Год
2018

Лечение повреждений роговицы с помощью комбинированной биоконструкции с клетками буккального эпителия (экспериментально-клиническое исследование)


Органзации: 1«НМИЦ глазных болезней им.Гельмгольца» Минздрава РоссииВ оригинале: ФГБУ Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца Росмедтехнологий



Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Общая характеристика работы


Актуальность проблемы
    Заболевания роговицы занимают одно из ведущих мест в мире среди причин слепоты и слабовидения и составляют более 35% в структуре глазной заболеваемости. Значительную часть повреждений составляют травматические поражения переднего отрезка глаза. По данным различных авторов, более 87% пострадавших составляют люди трудоспособного возраста и почти у каждого третьего последствия травмы ведут к инвалидизации, что и обусловливает медико-социальную и экономическую значимость данной проблемы в офтальмопатологии (Гундорова Р.А. 2014, Либман Е.С., Рязанов Д.П., Калеева Э.В., 2012, и др).

    Основным методом лечения патологии роговицы на сегодняшний день остается хирургическое вмешательство на роговой оболочке – послойная или сквозная кератопластика, аутотенонопластика, покрытие аутоконъюнктивой, пластика амниотичекой оболочкой и т.д. (Ким А.Э., 2009; Каспарова Е.А., Труфанов С.В. 2010; Канукова Т.А. 2014, Мороз О.В. 2014 и др.). Несмотря на активное развитие хирургической техники, сохраняется высокая частота рецидивов после оперативного вмешательства, отторжение и некроз трансплантата, развитие иммунологического конфликта. Болезнь трансплантата с исходом в помутнение после кератопластики, по данным литературы, встречается от 53 до 82%, при рекератопластике - от 32 до 87 % случаев (Ходжабекян Г.В., 2003; Curran S., Murray G.I., 2000). Кроме того, на сегодняшний день трудности кератопластики напрямую связаны с острой проблемой дефицита донорских роговиц, а также возрастающим количеством пациентов, ожидающих очереди на пересадку. Сохраняется высокая частота рецидивов после хирургического вмешательства, отторжение и некроз трансплантата, развитие иммунологического конфликта, что требует поиска альтернативных подходов к лечению таких пациентов. В последнее время внимание исследователей привлечено к поиску возможностей восстановления структуры тканевых дефектов с применением клеточных технологий.
Степень разработанности темы
    В офтальмологии, как и в других областях медицины, возрастает интерес к изучению влияния стволовых клеток, как аллогенных, так и аутологичных, культивированных вне организма, на процессы репарации и регенерации в поврежденных тканях глаза (Гундорова Р.А., Канукова Т.А., Капитонов Ю.А. 2014, Николаева Л.Р. 2006.; Арутюнова И.Р. 2001.; Ченцова Е.В., 2001-2015, Сапоровский С. С. 1994., Ходжабекян Г.В., Гундорова Р.А., Макаров П.В., Тверских В.В. 2003). Большой интерес по данному вопросу, на наш взгляд, представляет трансплантация аутологичных стволовых клеток, выделенных из буккального эпителия взрослого человека.

    Буккальный эпителий, также как и эпителий роговицы, является многослойным плоским неороговевающим. Клетки буккального эпителия сравнительно легко выделить, они хорошо пролиферируют в культуре и поэтому могут быть источником аутологичных прогениторных клеток. В 2003 году Nakamura Т. и Kinoshita S. в эксперименте продемонстрировали высокий регенераторный потенциал культивированных клеток буккального эпителия при его трансплантации на поврежденную роговицу.

    Позже группа авторов (G. Priya, P. Arpitha, S. Vaishali at al, 2011) культивировали клетки буккального эпителия на амниотической мембране и затем трансплантировали пациентам с билатеральной формой лимбально -клеточной недостаточности. Расширенный иммуногистологический и морфологический анализ результатов показал высокую эффективность данного метода лечения. Подобные работы проводятся в настоящее время в различных странах мира (D. Dobrowolski, B. Orzechowska-Wylegala, B. Wowra 2015; C. Sotozono, T. Inatomi, T. Nakamura 2013; Y. Hayashida, K. Nishida, M. Yamato 2004г и др).

    Несмотря на все более возрастающий интерес к использованию клеток буккального эпителия в качестве метода репаративной терапии, до настоящего времени остается нерешенным вопрос доступного и безопасного носителя для клеток и создания биоконструкции, удобной для широкого применения в клинике.
Цели и задачи работы
    Цель работы – разработать способ лечения дефектов роговицы различного генеза клетками буккального эпителия на коллагеновом носителе и оценить их влияние на процессы регенерации роговицы в эксперименте и в клинике.

    Для достижения поставленной цели в работе определены следующие задачи:

    1. Разработать методику лечения дефектов роговицы с помощью культивированных клеток буккального эпителия и технологию их применения.

    2. Оптимизировать метод выделения и масштабирования клеток буккального эпителия из слизистой щеки для лечения дефектов роговицы.

    3. В эксперименте провести оценку безопасности компонентов биоконструкции при лечении глубоких дефектов роговицы.

    4. Оценить влияние трансплантации комбинированной биоконструкции с клетками буккального эпителия на заживление эпителиально-стромального дефекта роговицы в эксперименте.

    5. Оценить эффективность лечения тяжелых ожогов роговой оболочки глаза человека аутологичными клетками буккального эпителия.
Научная новизна
    1. Впервые разработан способ лечения глубоких дефектов роговицы с применением культивированных клеток буккального эпителия и разработана методика их трансплантации на биосовместимом коллагеновом носителе в составе комбинированной биоконструкции.

    2. Оптимизирован метод выделения, культивирования и масштабирования клеток буккального эпителия из слизистой щеки для создания комбинированной биоконструкции.

    3. Впервые на модели эпителиально-стромального дефекта показана эффективность лечения повреждений роговицы комбинированной биоконструкцией, содержащей культивированные клетки буккального эпителия.

    4. Детальное морфологическое исследование показало стимулирующее воздействие культивированных клеток буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции на процессы репарации и регенерации в ходе лечения дефектов роговицы.

    5. Впервые разработан и успешно опробован в клинике метод лечения дефектов роговицы аутологичными клетками буккального эпителия у пациентов с ожогами переднего отрезка глаза, тяжелыми и средней степени тяжести.
Теоретическая и практическая значимость работы
    1. Впервые в офтальмологии разработан способ лечения глубоких дефектов роговицы с помощью клеток буккального эпителия на коллагеновом носителе в составе комбинированной биоконструкции. Экспериментально на модели эпителиально-стромального дефекта, а также с помощью морфологического исследования, показана безопасность и эффективность данной методики. Клетки буккального эпителия обладают стимулирующим влиянием на репаративные процессы, а также оказывают противовоспалительное действие и предупреждают образование грубой рубцовой ткани в области повреждения.

    2. Впервые в офтальмологии показана клиническая эффективность лечения глубоких дефектов роговицы аутологичными клетками буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции у пациентов с ожогами переднего отрезка глаза.

    3. Учитывая доступность аутологичного буккального эпителия, простоту получения материала, возможность постоянного поддержания его запаса в виде культуры, а также простоту способа трансплантации, предложенный метод позволит открыть новые перспективы для лечения повреждений роговицы и состояний, сопровождающихся замедлением репаративных процессов. Использование данной методики уже на ранних стадиях заболевания позволит сократить частоту обращения к радикальной хирургической тактике.
Методология и методы исследования
    Работа выполнена в дизайне экспериментально-клинического исследования с использованием клинических, инструментальных и морфологических методов.
Положения, выносимые на защиту
    1. Разработан инновационный метод лечения глубоких дефектов роговицы с помощью культивированных клеток буккального эпителия на коллагеновом носителе в составе комбинированной биоконструкции.

    2. Оптимизирована методика выделения, культивирования и масштабирования клеток буккального эпителия из слизистой щеки для создания комбинированной биоконструкции.

    3. Доказано (экспериментально и в клиническом исследовании), что лечение дефектов роговицы путем трансплантации комбинированной биоконструкции является эффективным, т.к. аутологичные клетки буккального эпителия в ее составе оказывают выраженное стимулирующее действие на процессы заживления дефекта роговицы.

    4. Морфологические исследования показали, что применение клеток буккального эпителия обеспечивает более качественное заживление дефекта роговицы с формированием физиологической слоистости эпителиального покрова, полноценного стромального слоя, а также уменьшение количества клеток воспаления в ткани роговицы.
Степень достоверности, апробация результатов
    Степень достоверности проведённых исследований определяется достаточным объёмом выборки исследований. Работа выполнена с использованием современных методов обследования. Методы статистической обработки полученных результатов адекватны поставленным задачам. Сформулированные в диссертации выводы и положения аргументированы и логически вытекают из результатов многоуровневого анализа.

    Основные положения диссертации и результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: Российский общенациональный офтальмологический форум «РООФ-2014» (Москва, 2014); международный съезд ассоциации офтальмотравматологов ISOT (Сингапур, 2016) конференция с международным участием «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии» (Москва, 2016); межотделенческая конференция ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца (Москва, 2018).
Публикации
    По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ в журналах, в том числе в 4 рецензируемых ВАК РФ. Получен 1 патент «Способ лечения глубоких дефектов роговицы» №2015152299 от 09.01.2017 авторы: Ченцова Е.В., Боровкова Н.В., Егорова Н.С., Макаров М.С. Конюшко О.И.
Структура и объем диссертации
    Диссертация содержит 151 страницу компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Диссертация иллюстрирована 95 фотографиями, 5 диаграммами и 4 таблицами. Список использованной литературы содержит 220 источников, из которых 104 опубликовано в отечественных и 116 – в зарубежных изданиях.

Содержание работы


Материалы и методы исследования
     Работа выполнена на базе ФГБУ «МНИИ ГБ им.Гельмгольца» Минздрава России под руководством д.м.н., проф. Ченцовой Е.В. в Отделе травматологии и реконструктивной хирургии (руководитель д.м.н., проф. Ченцова Е.В.) и ГБУЗ НИИ СП им. Н.В.Склифосовского Департамента Здравоохранения города Москвы под руководством д.м.н. Боровковой Н.В. в Лаборатории трансплантации клеток и иммунотипирования (зав. Лабораторией д.м.н. Боровкова Н.В.)

    Материалы и методы исследования.

    Исследование включает экспериментальную и клиническую части.

    Экспериментальное исследование проведено на 80 глазах 46 кроликов породы Шиншилла, массой 2,0-2,5 кг. Все работы проведены в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях №123 от 18.03.1986 г. и Приказом МЗ СССР №755 от 12.08.1975 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Для проведения любых вмешательств животные вводились в состояние медикаментозного сна (Sol. Ketamini 5% в дозе 1 мг/кг, 2% раствор ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг в/м, местно Sol.Dicaini1,0%).

    В ходе работы нами совместно с сотрудниками ГБУЗ НИИ СП им. Н.В.Склифосовского разработан инновационный способ лечения дефектов роговицы с использованием оригинальной биоконструкции, имеющей 3 основные части (рис.1):

    • Подложка. В качестве подложки использована мягкая контактная линза.

    • Биосовместимый носитель - коллагеновый матрикс для размещения на нем клеток буккального эпителия

    • Культивированные клетки буккального эпителия

    Культуру клеток получали в Лаборатории трансплантации клеток и иммунотипирования из биоптата слизистой щеки кролика. Забор биоматериала осуществляли в условиях операционной в состоянии медикаментозного сна животного. В лаборатории, в условиях стерильного культурального блока из лоскута слизистой оболочки щеки кролика получали первичную культуру буккального эпителия. Далее проводили масштабирование культуры клеток с получением монослоя.

    Работы по культивированию клеток, анализ биологической полноценности клеток, а также изготовление биоконструкции проводили на базе лаборатории трансплантации клеток и иммунотипирования ГБУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского к.б.н. Конюшко О.И, к.м.н. Сторожева М.В, к.м.н. Макаров М.С..

    В ходе подбора коллагенового матрикса изучены два варианта:

    1. Коллаген I типа, полученный из сухожилий кроликов методом кислотной экстракции.

    2. Кератопротектор коллагеновый Аппликолл на основе коллагена II типа.

    Получение коллагена I типа проводили совместно с сотрудниками лаборатории трансплантации клеток и иммунотипирования ГБУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского из сухожилий лабораторных животных, а именно, кроликов породы Шиншилла стандартным методом кислотной экстракции.

    Полученный коллаген I типа наносили на поверхность контактных линз. Для этого в стерильных условиях из контейнера с контактной линзой удаляли исходную жидкость и заполняли линзу жидким коллагеном I типа. Затем линзу, покрытую коллагеном I типа, подсушивали в ламинарном шкафу при облучении бактерицидной лампой в течение 40 минут и вместе с контейнером помещали в стерильную чашку Петри. В результате получали коллагеновую повязку рН=6,2, на которую помещали культивированные клетки буккального эпителия.

    В качестве матрикса на основе коллагена II типа использовали кератопротектор коллагеновый Аппликолл. Производство данных видов кератопротекторов осуществляется компанией ООО «МакМеди» (регистрационный номер ФСР 2009/05861). Аппликолл изготавливают из коллагена соединительной ткани сельскохозяйственных животных, выпускается в индивидуальной герметичной упаковке, стерильным. В ходе работы нами использован Кератопротектор коллагеновый Аппликолл в виде полусферической пленки, повторяющей кривизну роговицы.

    Экспериментальная часть работы представляет 5 серий экспериментов:

    • две предварительные серии

    • три основные серии

    Целью предварительных серий экспериментов являлась оценка переносимости изучаемых коллагеновых матриксов, данные серии проводились на глазах с неповрежденной роговицей. Предварительные серии экспериментов выполнены автором совместно с к.м.н. Зиновьевым М.Ю.

    I предварительная серия (6 кроликов, 6 глаз) - оценка переносимости матрикса на основе коллагена I типа, полученного их сухожилий кроликов методом кислотной экстракции. С этой целью на неповрежденную роговицу правого глаза каждого кролика укладывали часть биоконструкции, состоящую из мягкой контактной линзы и коллагена I типа и проводили временную блефарорафию на 3 суток. Левый глаз оставался интактным.

    Оценку результатов эксперимента проводили на 3, 7, 14 сутки.

    По результатам первой предварительной серии было принято решение о модификации стандартной методики получения матрикса на основе коллагена I типа с дополнительным снижением концентрации уксусной кислоты.

    II предварительная серия (6 кроликов, 6 глаз)- оценка переносимости матрикса на основе коллагена I типа, полученного методом кислотной экстракции с дополнительным снижением концентрации уксусной кислоты.

    Для этого на неповрежденную роговицу правого глаза каждого кролика укладывали часть биоконструкции, состоящую из мягкой контактной линзы и коллагена I типа со сниженной кислотностью и проводили временную блефарорафию на 3 суток. Левый глаз оставался интактным. Оценку результатов эксперимента проводили на 3, 7 и 14 сутки.

    Основные серии экспериментального исследования проводили с целью изучения влияния клеток буккального эпителия в составе биоконструкции на процессы регенерации поврежденной роговицы. Для моделирования повреждения роговицы лабораторным животным производили дозированную кератэктомию с формированием эпителиально-стромального дефекта.

    Ход операции: У кролика на обоих глазах трепаном с дозируемой насадкой (Hessberg-Barron) диаметром 8мм проводили трепанацию в центральной зоне роговицы на глубину 160 мкм. Затем эпителий и часть стромы удаляли с помощью круглого ножа. Сразу после кратэктомии на глаза опытных групп помещали клетки буккального эпителия на коллагеновом матриксе в составе биоконструкции. Операцию завершали блефарорафией сроком на 3 суток. Глаза контрольных групп лечили в соответствие задачей конкретной серии экспериментальной работы.

    Непосредственно после операции и в течение 10 дней в послеоперационном периоде проводили противовоспалительную терапию в целях профилактики присоединения вторичной инфекции.

    I основная серия (8 кроликов, 16 глаз) - сравнительная оценка влияния клеток буккального эпителия в составе биоконструкции на основе двух матриксов:

    1. Коллаген I типа со сниженной кислотностью.

    2. Кератопротектор коллагеновый Аппликолл.

    3. Контрольную группу составляли глаза, на которых проводили консервативное лечение, включающее репаративный препарат (Корнерегель 1 кап. 3 раза в сутки).

    Выполнено автором совместно с Флорой С.В. Ежедневное наблюдение динамики клинико-экспериментальным данных в течение 30 суток автор проводила самостоятельно. На 30е сутки эксперимента проведено морфологическое исследование.

    II основная серия (6 кроликов, 12 глаз) - оценка влияния клеточного компонента изучаемой биоконструкции на процессы регенерации роговицы.

    Лабораторные животные были разделены на 2 группы:

    1. На 6 правых глазах после кератэктомии укладывали биоконструкцию на матриксе из коллагена I типа со сниженной кислотностью с клетками буккального эпителия (опытные глаза);

    2. На 6 левых глазах применяли биоконструкцию с матриксом из коллагена I типа со сниженной кислотностью без клеток (контрольные глаза).

    Проводили ежедневное наблюдение динамики клинико-экспериментальных данных в течение 30 суток. Эксперимент выполнен автором самостоятельно.

    III основная серия (20 кроликов, 40 глаз). Проводили изучение эффективности влияния клеток буккального эпителия на матриксе из коллагена I типа в составе биоконструкции на процессы регенерации эпителиально-стромального дефекта роговицы кролика. В качестве контрольной группы использованы парные глаза, где на дефекты накладывали покрытие в виде МКЛ iWear dr Comfort. Выполнено совместно с Флорой С.В. Ежедневное наблюдение, оценку клинико-экспериментальных данных автор проводила самостоятельно. На 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения проведено морфологическое исследование.

    Для наблюдения за состоянием глаз использовали следующие клинико-экспериментальные методы исследования: общий осмотр переднего отрезка глаз животных с помощью фокального и бокового освещения [90], биомикроскопия щелевой лампой, витальная окраска флуоресцеином, фоторегистрация, измерение размера дефекта с помощью линейки.

    Исследование микропрепаратов проводили в Лаборатории трансплантации клеток и иммунотипирования НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского совместно с к.м.н. Макаровым М.С. на 3, 7, 14 и 30 сутки экспериментального исследования. Для приготовления гистологических препаратов образцы глаз животных фиксировали 10% формалином и заливали в парафин для изготовления стандартных срезов, которые окрашивали гематоксилин-эозином, и затем анализировали с помощью светового микроскопа.

    Для морфологического исследования препаратов применяли следующие методы: световая микроскопия, фоторегистрация окрашенных препаратов. Структурную целостность коллагеновых волокон роговицы оценивали по уровню их автофлуоресценции в гистологических препаратах с помощью флуоресцентной микроскопии (λ возбуждения = 510-560 нм, λ эмиссии – от 575 нм, время экспозиции – 1сек).

    Ограниченное клиническое исследование эффективности лечения эрозий роговицы аутологичными клетками буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции разрешено Комитетом по этике ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней (протокол № 31/5 от 01.03.2016 и протокол № 32/2 от 19.05.2016) . Проведено у 10 пациентов, из них 8 мужчин и 2 женщины в возрасте от 19 до 48 лет с диагнозами термохимический ожог (3 пациента) и химический ожог роговицы (7 пациентов) различной степени тяжести, с преобладанием тяжелой: средней (2 пациента), тяжелой (8 пациентов) (по классификации Н.А.Пучковской). Сроки поступления в стационар варьировали от 2 суток (в 2 случаях) до 2 месяцев (в 1 случае), в среднем 5-14 дней с момента ожога. Во всех случаях имело место повреждение роговицы, характеризующееся наличием некроза лимбальной зоны, эрозии, тотальной или субтотальной, с изъязвлением.

    Для каждого пациента создавали аутологичную культуру клеток буккального эпителия и проводили трансплантацию в составе комбинированной биоконструкции на поврежденную роговицу.

    Забор лоскута слизистой щеки пациентов осуществляли в условиях операционной с соблюдением правил асептики и антисептики. После проведения местной аналгезии в области внутренней поверхности щеки отслаивали участок слизистой оболочки 3х3 мм путем введения 2,0 мл физ.раствора, затем отсекали от подлежащей ткани и помещали в контейнер со стерильной питательной средой. В месте выкраивания лоскута производили гемостаз. Хирург д.м.н. Филатова И.А.

    Трансплантацию аутологичных клеток буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции проводили в условиях операционной с соблюдением правил асептики и антисептики. После установки векорасширителя на веки биоконструкцию укладывали на дефект роговицы.

    Затем на веки накладывали фиксирующую повязку. Данную манипуляцию автор проводила самостоятельно. Сроки экспозиции варьировали от 3 до 5 суток в зависимости от тяжести состояния. При необходимости методику применяли повторно до получения выраженного клинического эффекта.

    Наблюдение в стационаре проводилось ежедневно, а также после выписки.

    Для оценки клинической эффективности лечения комбинированной биоконструкцией с клетками буккального эпителия оценивали следующие критерии:

    • жалобы (боль в глазу, роговичный синдром)

    • воспалительная реакция (инъекция конъюнктивы, отек роговицы, ирит)

    • завершение эпителизации роговицы

    • остроту зрения в динамике

    Статистическая обработка проведена автором самостоятельно с использованием общепринятых критериев. Для оценки статистической разницы в динамике размеров остаточной эрозии экспериментальных групп использовали Student’s t-test. Для статистической оценки вероятности наступления признаков, таких как полная эпителизация дефекта, рецидив эрозии, формирование помутнения, использовали критерий Xi- квадрат Пирсона.
Результаты собственных исследований
     Получение культуры клеток буккального эпителия из биоптата защечного эпителия кролика. Изготовление биоконструкции.

    Результаты получены совместно с сотрудниками Лаборатории трансплантации клеток и иммунотипирования НИИ скорой помощи им. Склифосовского. В условиях стерильного культурального блока из лоскута слизистой оболочки щеки получали первичную культуру буккального эпителия. Для культивирования использовали полную ростовую среду DМЕМ/F12 (1:1) с добавлением глютамина (2мМ L), гентамицина (50мкг/мл), 10% заменителя эмбриональной телячьей сыворотки, смену среды производили каждые 2 дня. Далее проводили масштабирование культуры клеток с получением монослоя. После формирования монослоем клеток конфлуентного состояния (клетки занимали 80-90% поверхности чашки) проводили первый пассаж и продолжали культивировать в стандартных условиях (37° С, 5% СО2 ). Выделенные клетки буккального эпителия при культивировании в ростовой среде хорошо прикреплялись, сохраняли высокую жизнеспособность и пролиферацию.

    Спустя две недели после этого проводили второй пассаж. На втором пассаже получали достаточное для изготовления биоконструкции количество клеток буккального эпителия. В дальнейшем, клетки второго пассажа использовали для изготовления биотрансплантатов.

    Суспензию клеток буккального эпителия второго пассажа в ростовой среде DMEM/F12 с 10% эмбриональной сыворотки «Gibco» наносили на подготовленные контактные линзы, покрытые коллагеновым матриксом и помещали в CO 2 инкубатор при стандартных условиях культивирования (37 о С и 5% СО2 в атмосфере) на 24 часа. Отмечено, что через 24 часа клетки сохраняли свою морфологию и способность к пролиферации. Таким образом, исследованные нами коллагены, как I, так и II типа, пригодны для создания биотрансплантатов, предназначенных для использования в офтальмологической практике.

    Исследование переносимости матрикса на основе коллагена I типа тканью роговицы.

    В ходе предварительных серий экспериментальной работы было установлено, что примесь уксусной кислоты в коллагеновом матриксе, используемая в качестве растворителя коллагена в стандартной методике его получения, оказывала агрессивное воздействие на роговицу кролика. В связи с вышесказанным, принято решение о модификации способа получения матрикса на основе коллагена I типа с дополнительным снижением концентрации уксусной кислоты. В результате получили безопасный для использования на тканях переднего отрезка глаза коллагеновый материал.

    Сравнительная оценка результатов лечения дефектов роговицы клетками буккального эпителия на основе двух матриксов в составе биоконструкции

    В группе, где лечение проводили с применением клеток буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции, значительно ускоряются сроки регенерации эпителиально-стромального дефекта роговицы. Уже на 3 сутки наблюдали выраженное сокращение дефекта в обеих опытных группах (с коллагеном I и II типов) по сравнению с контролем: на 27% и 35%. Причем разница между 1 и 2 группами статистически недостоверна (tэмп=0,06, р>0,05), в то время как отличие от контрольной группы статистически достоверно (tэмп=3,4, р<0,05).

    Стоит отметить, что при лечении клетками буккального эпителия в составе биоконструкции на Аппликолле уже на 5 сутки эксперимента прокрашивание дефекта флуоресцеином отсутствовало на 4 глазах из 5, в то время как при использовании клеток буккального эпителия на коллагене I типа полная эпителизация наблюдали лишь в одном случае. Таким образом, вероятность наступления эпителизации на данном этапе во 2 группе статистически выше по сравнению со 1 группой. Однако обращает на себя внимание частое возникновение рецидива эрозии в группе с Аппликоллом при дальнейшем наблюдении (рис.2).

    Полученные совместно с д.м.н. Боровковой Н.В. и к.м.н. Макаровым М.С. клинико-морфологические результаты данной серии эксперимента свидетельствуют об эффективности лечения дефектов роговицы с помощью клеток буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции на основе коллагена как I, так и II типа и клеток буккального эпителия для лечения глубоких ран роговицы. Применение клеток буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции позволяет сократить время полной эпителизации травматического дефекта в среднем на 7 дней по сравнению со стандартным консервативным лечением. Однако обращает на себя внимание более частое возникновение такого явления как рецидив эрозии во 2 группе (с клетками буккального эпителия на матриксе в виде кератопротектора коллагенового Аппликолл), по сравнению с 1 группой (с матриксом из коллагена I типа). Вероятно, ускоренная эпителизация при использовании в качестве матрикса-носителя коллагена II типа проходила без ускорения роста и созревания стромы, в первую очередь, ее межклеточного вещества. Таким образом, исходя из морфологической картины 30 суток наблюдения, можно предположить, что причиной отслоения новообразованного эпителия роговицы явилось отсутствие нормальной топографии подлежащих слоев. Исходя из вышесказанного, принято решение о продолжении экспериментального исследования биоконструкции с клетками буккального эпителия на основе матрикса из коллагена I типа.

    Оценка динамики регенерации эпителиально-стромального дефекта роговицы под влиянием клеточного компонента биоконструкции

    По результатам данной экспериментальной серии было обнаружено, что использование клеток буккального эпителия в составе биоконструкции ускоряет заживление дефекта (в среднем на 7 суток) по сравнению с контролем, а также способствует формированию более нежной рубцовой ткани в отдаленные сроки (1-2 балла по шкале Войно-Ясенецкого по сравнению с 4-5 баллами в контроле). Таким образом, можно сделать вывод о стимулирующем воздействии клеток буккального эпителия на заживления дефекта (табл.2).

    Положительное влияние клеточного компонента в составе комбинированной биоконструкции, на наш взгляд, связано с выработкой прогениторными клетками буккального эпителия репаративных факторов: цитокинов, факторов роста, таких как ИЛ-1 и ИЛ-6, фактора некроза опухолей (TNF), колониестимулирующего фактора роста, фактора роста эпителия (EGF), трансформирующего фактора роста (TGF-3). Несмотря на то, что в составе биоконструкции клетки лишены возможности к длительному (в течение недель) существованию, показано, что они дают массивный, но краткосрочный выброс репаративных факторов, оказывающих действие в первые трое суток лечения. Такой короткий выброс факторов репарации является вполне адекватным и достаточным для обеспечения положительного влияния на лечение дефектов роговицы.

    Изучение эффективности лечения эпителиально-стромального дефекта роговицы кролика клетками буккального эпителия на матриксе из коллагена I типа.

    В III основной экспериментальной серии проводили изучение эффективности влияния биоконструкции с клетками буккального эпителия на матриксе из коллагена I типа на процессы регенерации эпителиально-стромального дефекта роговицы кролика. Уже на 7е сутки наблюдали достоверное ускорение заживления дефекта роговицы при лечении биоконструкцией с клетками буккального эпителия на матриксе из коллагена I типа (табл. 4). В ходе всего дальнейшего наблюдения (30 суток) также выявлено ускоренное заживление эпителиально-стромального дефекта роговицы в опытной группе по сравнению с контролем. Стоит отметить формирование более нежной рубцовой ткани в отдаленные сроки наблюдения (на опытных глазах степень помутнения роговицы составляла 2-3 балла по шкале Войно-Ясенецкого, в то время как на контрольных – 3-4 балла).

    При проведении морфологического исследования совместно с д.м.н. Боровковой Н.В. и к.м.н. Макаровым М.С. выявлено:

    1. Достоверное ускорение сроков начала эпителизации

    2. Ускоренные по сравнению с контрольными группами темпы эпителизации поверхности роговицы

    3. Формирование более полноценной структуры ткани роговицы, эпителиального пласта и стромы

    Вышеописанные данные свидетельствуют об ускорении и повышении качества заживления дефекта роговицы в результате использования биоконструкции с клетками буккального эпителия на матриксе из коллагена I типа.

    Ограниченное клиническое исследование эффективности лечения дефектов роговицы аутологичными клетками буккального эпителия.

     Ограниченное клиническое исследование проведено у 10 пациентов, из них 8 мужчин и 2 женщины в возрасте от 19 до 48 лет. Пациенты поступали в офтальмологический стационар с диагнозами термохимический ожог (3 пациента) и химический ожог роговицы (7 пациентов) различной степени тяжести, с преобладанием тяжелой: средней (2 пациента), тяжелой (8 пациентов). Сроки поступления в стационар варьировали от 2 суток (в 2 случаях) до 2 месяцев (в 1 случае), в среднем 5-14 дней с момента ожога. У всех исследуемых на момент поступления наблюдали блефароспазм, слезотечение, выраженную воспалительную реакцию: смешанная инъекция конъюнктивы, хемоз. Отмечали резкую ишемию лимбальной зоны (от ⅓ до ½ окружности) и отек роговицы. Во всех случаях имело место повреждение роговицы, характеризующееся наличием глубокой эрозии, тотальной или субтотальной, что могло привести к изъязвлению и перфорации роговицы.

    Отмечали помутнение роговицы от поверхностного («запотевшее стекло») до стромального («матовое стекло»). Острота зрения варьировала от 0,01 до 0,1, в среднем 0,05.

    Всем пациентам было проведено традиционное лечение. Местная консервативная терапия (в виде инстилляций и инъекций) включала антибактериальные, противовоспалительные, препараты для коррекции биохимических нарушений, слезозаменители, репаративное лечение.

    Системно пациенты получали антибактериальную и противовоспалительную терапию, ингибиторы протеолитических ферментов. Хирургическое лечение включало первичную и отсроченную хирургическую обработку в момент поступления в стационар, трансплантацию амниотической мембраны (от 1 до 3 раз в зависимости от тяжести состояния).

    На фоне проводимого лечения видимого улучшения состояния не было. У всех исследуемых пациентов наблюдали II – III стадии ожоговой болезни (по классификации Р.А. Гундоровой и Г.Г.Бордюговой), характеризующиеся ишемией лимбальной зоны, незаживающей эрозией роговицы с изъязвлением. Сохранялся отек роговицы и помутнение ее слоев. В связи с вышеописанной клинической картиной, затяжным характером течения изъязвления роговицы, а также учитывая, что разработанный метод лечения является не инвазивным, а аппликационным, с использованием собственного материала пациента, принято решение о трансплантации данным пациентам аутологичных клеток буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции.

    В день поступления у всех пациентов исследуемой группы производили забор лоскута слизистой щеки для выделения и культивирования аутологичных клеток буккального эпителия и изготовления комбинированной биоконструкции. По мере готовности комбинированной биоконструкции с аутологичными клетками буккального эпителия (в среднем 14 дней) осуществляли ее трансплантацию на срок от 3 до 5 суток в зависимости от тяжести состояния.

    После снятия биоконструкции у всех пациентов отмечали сокращение площади эрозии и ее глубины, а также уменьшение отека и повышение прозрачности ткани роговицы. Через 6-8 суток после лечения аутологичными клетками буккального эпителия наблюдали полную эпителизацию у 7 пациентов, еще у 3 эрозия сохранялась, однако ее площадь и глубина значительно уменьшились. Стоит отметить, что у всех пациентов отек роговицы купирован на 3-4 сутки после лечения. Помутнение роговицы сохранялось у 8 пациентов, однако носило поверхностный характер. Острота зрения составляла в среднем 0,1-0,2.

    У 3 пациентов предпринята повторная трансплантация аутологичных клеток буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции с через 5-9 дней после первого этапа лечения. В результате повторного лечения биоконструкцией уже на 3-5 сутки на всех глазах роговица была эпителизирована, воспалительная реакция полностью купирована. Острота зрения составляла в среднем 0,1-0,15. Пациентов выписывали для динамического наблюдения.

    Общий срок наблюдения составил от 6 мес до 1,5 лет. За этот период рецидив эрозии наблюдали у 3 пациентов в среднем через 1,5-2 месяца после лечения. При повторном поступлении в стационар этим пациентам проводили лечение аутологичными клетками буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции, которые культивировали из материала, сохраненного в лаборатории путем заморозки. В результате добивались полной эпителизации эрозии роговицы.

    Таким образом, во всех клинических наблюдениях у пациентов с тяжелыми термохимическими и химическими ожогами, с длительно незаживающим повреждением роговицы лечение аутологичными клетками буккального эпителия позволило достичь сокращения площади и глубины эрозии и в дальнейшем полная эпителизации в короткие сроки (от 3 до 13 дней). Кроме того, в случае с персистирующей ожоговой эрозией данная методика позволила увеличить время ремиссии.

    Стоит отметить, что частота использования биоконструкции может варьировать в зависимости от тяжести повреждения роговицы. Учитывая возможность сохранять в замороженном виде аутологичные клетки буккального эпителия для каждого пациента, возможно повторное приготовление биоконструкции в короткие сроки (1-2 дня), что позволяет применять повторно аутологичные клетки буккального эпителия для усиления эффекта и при рецидиве ожоговой эрозии. Клиническая апробация показала эффективность многократного применения аутологичных клеток буккального эпителия у больных с тяжелой формой ожоговой болезни.

    Исходя из полученных клинических результатов, можно заключить, что культивированные аутологичные клетки буккального эпителия на коллагеновом матриксе стимулируют заживление эрозии и язвенного дефекта роговицы на различных этапах лечения, способствуют купированию воспалительного процесса, а также торможению васкуляризации и конъюнктивизации пораженной зоны. Мы считаем, что данную методику можно применять при рецидивирующих эрозиях различной этиологии.

    Полученные результаты могут являться основой для проведения дальнейших клинических исследований.

Выводы

    1. Разработан инновационный метод лечения повреждений роговицы с помощью клеток буккального эпителия на биосовместимом носителе на основе коллагена I типа.

    2. Использованный в работе метод культивирования полученных из биоптата клеток буккального эпителия является адекватным: клетки сохраняют высокий уровень жизнеспособности, пролиферативной и секреторной активности, и способностью к дифференцировке. Данная клеточная культура может быть использована для лечения повреждений роговицы в составе комбинированной биоконструкции.

    3. Коллаген I типа, выделенный методом кислотной экстракции с дополнительным снижением кислотности, является безопасным для применения в комбинированной биоконструкции с культивированными клетками, разработанной для лечения повреждений роговицы.

    4. Лечение эпителиально-стромального дефекта роговицы клетками буккального эпителия на коллагеновом матриксе позволяет сократить время эпителизации в среднем на 7 дней по сравнению со стандартным консервативным лечением (в эксперименте) (χ²=4,821 при р<0,05). Морфологическое исследование подтвердило стимулирующее влияние на репаративные процессы в тканях роговицы и снижение выраженности воспалительной реакции.

    5. Лечение аутологичными клетками буккального эпителия в составе биоконструкции (в ограниченном клиническом исследовании) привело к сокращению площади и глубины эрозии и язвенного дефекта у пациентов с тяжелыми ожогами, позволило достичь полной эпителизации в короткие сроки (6-13 суток), а также продлить время ремиссии.

Практические рекомендации

    1. Стимулирующее влияние на репаративные процессы в роговице позволяет применять комбинированную биоконструкцию с клетками буккального эпителия при состояниях, сопровождающихся замедлением эпителизации, таких как эрозии и язвенные дефекты роговицы различной этиологии.

    2. Полученные результаты ограниченной клинической апробации комбинированной биоконструкции с аутологичными клетками буккального эпителия предполагают возможность применения данного метода при ожогах различной степени тяжести и на разных стадиях ожоговой болезни, а также для лечения состояний, сопровождающихся глубокими дефектами роговицы.

    3. Хранение в замороженном виде аутологичных клеток буккального эпителия отдельно каждого пациента, а соответственно изготовление биоконструкции в короткие сроки (1-2 дня), позволит применять ее повторно при лечении ожоговой и эрозий роговицы другой этиологии, склонных к рецидивирующему течению.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

    1. Оптимизация метода выделения и культивирования клеток буккального эпителия на коллагеновых подложках для применения в офтальмологии / Ченцова Е.В., Конюшко О.И., Макаров М.С., Егорова Н.С., Зиновьев М.Ю., Боровкова Н.В. // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2015. - № 1.-С.56-60.

    2. Разработка биоинженерной конструкции с клетками буккального эпителия / Ченцова Е.В., Макаров М.С., Егорова Н.С., Боровкова Н.В. // Сб. науч. практ.конф.: Актуальные вопросы микрохирургии глаза - Ташкент, 2016 – С. 124.

    3. Оценка эффективности трансплантации биоинженерной конструкции с клетками буккального эпителия при дефектах роговицы в эксперименте. / Егорова Н.С., Ченцова Е.В., Макаров М.С., Боровкова Н.В., Конюшко О.И. // IX Российский общенациональный офтальмологический форум: сб.трудов. – М.,2016 – Т 2. – с.378.

    4. Технологии создания, оценка биосовместимости и безопасности коллагенового матрикса в составе биоинженерной клеточной конструкции. / Егорова Н.С., Ченцова Е.В., Флора С.В., Макаров М.С., Боровкова Н.В., Конюшко О.И. // Российский офтальмологический журнал. – 2017. - №2. – С.71-78.

    5. Репаративный эффект биоконструкции на основе коллагена I типа и клеток буккального эпителия при лечении глубоких дефектов роговицы в эксперименте. / Егорова Н.С., Ченцова Е.В., Макаров М.С., Боровкова Н.В., Сторожева М.В. // Трансплантология. – 2017. – Т.9 - №3. – С. 226-236.

    6. Оценка эффективности биоконструкций с клетками буккального эпителия на основе коллагеновых матриц при лечении дефектов роговицы кролика / Егорова Н.С., Ченцова Е.В., Макаров М.С., Боровкова Н.В., Сторожева М.В., Маклакова И.А.// Катарактальная и рефракционная хирургия. – 2017. - №2. – С.52-58. В том числе

    7. Патент № RU 2609253 C1 Способ лечения глубоких дефектов роговицы / Ченцова Е.В., Боровкова Н.В., Макаров М.С., Егорова Н.С., Конюшко О.И., опубликовано 31.01.2017, Бюл. № 4.

Список сокращений

    СК – стволовые клетки

    БЭ – буккальный эпителий

    ММСК – мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

    TGF – Трансформирующих фактор роста

    IL-1 – интерлейкин 1

    IGF – инсулиноподобных фактор роста

    FGF – фактор роста фибробластов

    KGF – фактор роста кератиноцитов

    HGF – фактор роста гепатоцитов

    TNF – фактор некроза опухолей

    EGF – фактор роста эпителия

    CSF – колониестимулирующий фактор роста

    ЛКН – лимбально-клеточная недостаточность

    ВКМ – внеклеточный матрикс


Город: Москва – 2018
Темы: 14.01.07 – глазные болезни
Дата добавления: 01.12.2018 12:31:37, Дата изменения: 15.01.2019 10:34:29

Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии - 2019Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракци...

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XII Российского общенационал...

Федоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2019 XVI Всероссийская научно-практичес...

Актуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIV Всероссийская научная ...

Современные тенденции развития офтальмологии - фундаментально-прикладные аспекты Всероссийская научно-практическая конференцияСовременные тенденции развития офтальмологии - фундаментальн...

Восток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2019 Международная конференция по офтальмологии

Академия ZiemerАкадемия Ziemer

Белые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Международного офтальмологического конгрессаБелые ночи - 2019 Сателлитные симпозиумы в рамках XXV Междун...

Новые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно-практическая конференцияНовые технологии в офтальмологии - 2019 Всероссийская научно...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии – 2019 ХVII Всероссийская научно-практическаяконференция с международным участиемСовременные технологии лечения витреоретинальной патологии –...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2019»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

Роговица III. Инновации  лазерной коррекции зрения и кератопластикиРоговица III. Инновации лазерной коррекции зрения и кератоп...

ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вместе против слепоты»ХVI Ежегодный конгресс Российского глаукомного общества «Вме...

Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и иммунодефицитные заболевания»Сессии в рамках III Всероссийского конгресса «Аутоимунные и ...

Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018Современные технологии катарактальной и рефракционной хирург...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Современные тех...

«Живая» хирургия в рамках конференции  «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии - 2018»«Живая» хирургия в рамках конференции «Современные технолог...

Сателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенационального офтальмологического форумаСателлитные симпозиумы в рамках XI Российского общенациональ...

Федоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участиемФедоровские чтения - 2018 XV Всероссийская научно-практическ...

Актуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная конференция молодых ученыхАктуальные проблемы офтальмологии XIII Всероссийская научная...

Восток – Запад 2018  Международная конференция по офтальмологииВосток – Запад 2018 Международная конференция по офтальмологии

«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»«Живая хирургия» в рамках конференции «Белые ночи - 2018»

Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Международного офтальмологического конгресса Белые ночи - 2018 Сателлитные симпозиумы в рамках XXIV Между...

Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизонты -  2018»Сателлитные симпозиумы в рамках конференции «Невские горизон...

Сателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКОСателлитные симпозиумы в рамках VIII ЕАКО

Top.Mail.Ru


Open Archives