствор мелатонина (Sigma-Aldrich) в стерильном 0,05 М фосфатном буферном растворе (рН 7,4) объемом 30 мкл в дозировке 10 мг/кг. Каждая группа крысят содержала 36 особей. Все инъекции выполнялись автором самостоятельно.

    Крысят из каждой группы выводили из эксперимента на 7-е (N=16), 10-е (N=24), 14-е (N=40), 18-е (N=40) и 28 сутки (N=24). Выбор сроков энуклеации основывался на данных о нормальном ангиогенезе сетчатки крысят, а также на ориентировочных данных о фазах развития ретинопатии в эксперименте. Всем крысятам проводили бинокулярную энуклеацию, после чего из 32 полученных на сроках 7-е, 14-е и 18-е сутки глазных яблок для биохимического анализа проводили забор образцов стекловидного тела, в каждом из которых определяли АОА и концентрацию общего белка по Лоури. Энуклеация и забор образцов стекловидного тела проводились автором самостоятельно, биохимические исследования - совместно с научным сотрудником отдела патофизиологии и биохимии О.В. Безнос под руководством профессора Н.Б. Чесноковой. Оставшиеся глазные яблоки (по 48 глазных яблок на 10-е, 14-е, 18-е и 28-е сутки) подвергали гистологическому и иммуногистохимическому исследованию, которое проводилось совместно с сотрудниками отделения патологической анатомии и гистологии глаза врачом-патологоанотомом А.М. Майбогиным, вед.науч.сотр., к.б.н. Л.Д. Андреевой под руководством профессора И.П. Хорошиловой-Масловой.

    Статистическая обработка результатов клинической части работы

    проводилась в программе IBM SPSS Statistics (версия 22), экспериментальной

    части - с использованием статистического пакета Microsoft Excel.

    Статистическая обработка выполнена автором самостоятельно.
Результаты исследований
    Клиническая часть

    Результаты офтальмологического обследования детей

     На момент первого офтальмоскопического исследования у 82 из 85 детей определялись аваскулярные зоны 2-3, у 3 детей была диагностирована преретинопатия (начальная извитость концевых сосудов с тенденцией к образованию аркад без признаков демаркации на границе с аваскулярной зоной).

    При динамической офтальмоскопии у 32 детей отмечался нормальный процесс васкуляризации сетчатки, который завершился к 44-46 неделе постконцептуального возраста (ПКВ). Эти дети составили первую клиническую группу. У 53 детей в период с 31 по 39 неделю ПКВ была диагностирована РН. У 29 из них на сроке от 48 до 51 недели ПКВ отмечался самопроизвольный регресс РН. Эти дети составили вторую клиническую группу. У 24 детей процесс прогрессировал до «пороговой» стадии. Лазеркоагуляция аваскулярных зон сетчатки была проведена на сроках с 34 по 40 неделю. Регресс РН наблюдался у всех детей на сроках от 39 до 45 недель. Эти дети составили третью клиническую группу.

    Характеристика цитокинового статуса всех обследованных детей до клинической манифестации РН

    Уровень и частота определения цитокинов в сыворотке крови детей при первом офтальмологическом обследовании широко варьировали (таб. 1).

    У всех недоношенных детей определялись 6 из 18 цитокинов (VEGF-А, IGF-I, IGF-II, TGF-β, IL-18 и IL-8), еще 5 из них (TNF-α, IL-6, INF-α, IL-2 и IL-10) - примерно у половины детей (с частотой 46,2 – 57,5%), а остальные – менее чем у трети (5-36,2%).

    Сравнительный анализ содержания цитокинов различного биологического действия до клинической манифестации РН в трех клинических группа детей

     Анализ содержания ростовых факторов в сыворотке крови недоношенных детей с различным прогнозом развития РН на момент первого офтальмологического обследования показал, что в третьей клинической группе детей наблюдались относительно более высокие значения концентрации VEGF-А (выше 1300 пг/мл) и IGF-II (выше 140 пг/мл) и низкие значения концентрации IGF-I (ниже 24 пг/мг) и TGF-β (ниже 8000 пг/мл) по сравнению с группами «благополучных» детей (таб. 2).

    Данные, полученные в отношении VEGF-А и IGF-I, соответствуют общепринятым представлениям об их участии в патогенезе РН. В то время как роль IGF-II и TGF-β в патологической вазопролиферации при РН малоизучена.

    Полученные в нашем исследовании относительно высокие значения концентрации IGF-II на доклинической стадии у детей с развившейся впоследствии «пороговой» РН свидетельствуют о его проангиогенных свойствах.

    Более низкий уровень TGF-β на данном сроке у детей описанной группы, учитывая имеющиеся данные о его способности индуцировать экспрессию рецептора VEGFR-1 (Shu-Ching Shih, 2003), говорит о недостатке его протекторного действия на эндотелий сосудов в период патологической задержки ретинальной васкуляризации при РН, а выявленная при последующем динамическом обследовании однонаправленность изменений концентраций TGF-β и VEGF-А (рис. 1), свидетельствует о синергизме их влияния на ангиогенез в условиях развития заболевания.

    Содержание про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови детей с разным прогнозом развития РН представлено в таблице 3.

    Обращает на себя внимание то, что уровень определяющихся у всех недоношенных детей IL-18 и IL-8 был выше у детей третьей группы, и наиболее выраженной эта тенденция была в отношении IL-18, что является подтверждением его проангиогенных свойств. Следует также отметить повышение частоты обнаружения IL-2, IL-1β, IFN-α в группе детей с развившейся «пороговой» стадией РН, по сравнению с двумя другими группами, а также относительное повышение концентрации IL-5, IL-1β, TNF-α у детей данной группы.

    Противовоспалительные цитокины определялись в сыворотке крови менее чем у половины детей во всех трех группах, причем частота их определения была сравнимой во всех группах.

    Таким образом, анализ содержания про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови всех детей трех групп выявил превалирование провоспалительного звена иммунного ответа, наиболее выраженное у детей с «неблагоприятным» течением РН.

    Оценка влияния антиоксидантной терапии на течение РН и уровень VEGF-А в сыворотке крови недоношенных детей с РН

     При выявлении признаков нарастания сосудистой активности 7 детям из второй группы и 8 детям из третьей группы неонатологами были назначены внутримышечные инъекции 0,5 мл препарата «Гистохром» 0,02%, которые проводились до развития признаков самопроизвольного или индуцированного регресса РН. Иммунологический статус данных детей был обследован в динамике. Целесообразной явилась оценка влияния проводимой антиоксидантной терапии на динамику уровня ростового фактора VEGF-А, роль которого в патологическом ангиогенезе при РН хорошо изучена и не вызывает сомнения.

    Из 7 детей второй клинической группы на фоне антиоксидантной терапии у 4 детей (57,1%) отмечалось снижение концентрации VEGF-А, а у 3 детей отмечался ее подъем в период развития РН. При этом из 7 детей данной группы, которым не проводилась указанная антиоксидантная терапия и иммунологические показатели которых были обследованы в динамике, только у 2 детей (28,6%) отмечалось снижение концентрации VEGF-А, а у 5 -отмечалось ее повышение в период развития заболевания.

    В третьей клинической группе у 6 из 8 детей (75%), получавших антиоксидантную поддержку, наблюдалось снижение концентрации VEGF-А, у 1 ребенка концентрация практически не изменилась, и только у 1 ребенка отмечался ее подъем. РН у детей данной подгруппы была диагностирована на сроках с 34 по 38 неделю ПКВ (в среднем, на 35,25±0,49 неделе), лазеркоагуляция аваскулярных зон сетчатки проводилась на сроках с 35 по 38 неделю ПКВ (в среднем, на 36,63±0,42 неделе).

    Из 5 детей третьей клинической группы, которым не проводилась указанная антиоксидантная терапия, у 2 детей (40%) отмечалось снижение концентрации VEGF-А (из них у 1 измерение проводилось после проведенной лазеркоагуляции аваскулярных зон сетчатки), у 3 детей наблюдалось ее повышение. РН у детей данной подгруппы была диагностирована на сроках с 32 по 37 неделю (в среднем, на 34,4±0,93 неделе), лазеркоагуляция сетчатки была проведена на сроках с 33 по 39 неделю (в среднем, на 34,75±0,75 неделе).

    Таким образом, начало проведения антиокисдантной терапии на ранних сроках, до развития патологической экстраретинальной вазопролиферации, приводит к снижению изначально высокой концентрации VEGF-А в сыворотке крови детей с тяжелым течением РН и отдаляет срок развития пиковой концентрации VEGF-А, сопровождающей развитие «пороговой» стадии заболевания. Это позволяет проводить лазеркоагуляцию меньших по площади аваскулярных зон соматически более зрелым детям, что имеет важное практическое значение.

    Экспериментальная часть

    Гистологические и иммуногистохимические признаки развития ЭРН

     Результаты проведенных гистологических методов исследования энуклеированных глаз крысят на различных сроках постнатальной жизни животных, находившихся в экспериментальных условиях, отражают стадийность сосудистых изменений, характерных для РН в клинике.

    На 10-е сутки у крысят с ЭРН в постэкваториальной зоне сетчатки определяются аваскулярные зоны, в то время как в контрольной группе отмечается законченная васкуляризация внутренних слоев сетчатки, что свидетельствует о задержке нормального процесса васкуляризации сетчатки в условиях развития ЭРН, аналогичной наблюдающейся у недоношенных детей. Кроме того, у крысят опытной группы имеется дилятация центральных ретинальных сосудов, что можно расценить как преретинопатию.

    На 14-е сутки, т.е. в период окончания воздействия переменных концентраций кислорода, у крысят с ЭРН на периферии сетчатки наблюдается повышенная по сравнению с контролем плотность сосудов капиллярного типа, сопровождающаяся отеком слоя ганглиозных клеток. В препаратах полутонких срезов сетчатки у крысят опытной группы обращает на себя внимание гиперхромность ядер эндотелиальных клеток (в то время как ядра эндотелиальных клеток крысят контрольной группы гипохромны), что свидетельствует об изменениях метаболизма эндотелиальных клеток, характеризующих их повышенный пролиферативный потенциал, а также наличие сосудов с многочисленными ответвлениями. Иммуногистохимическое исследование с антителами к ядерному антигену пролифирирующих клеток (PCNA), проведенное на сетчатках крысят с ЭРН на 14-е сутки, показало положительную экспрессию в ядрах эндотелиальных клеток сосудов сетчатки, что является подтверждением их пролиферативной активности. Выявленные на данном сроке изменения аналогичны 1-2 стадии активной фазы РН в клинике.

    На 18-е сутки у крысят опытной группы отмечаются начальные явления экстраретинальной пролиферации капилляров ганглиозного слоя сетчатки в стекловидное тело, в то время как у крысят контрольной группы состояние сосудистой системы сетчатки на данном сроке не отличается от 14-х суток. Клинически выявленные на данном сроке изменения соответствуют 3 стадии активной фазы РН.

    На 28-е сутки в сетчатке крысят с ЭРН определяется обилие сосудов в слое нервных волокон с тенденцией к прорастанию через внутреннюю пограничную мембрану и концентрированием ядер эндотелиальных клеток, отличающихся гипохромностью, которая свидетельствует о явном снижении их пролиферативной активности к данному сроку наблюдения. Иммуногистохимическое исследование, проведенное на данном сроке, выявляющее положительную экспрессию PCNA в ядрах эндотелиальных клеток сосудов сетчатки, говорит о сохранении определенного ее уровня. Данный срок соответствует начальному регрессу РН.

    Состояние ГРБ и уровень АОА стекловидного тела крысят с ЭРН

    Результаты биохимического исследования образцов стекловидного тела крысят опытной и контрольной групп представлены в таблицах 4 и 5.

    В течение первой недели, несмотря на повышенную по сравнению с контролем проницаемость ГРБ, о чем свидетельствует повышенный уровень белка в стекловидном теле, АОА не увеличивалась, возможно, в силу «расходования» плазменных антиоксидантов на связывание свободных радикалов, содержание которых в этот период должно закономерно возрастать . Значительное увеличение АОА на второй неделе связано с поступлением компонентов антиокислительной системы в стекловидное тело из патологически измененной ретинальной сосудистой сети, что подтверждается значительным увеличением в этот период содержания общего белка в стекловидном теле. Кроме того, определенный вклад может носить возможное увеличение синтеза антиоксидантов in situ в самой сетчатке в ответ на развивающийся окислительный стресс. Последующее снижение АОА у крысят с ЭРН на 18-е сутки свидетельствует о возросших затратах антиоксидантов в борьбе со свободными радикалами.

    Влияние экзогенного мелатонина на развитие ЭРН, состояние ГРБ и уровень АОА стекловидного тела крысят

    На фоне интраперитонеальных инъекций мелатонина у крысят опытной группы на 10-е сутки в постэкваториальных отделах сетчатки определяются сосуды, что свидетельствует о сокращении сроков существования аваскулярных зон. На 14-е сутки не наблюдается увеличения плотности сосудистого рисунка периферических отделов сетчатки и структурных изменений ее слоев. На 18-е сутки не отмечается развития признаков эктраретинальной вазопролиферации.

    Следует отметить, в контрольной группе крысят на фоне инъекций мелатонина не наблюдается каких-либо выраженных структурных или сосудистых изменений сетчатки по сравнению с нелечеными животными, что свидетельствует о его низкой токсичности.

    Таким образом, ежедневные интраперитонеальные инъекции мелатонина предотвращают появление гистологических признаков развития ЭРН у опытной группы крысят.

    Динамика биохимических показателей стекловидного тела крысят опытной и контрольной групп на фоне инъекций мелатонина представлена в таблицах 6 и 7.

    Результатом анализа полученных данных является заключение о том, что мелатонин способен стабилизировать ГРБ и проявляет выраженные антиоксидантные и антиангиогенные свойства в опытной группе крысят, что находит подтверждение в том, что содержание общего белка и уровень АОА в стекловидном теле опытных крысят находились на уровне данных показателей в контрольной группе на всех сроках наблюдения.

    Полученные данные позволяют рассматривать мелатонин в качестве потенциального медикаментозного средства для профилактики и лечения РН в клинике.

Выводы

    1. У недоношенных детей группы риска развития РН на сроке до клинической манифестации заболваения со 100 %-ной частотой определяются ростовые факторы VEGF-А, IGF-I, IGF-II, TGF-β и провоспалительные цитокины IL-18 и IL-8. На фоне широкого варьирования частоты выявления и значительного диапазона значений концентрации выявляется относительное превалирование провоспалительных цитокинов.

    2. Прогностически «неблагоприятными» в плане развития тяжелой РН, требующей проведения лазеркоагуляции сетчатки, являются высокие значения концентрации VEGF-А (выше 1300 пг/мл) и IGF-II (выше 140 пг/мл) и низкие значения концентрации IGF-I (ниже 24 пг/мг) и TGF-β (ниже 8000 пг/мл) в сыворотке крови недоношенных детей на сроках до клинической манифестации заболевания. Данные, полученные в отношении относительно малоизученных в аспекте патогенеза РН факторов IGF-II и TGF-β, свидетельствуют об их проангиогенных свойствах в условиях развития заболевания.

    3. Проведения антиоксидантной терапии недоношенным детям группы риска при выявлении первых признаков нарастания сосудистой активности на глазном дне приводит к снижению концентрации VEGF-А в сыворотке крови детей с тяжелым течением РН, относительно более медленному развитию и прогрессированию заболевания до «пороговой» стадии, а значит, к необходимости проведения лазеркоагуляции аваскулярных зон сетчатки меньшей площади соматически более зрелым детям.

    4. Созданная модель ЭРН на крысятах по условиям проведения эксперимента (подача переменных концентраций кислорода) и характеру течения (фазность) максимально приближена к РН у детей в клинике и перспективна для изучения различных аспектов патогенеза заболевания и разработки методов влияния на его развитие и течение.

    5. Результаты биохимического исследования стекловидного тела крысят с ЭРН свидетельствуют о выраженных нарушениях проницаемости ГРБ на всех сроках развития ретинопатии, а также обнаруживают фазность изменений АОА с пиком, приходящимся на конец 2-й недели жизни крысят и соответствующим началу патологической вазопролиферации, что свидетельствует о важной роли нарушений окислительного статуса как одного из звеньев патогенеза РН.

    6. Мелатонин при ежедневном интраперитонеальном введении в период начального нарушения постнатального развития сосудистой сети сетчатки при ЭРН способствует стабилизации ГРБ, а также проявляет выраженные антиангиогенные и антиоксидантные свойства, что позволяет рассматривать его в качестве потенциального медикаментозного средства для профилактики и лечения РН в клинике.

    7. Полученные данные о влиянии антиоксидантной терапии на развитие и течение РН в клинике и эксперименте подтверждают целесообразность включения ее в схему ведения недоношенных детей группы риска при появлении признаков нарастания сосудистой активности на глазном дне на сроках до клинической манифестации заболевания.

Практические рекомендации

    1. При выявлении высоких значений концентрации VEGF-А (выше 1300 пг/мл) и IGF-II (выше 140 пг/мл) и низких значений концентрации IGF-I (ниже 24 пг/мг) и TGF-β (ниже 8000 пг/мл) в сыворотке крови недоношенных детей на момент первого офтальмоскопического осмотра следует отнести данного ребенка к группе повышенного риска развития тяжелой РН и планировать тактику его ведения на этапах выхаживания таким образом, чтобы обеспечить возможность незамедлительного оказания специализированной офтальмологической помощи.

    2. Назначение антиоксидантной терапии недоношенным детям группы риска развития РН показано при появлении первых признаков нарастания сосудистой активности на глазном дне.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

    1. Катаргина, Л.А. Влияние препарата Гистохром на уровень VEGF у детей с активной ретинопатией недоношенных / Л.А. Катаргина, Е.Н. Демченко, Н.А. Осипова // Научно-практическая конференция с международным участием «Ретинопатия недоношенных, 2016»: сб. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Москва, 2016. – С. 64-68.

    2. Катаргина, Л.А. Основные принципы экспериментального моделирования ретинопатии недоношенных на животных / Л.А. Катаргина, Н.А. Осипова // Российская педиатрическая офтальмология. - 2014. - № 1. -С. 56-60.

    3. Оценка уровня антиокислительной активности и содержания общего белка в стекловидном теле крысят с кислород-индуцированной ретинопатией / Л. А. Катаргина, Н. А. Осипова [и др.] // Российский общенациональный офтальмологический форум: сб. науч.- практ. конф. с междунар. участием. – Москва, 2015. - Т. 2. - С. 806-811.

    4. Роль системного дисбаланса цитокинов в патогенезе ретинопатии недоношенных / Л. А. Катаргина, Н. А. Осипова [и др.] // Российская педиатрическая офтальмология. - 2015. - № 4. - С. 16-20.

    5. Экспериментальное исследование роли окислительного стресса в патогенезе ретинопатии недоношенных как перспективное направление поиска новых медикаментозных подходов к ее профилактике и лечению / Л. А. Катаргина, Н. А. Осипова [и др.] // Российский офтальмологический журнал. – 2016. - Т. 9, № 1. - С. 68 – 73.

    6. Экспериментальное моделирование как платформа для изучения патогенеза ретинопатии недоношенных / Л. А. Катаргина, Н. А. Осипова [и др.] // Научно-практическая конференция с международным участием «Ретинопатия недоношенных, 2016»: сб. науч.- практ. конф. с междунар. участием. – Москва, 2016. – C. 68-72.

    7. Патент РФ №2526827 от 2.07.2014 г. Катаргина Л.А., Слепова О.С., Демченко Е.Н., Осипова Н.А. Способ прогнозирования развития пороговой стадии ретинопатии недоношенных у детей без офтальмологических признаков заболевания. Катаргина Л.А., Чеснокова Н.Б., Щипанова А.И., Безнос О.В., Осипова Н.А. Способ лечения экспериментальной ретинопатии недоношенных (Подана заявка на изобретение № 2015140577 от 23.09.2015 г.)

Список сокращений

    АОА – антиокислительная активность

    ВЖК – внутрижелудочковое кровоизлияние

    ВУИ – внутриутробная инфекция

    ГРБ – гемато-ретинальный барьер

    ЗАРН – задняя агрессивная форма ретинопатии недоношенных

    ИВЛ – искусственная вентиляция легких

    ПКВ – постконцептуальный возраст

    РН – ретинопатия недоношенных

    ЭРН – экспериментальная ретинопатия недоношенных

    CD (Cluster of Differentiation) – кластер дифференцировки

    IFN (Interferon) – интерферон

    IGF (Insulin-like Growth Factor) – инсулиноподобный фактор роста

    IL (Interleukin) – интерлейкин

    PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) - ядерный антиген пролиферирующих клеток

    TGF-β (Transforming Growth Factor beta) - трансформирующий фактор роста-β

    TNF (Tumor Necrosis Factor) – фактор некроза опухоли

    VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) - фактор роста эндотелия сосудов


Город: Москва – 2016
Темы: 14.01.07 – глазные болезни
Дата добавления: 01.12.2018 12:30:00, Дата изменения: 01.12.2018 12:30:00

Роговица III. Инновации  лазерной коррекции зрения и кератопластикиРоговица III. Инновации лазерной коррекции зрения и кератоп...

ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты»ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вме...

Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и иммунодефицитные заболевания»Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и ...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

«Живая» хирургия в рамках конференции  «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»«Живая» хирургия в рамках конференции «Современные технолог...

Сателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенациональ...

Федоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическ...

Актуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная...

Восток – Запад 2018  Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2018 Международная конференция по офтальмологии

«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»

Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Между...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизонты -  2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизон...

Сателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКОСателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКО

VIII Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии (ЕАКО)VIII Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии (ЕАКО)

XVII Всероссийская школа офтальмологаXVII Всероссийская школа офтальмолога

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2018 ХVI Научно-практическая конференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии -...

Роговица II. Топография роговицы. Аберрации глаза 2018 Научно-практическая конференция с международным участиемРоговица II. Топография роговицы. Аберрации глаза 2018 Научн...

 ХV Юбилейный конгресс Российского глаукомного общества ХV Юбилейный конгресс Российского глаукомного общества

Сателлитные симпозиумы в рамках ХV Юбилейного конгресса Российского глаукомного обществаСателлитные симпозиумы в рамках ХV Юбилейного конгресса Росс...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017Сателлитные симпозиумы в рамках конференции Современные техн...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2017»«Живая хирургия» в рамках конференции «Современные технологи...

Эндокринная офтальмопатия Научно-практическая конференцияЭндокринная офтальмопатия Научно-практическая конференция

Сателлитные симпозиумы в рамках X Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках X Российского общенациональн...

Фемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всероссийская научно-практическая конференцияФемтосекундные технологии в офтальмологии Юбилейная всеросси...

Федоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2017 XIV Всероссийская научно-практичес...

Федоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XIV Всероссийской научно-практической конференцииФедоровские чтения - 2017 Сателлитные симпозиумы в рамках XI...

Актуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XII Всероссийская научная ...

Top.Mail.Ru


Open Archives