Онлайн доклады

Онлайн доклады

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Пироговская офтальмологическая академия

Пироговская офтальмологическая академия

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Роговица V Новые достижения и перспективы

Конференция

Роговица V Новые достижения и перспективы

Научно-образовательные вебинары

Научно-образовательные вебинары

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Конгресс

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Конференция

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Конференция

Пироговский офтальмологический форум

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Пироговская офтальмологическая академия

Пироговская офтальмологическая академия

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Роговица V Новые достижения и перспективы

Конференция

Роговица V Новые достижения и перспективы

Научно-образовательные вебинары

Научно-образовательные вебинары

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Конгресс

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Конференция

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Конференция

Пироговский офтальмологический форум

Все видео...
Год
2019

Первичная открытоугольная глаукома: диагностическое значение протеомного анализа слезы и жидкости передней камеры глаза


Органзации: В оригинале: ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России
    Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

    

Общая характеристика работы



    Актуальность темы исследования

    Глаукома является социально значимой болезнью вследствие того, что охватывает большие группы населения и может приводить к слепоте.

    Потеря зрения у людей всех возрастов является проблемой современной офтальмологии [Нестеров А.П., 2001]. Как правило, при обследовании у одного из трех пациентов старше 65 лет выявляется снижение остроты зрения, и одной из причин может быть глаукома [Quillen D.A., 1999]. Поэтому данное заболевание имеет большое медико-социальное значение и является одним из приоритетных направлений современной офтальмологии.

    Проблема ранней диагностики глаукомы еще далека от своего решения. И, несмотря на значительные успехи в разработке современных патогенетически обоснованных медикаментозных и хирургических методов лечения глаукомы, не всегда удается добиться стабилизации зрительных функций и предотвратить инвалидизацию пациентов.

    Течение глаукомы, как правило, бессимптомное с прогрессирующим снижением зрительных функций [Егоров Е.А., 2007]. Традиционные методы диагностики основаны на выявлении уже имеющейся клинически значимой симптоматики – дефекты полей зрения, изменение диска зрительного нерва (ДЗН) [Кански Д.Д., 2009]. Установлено, что клинически определяемые изменения поля зрения у больных глаукомой наблюдаются при потере около 40% зрительных волокон [Егоров Е.А., Ставицкая Т.В., Налобнова Ю.В., 2003]. Таким образом, данную диагностику заболевания в начальной стадии трудно назвать ранней. Динамика заболевания, согласно принятой классификации, также оценивается в основном по наличию или отсутствию прогрессирования изменений ДЗН и поля зрения.

    В связи с этим, продолжается поиск новых методов, позволяющих обнаружить самые ранние доклинические нарушения у больных глаукомой, так как успех медикаментозного и хирургического лечения больных глаукомой во многом зависит от своевременной постановки диагноза.

    В последние десятилетия увеличивается число 40-60-летних пациентов трудоспособного возраста с диагнозом «катаракта», что требует проведения оперативного лечения. По статистике, диагноз «первичная открытоугольная глаукома» (ПОУГ) впервые устанавливается как раз в этом возрасте или несколько позже.

    Что касается исследований, направленных на поиск методов ранней диагностики глаукомы, есть уникальная возможность взять во время операции факоэмульсификации катаракты на исследование жидкость передней камеры глаза для проведения тонкого биохимического анализа. По сравнению со слезой, жидкость передней камеры содержит меньше контаминантов.

    Одним из новых перспективных направлений биомедицинских исследований является протеомный анализ глазных жидкостей и тканей. Главной целью клинической протеомики является обнаружение нового белкового или пептидного биомаркера, который связан с определенным заболеванием. Сравнение протеомов здорового человека и больного позволяет выявить конкретные белки, потенциально вовлеченные в развитие болезни, которые в дальнейшем могут стать мишенями для новых лекарственных препаратов. Кроме того, если такие белки уже известны, анализ протеома может использоваться как метод ранней диагностики.

    Одним из основных методов протеомики является масс-спектрометрия белков, которая позволяет установить количественный и качественный состав в исследуемом образце. В настоящее время в медицине применение методов протеомного анализа позволяет выявить маркеры некоторых заболеваний на ранней стадии болезни. Степень разработанности проблемы

    Анализ работ, посвященных поиску возможных биомаркеров первичной открытоугольной глаукомы, выявил недостаточную степень разработанности данной проблемы. В России не проводились исследования жидкости передней камеры глаза и слезы пациентов с катарактой, глаукомой и псевдоэксфолиативным синдромом методами протеомного анализа. В зарубежной литературе есть работы, посвященные поиску биомаркеров глаукомы, однако не было выявлено одного достоверно доказанного маркера.

    Протеомный анализ жидкости передней камеры глаза и слезы позволяет не только определить состав белков исследуемой биологической жидкости, но и выявить изменения состава при развитии заболевания. Проблема поиска биомаркера при первичной открытоугольной глаукоме чрезвычайно актуальна в связи с трудностью диагностики заболевания на ранней стадии. Причины возникновения псевдоэксфолиативнго синдрома (ПЭС) также не до конца ясны. При этом данный синдром может встречаться как при первичной открытоугольной глаукоме, так и изолированно. Таким образом, протеомные исследования слезы и жидкости передней камеры при глаукоме и псевдоэксфолиативном синдроме очень важны для развития представлений о патогенезе данных заболеваний.

    Цель работы - усовершенствовать диагностику первичной открытоугольной глаукомы путем использования протеомного анализа жидкости передней камеры глаза и слезы.

    Задачи исследования

     1. Идентифицировать белковый состав жидкости передней камеры глаза методом протеомного анализа.

    2. Оценить протеомный профиль жидкости передней камеры глаза и установить возможные биомаркеры первичной открытоугольной глаукомы.

    3. Определить наличие выявленных в жидкости передней камеры глаза биомаркеров в слезе.

    4. Оценить диагностическую значимость выявленных биомаркеров в установке диагноза первичной открытоугольной глаукомы.

    5. Сопоставить протеомный профиль слезы и жидкости передней камеры глаза пациентов с первичной открытоугольной глаукомой и пациентов без подтвержденного диагноза глаукома.

    Положения диссертации, выносимые на защиту:

    1. При исследовании жидкости передней камеры глаза пациентов с первичной открытоугольной глаукомой было идентифицировано 12 белковых групп, не выявленных в других клинических группах.

    Полученные данные позволяют проводить дальнейшие исследования по определению данных белков в жидкости передней камеры глаза и установлению возможного биомаркера ПОУГ.

    2. Объединение в одну группу белков жидкости передней камеры пациентов с катарактой в сочетании с ПЭС и без него, показывает наибольшее количество специфических белков (45 белковых групп).

    В данной объединенной группе представлены структурные компоненты вещества хрусталика, а наиболее обогащенный биологический процесс – дифференцировка кератиноцитов (p-value = 2,57 × 10 -4 ). Предположительно, развитие катаракты сопровождается повреждением вещества хрусталика, что приводит к выделению в жидкость передней камеры его компонентов.

    3. Исследование объединенного протеома жидкости передней камеры глаза для выявления определенных структурно-функциональных групп белков с использованием категорий Gene Ontology установило, что основной функцией протеома жидкости передней камеры является активность по ингибированию эндопептидаз, что является важным для предотвращения расщепления белков и нарушения прозрачности внутриглазных сред.

    4. Выявленный при протеомном исследовании жидкости передней камеры белок аполипопротеин D является потенциальным биомаркером псевдоэксфолиативного синдрома, что позволяет проводить раннюю диагностику данного синдрома.

    Научная новизна работы:

    1. В данном научном исследовании в жидкости передней камеры впервые идентифицированы 12 белковых групп, характерных для первичной открытоугольной глаукомы. Выявленные белки являются потенциальными биомаркерами данного заболевания. Это открывает перспективу для дальнейших исследований для поиска маркеров первичной открытоугольной глаукомы, прогнозирования течения данного заболевания и оценки эффективности проводимой терапии.

    2. В ходе протеомного исследования жидкости передней камеры глаза впервые были идентифицированы группы белков, ранее не описанные в составе жидкости передней камеры и выявлены группы белков, характерные для катаракты, псевдоэксфолиативного синдрома и глаукомы.

    3. На основании проведенного исследования определено, что основная функция белков жидкости передней камеры глаза - ингибирование эндопептидаз.

    4. Установлено, что белок аполипопротеин D является потенциальным биомаркером псевдоэксфолиативного синдрома.

    5. Объединение в одну группу белков жидкости передней камеры пациентов с катарактой в сочетании с псевдоэксфолиативным синдромом и без него, показало наибольшее количество специфических белков.

    Теоретическая и практическая значимость

    1. При проведении исследования жидкости передней камеры глаза необходимо обращать внимание на 12 белковых групп, выявленных при первичной открытоугольной глаукоме, так как данные белки являются потенциальными биомаркерами первичной открытоугольной глаукомы.

    2. Анализ жидкости передней камеры глаза методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с высокоточной тандемной масс-спектрометрией является высокоточным и позволяет проводить дифференциальную диагностику таких заболеваний, как первичная открытоугольная глаукома и псевдоэксфолиативный синдром.

    Степень достоверности и апробация результатов

     Степень достоверности полученных результатов исследования определяется достаточным и репрезентативным объемом выборки исследования и обследованных пациентов (60 пациентов), точностью и большим количеством повторов проведенных протеомных исследований. Протеомный анализ каждого образца проводился как минимум в 3-х технических повторах. 100 Гб спектров формата «.raw» в трех технических повторах обработаны с использованием программы MaxQuant версии 1.5.2.8, использующей в качестве поискового инструмента программу Andromeda. Для биоинфор-мационного анализа данных, полученных с помощью программы MaxQuant, использовали программу Perseus, версия 1.5.1.6.

    Проведение диссертационного исследования одобрено комитетом по этике научных исследований РМАНПО (решение от 13.05.2014 г.). Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VI конференции молодых ученых РМАПО с международным участием (Москва, 2015 г.), XVII Всероссийской школе офтальмолога (ВШО - 2018) (Москва, 2018 г.), XVI международном конгрессе «Глаукома: теории, тенденции, технологии» (Москва, 2018 г.). Апробация диссертации состоялась 02.08.2019 г. на расши-ренном заседании кафедры офтальмологии ФГБОУ ДПО РМАНПО с привлечением Филиала №1 ГКБ им. С.П. Боткина «Офтальмологическая клиника».

    Публикации

    По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 - в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, 1 – в журнале “Proteomics”.

    Внедрение результатов исследования

    Результаты исследования внедрены в практику работы офтальмологических отделений Филиала №1 ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина ДЗМ, 60-го офтальмологического отделения ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина ДЗМ и офтальмологического отделения АО «Европейский Медицинский Центр».

    Структура и объем диссертации

    Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики больных и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 5 рисунков и 20 таблиц. Список литературы содержит 177 источников, в том числе 31 отечественный и 146 зарубежных.

    Работа, представляющая собой комплексное клинико-лабораторное исследование, выполнялась на кафедре офтальмологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования министерства здравоохранения Российской Федерации, которая расположена на базе городской клинической больницы имени С.П. Боткина Филиал №1 «Офтальмологический стационар». В соответствии с решавшимися задачами значительную часть работы составили биохимические (в основном протеомные) исследования.

    Эти исследования проводились на базе Федерального государственного бюджетного научного учреждения Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича.

    Соответствие диссертации паспорту научной специальности

    Отраженные в диссертации научные положения соответствуют п. 1 «Разработка новых и усовершенствование известных методов обследования органа зрения и его придатков, методов диагностики различных заболеваний» и п. 7 «Изучение и совершенствование методов диспансеризации пациентов с глаукомой и другими видами прогрессирующей патологии глаза» паспорта специальности 14.01.07 – Глазные болезни. В диссертационном исследовании набраны 4 группы пациентов с катарактой, первичной открытоугольной глаукомой и псевдоэксфолиативным синдромом. Все больные были клинически обследованы с использованием основных и дополнительных офтальмологических методов исследования, которые включали: визометрию, тонометрию, гониоскопию, биомикроскопию, прямую и непрямую офтальмоскопию, периметрию, определение критической частоты слияния мельканий.

    Также научные положения, отраженные в диссертации, соответствуют п. 3 «Установление химического состава живых организмов, выявление закономерностей строения, содержания и преобразования в процессе жизнедеятельности организмов химических соединений, общих для живой материи в целом. Сопоставление состава и путей видоизменения веществ у организмов различных систематических групп, проблемы сравнительной и эволюционной биохимии, космобиохимии» паспорта специальности 03.01.04 - Биохимия. Медицинские науки. В диссертационном исследовании проведена идентификация протеомного профиля жидкости передней камеры глаза пациентов с катарактой, первичной открытоугольной глаукомой и псевдоэксофлиативным синдромом и выявлены белки, характерные для каждой группы пациентов.

    

Содержание работы



    Материал и методы исследования

    В целом, при выполнении исследования под наблюдением находились 60 пациентов, из них 24 мужчин (24 глаза), 36 женщин (36 глаз). Возраст пациентов составлял от 45 до 87 лет. В исследование включались пациенты, не имеющие тяжелых соматических заболеваний, хронических системных заболеваний, не переносившие за последний год лазерные операции на исследуемом глазу и не имеющие в анамнезе хирургических вмешательств на глазном яблоке.

    Все больные были клинически обследованы с использованием основных и ряда дополнительных офтальмологических методов исследования, которые включали: визометрию, тонометрию, гонио-скопию, биомикроскопию, прямую и непрямую офтальмоскопию, периметрию, определение критической частоты слияния мельканий, оптическую когерентную томографию. С учетом этого среди наблюдавшихся пациентов были выделены четыре основные исследовательские группы:

    1-ю группу (контрольную) составили пациенты с катарактой (24 человека), не имеющие другой офтальмопатологии;

    во 2-ю группу вошли пациенты с катарактой и псевдоэксфолиативным синдромом без подтвержденного диагноза глаукома (7 человек);

    3-ю группу составили пациенты с катарактой и первичной открытоугольной глаукомой (11 человек);

    в 4-ю группу вошли пациенты с катарактой, первичной открытоугольной глаукомой и псевдоэксфолиативным синдромом (18 человек).

    Забор слезной жидкости осуществлялся с помощью инсулинового шприца с одноразовой канюлей из нижнего конъюнктивального свода обследуемых накануне операции факоэмульсификации катаракты. Далее анализируемую жидкость помещали в микропробирку типа Эппендорф объемом 1,5 мл и замораживали до -75 о С до проведения лабораторных исследований.

    Забор жидкости передней камеры глаза проводился во время операции факоэмульсификации катаракты после 1-го парацентеза. Операция проводилась при помощи факоэмульсификатора Laureate (Alcon, США).

    Для протеомного изучения жидкости передней камеры глаза использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с высокоточной тандемной масс-спектрометрией, а также другие вспомогательные биохимические методы. Высокоэффектив-ную жидкостную хроматографию проводили на приборе Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, США). Тандемный масс-спектрометрический анализ проводили на приборе Orbitrap Q Exactive (Thermo Scientific, США). Протеомный анализ с использованием масс-спектрометров высокого разрешения является трудоемким и дорогостоящим тестом. Анализ каждого образца требует как минимум 3 технических повторов. В связи с этим в биохимическую часть исследования были включены 29 пациентов, из них 12 мужчин, 17 женщин. Возраст этих пациентов составлял от 45 до 82 лет и из них также были составлены четыре исследовательские подгруппы:

    в 1-ой подгруппе (контрольной) находились пациенты с катарактой (11 человек), не имеющие другой офтальмопатологии;

    во 2-ю подгруппу вошли пациенты с катарактой и псевдоэксфолиативным синдромом без подтвержденного диагноза глаукома (5 человек);

    3-ю подгруппу образовали пациенты с катарактой и открытоугольной глаукомой (7 человек, из них 2 пациента с начальной стадией глаукомы, 3 – с развитой, 2- с далекозашедшей стадией);

    в 4-ю подгруппу включили пациентов с катарактой, ПОУГ и ПЭС (6 человек, из них 2 пациента с начальной стадией глаукомы, 2 – с развитой, 2- с далекозашедшей стадией).

    Для исследования белков слезной жидкости использовали две модификации иммуноблоттинга: иммуноблоттинг на сухой мембране и «классический» Вестерн-блоттинг.

    

Результаты исследований и их обсуждение



    Все больные были клинически обследованы с использованием основных и ряда дополнительных офтальмологических методов исследования до операции факоэмульсификации катаракты и после операции (таблица 1, таблица 2).

    У всех пациентов операция и послеоперационный период протекали без осложнений. Больные были выписаны из стационара на следующий день после операции. Острота зрения в первые сутки составляла от 0,3 до 1,0 с коррекцией, давление по пневмотонометрии у всех пациентов было в пределах нормы.

    В первые сутки после операции передний отрезок глазного яблока всех обследованных был практически спокоен, роговица прозрачная, передняя камера средней глубины, жидкость передней камеры прозрачная, зрачок в медикаментозном мидриазе, искусственная оптическая линза в задней камере, центрирована, рефлекс с глазного дна розовый. Таким образом, взятие на исследование слезы и жидкости передней камеры глаза не оказало влияния на ход операции и течение послеоперацинного периода.

    В работе с помощью хромато-масс-спектрометрических методов высокого разрешения исследован протеом жидкости передней камеры глаза у пациентов с такими глазными заболеваниями, как катаракта, глаукома, а также псевдоэксфолиативный синдром.

    Протеомный анализ с использованием масс-спектрометров высокого разрешения является трудоемким и дорогостоящим тестом. В данной работе анализ протеома жидкости передней камеры глаза осуществлялся на новейшем масс-спектрометре высокого разрешения (Thermo Q Exactive, США). Такое исследование проводилось впервые в России. Анализ каждого образца требовал как минимум 3 технических повторов. В связи с этим в лабораторную часть исследования были включены 29 пациентов. Трудоемкость проведенных анализов обуславливает заданный объем выборки пациентов.

    Белки жидкости передней камеры глаза, полученные в результате протеомного анализа, и их функции.

    В работе найдено 269 белковых групп, характеризующих протеом жидкости передней камеры глаза. Большая часть белков (154 из 269) была обнаружена во всех подгруппах.

    В соответствии с классификацией Gene Ontology, большинство выделенных белковых групп участвуют в регуляции протеолиза. Точнее, активности по ингибированию эндопептидаз и пепидаз-регулирующая активность были обогащены в протеоме жидкости передней камеры глаза при сравнении со всеми белок-кодирующими генами человека. Это означает, что протеолиз в жидкости передней камеры глаза строго контролируется для предотвращения расщепления белков и нарушения прозрачности внутриглазных сред. Так, например, протеолиз и фрагментация кристаллинов в веществе хрусталика значительно возрастают при развитии возрастной катаракты [Sharma K.K. et al., 2009]. Более того, некоторые белки, являющиеся продуктами протеолиза могут выступать в качестве анти-шаперонов и вызывать дальнейшую агрегацию белков [Rao G. et al., 2008].

    Состав протеома жидкости передней камеры глаза.

     Для того чтобы определить основу протеома жидкости передней камеры глаза, были выделены белки, обнаруженные в большинстве образцов. Очевидно, что такой «конститутивный» протеом состоит из наиболее распространенных белков, секретируемых в жидкости передней камеры глаза. Результирующий список содержит 36 белковых групп.

    По крайней мере, 10 ингибиторов протеаз были включены в список в соответствии с указанным выше обогащением жидкости передней камеры глаза. Данные белки выделены во многих биологических жидкостях, в частности, в плазме крови и цереброспинальной жидкости. Один из них - белок пигментного эпителия сетчатки (gene name SERPINF1), относящийся к семейству ингибиторов сериновых протеаз. Не имеющий активности по ингибированию протеаз, он, тем не менее, является потенциальным ингибитором ангиогенеза, взаимодействующим с нервной тканью и сетчаткой [Bouck N., 2002]. Точно так же, как и плазма крови, конститутивный протеом жидкости передней камеры содержит липопротеины, иммуноглобулины и белковые переносчики различных гормонов и метаболитов.

    Особый интерес представляют белки, не являющиеся типичными для плазмы крови. К примеру, дермоцидин, пептид, секретируемый потовыми железами и обладающий антибактериальными свойствами [Schittek B. et al., 2001], может выполнять такую же функцию и в жидкости передней камеры глаза. Также в состав конститутивного протеома входят белки, связанные с формированием глазного яблока из нервной ткани. В дополнение к серпину F1, описанному выше, простагландин D2 синтаза 21 кДа (PTGDS) обладает способностью к регуляции нейротрофической и барьерной функций [Urade Y. et al., 2000]. Dickkopf-связывающий белок-3 (DKK3) регулирует развитие нервной системы и глазного яблока, но функция этого белка в жидкости передней камеры взрослых остается неизвестной.

    Характеристика белков жидкости передней камеры глаза, выделенных только в подгруппе «катаракта + первичная открытоугольная глаукома».

    Особый интерес представляют 12 белковых групп, являющихся уникальными для подгруппы «катаракта + первичная открытоугольная глаукома»:

    1. Apolipoprotein C-III – аполипопротеин C-III – APOC3 (ген) Аполипопротеин С-III – аполипопротеин плазмы крови, который входит в состав липопротеинов очень низкой плотности и липопротеинов высокой плотности, содержит 79 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 8764 кДа, экспрессируется главным образом в клетках печени Talmud P.J. et al., 1997]. Предполо-жительно, аполипопротеин С-III ингибирует липопротеинлипазу и, таким образом, участвует в метаболизме триглицеридов.

    2. Carboxypeptidase B2 – карбоксипептидаза В2 – CPB2 (ген) Семейство карбоксипептидаз включает в себя металло-, сериновые и цистеиновые карбоксипептидазы. В зависимости от строения их разделяют на карбоксипептидазу А и карбоксипептидазу В. Карбокиспепдидаза В2 – фермент, синтезирующийся в печени. В плазме крови циркулирует в виде предшественника плазминогена – зимогена [Kaushansky K. et al., 2010], активируется тромбином. После активации Карбоксипептидаза В2 участвует в регуляции фибринолиза (подавляет фибринолиз) [Boffa M.B. et al., 1999].

    3. Collagen alpha-2(I) chain – коллаген альфа-2(I) цепь – COL1A2 (ген) Коллаген I типа – фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани организма (сухожилие, органическая часть кости, хрящ, дерма, дентин, капсулы внутренних органов) и обеспечивающий её прочность и эластичность. Коллаген альфа-2(I) цепь кодируется геном COL1A2 [Retief E. et al., 1985]. Мутации в гене COL1A2 ассоциированы с нарушениями остеогенеза, синдромом Элераса-Данлоса, идиопатическим остеопорозом и синдромом Марфана [Hata R. et al., 1988].

    4. Collagen alpha-3(IX) chain – коллаген альфа-3(IХ) цепь – COL9A3 (ген)

    Коллаген цепь альфа-3(IХ) кодируется геном COL9A3. Этот ген кодирует 3 альфа цепи коллагена IX типа, который является основным компонентом гиалинового хряща. Мутации в гене COL9A3 ассоциированы с болезнью Фейрбанка, или множественной эпифизарной дисплазией [Brewton R.G. et al., 1996].

    5. Complement component C6 – компонент комплемента С6 – C6 (ген)

    6. Complement component C8 beta chain – компонент комплемента С8 бета цепь – C8B (ген)

    Система комплемента – комплекс сложных белков, постоянно присутствующих в крови, каскадная система протеолитических ферментов, предназначенная для гуморальной защиты организма от действия чужеродных агентов, участвует в реализации иммунного ответа организма и является важным компонентом как врождённого, так и для приобретённого иммунитета. Комплемент – система белков, включающая около 20 взаимодействующих компонентов: С1 (комплекс из трех белков), С2, СЗ, С4, С5, С6, С7, С8, С9, фактор В, фактор D и ряд регуляторных белков. Все эти компоненты – белки, циркулирующие в крови и тканевой жидкости. Белки комплемента синтезируются в основном в печени и составляют приблизительно 5% от всей глобулиновой фракции плазмы крови [Sorman A. Et al., 2014].

    7. Fibronectin – фибронектин – FN1 (ген) Фибронектин – гликопротеид (молекулярная масса субъединиц 250 кДа), существующий в двух формах: тканевой и плазменной.

    Полипептидная цепь содержит несколько доменов, способных связывать разные белки (интегрины, коллаген, актин, некоторые мембранные рецепторы). Полипептидная цепь фибронектина содержит 7-8 доменов, на каждом из которых расположены специфические центры для связывания разных веществ. Фибронектин может связывать коллаген, протеогликаны, гиалуроновую кислоту, углеводы плазматических мембран, гепарин, фермент трансглутаминазу. Благодаря своей структуре фибронектин может выполнять интегрирующую роль в организации межклеточного вещества, а также способствовать адгезии клеток [Северин Е.С., 2003].

    8. Insulin-like growth factor-binding protein 5 – белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 5 – IGFBP5 (ген) Инсулиноподобный фактор роста – это комплекс белков, ответственных за нормальный рост и развитие человека. Активность инсулиноподобного фактора роста регулируется семейством белков, связывающих инсулиноподобный фактор роста (6 типов) [Bach L.A., 2015]. В нескольких исследованиях описана связь IGFBP5 с канцерогенезом через регуляцию роста опухолевых клеток, их миграцию и инвазию. При этом IGFBP5 может, как подавлять рост опухолевых клеток и метастазов, так и выступать онкогеном, поддерживая метастазирование [Gullu G. et al., 2012].

    9. Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit – белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста комплекс кислых лабильных субъединиц – IGFALS (ген) По литературным данным, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста комплекс кислых лабильных субъединиц, регулирует уровень инсулиноподобного фактора роста в сыворотке крови [Janosi J.B. et al., 1999].

    10. Neurosecretory protein VGF, Neuroendocrine regulatory peptide-1; Neuroendocrine regulatory peptide-2; Antimicrobial peptide VGF – нейросекреторные белки – VGF (ген)

    VGF это нейрональный полипептид, обнаруженный в нейронах головного мозга и гиппокампе. VGF впоследствии превращается в более 10 различных пептидов, которые регулируют пластичность, нейрогенез, энергетический гомеостаз, восприятие боли и сексуальное поведение. Некоторые VGF пептиды также участвуют в регуляции пищевого поведения и энергетического баланса организма [Busse S. et al., 2014].

    11. Proline-rich protein 4 – Белок, богатый пролином 4 – PRR4 (ген) PRR4 – белок, синтезируемый ацинарными клетками слезных и слюнных желез человека. Данный белок выполняет антимикробную и защитную функции (защита поверхности глазного яблока и ротовой полости). По данным исследования Aluru S.V. et al., 2012, пролин -богатый белок 4 является потенциальным биомаркером синдрома сухого глаза.

    12. Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine – кислый кальций-связывающий богатый цистеином белок – SPARC (ген)

    SPARC – это гликопротеин внеклеточного матрикса массой 35 кДа, состоящий из 303 аминокислот, так же известный как остеонектин. SPARC регулирует активность тромбоцитарного фактора роста PDGF, фактора роста фибробластов, фактора роста эндотелия сосудов VEGF [Kupprion C. et al., 1998]. Белок способствует изменениям морфологии клеток и их дифференциации, останавливает клеточный цикл в G1 фазе, регулирует выработку внеклеточных металлопротеаз.

    Выявленные белки являются потенциальными биомаркерами ПОУГ. Но для того, чтобы исключить возможность «случайного» обнаружения данных белковых групп в жидкости передней камеры глаза, необходимы дальнейшие исследования.

    Характеристика белков жидкости передней камеры глаза, выделенных в подгруппах «катаракта» и «катаракта + псевдоэксфолиативный синдром».

    Объединение в одну группу белков жидкости передней камеры пациентов с катарактой в сочетании с псевдоэксфолиативным синдромом и без него, показывает наибольшее количество специфических белков (45 белковых групп). Все 45 потенциальных маркеров катаракты были проверены на обогащение по классификации Gene Ontology. Это показало статистически значимый результат. В качестве контроля использовался объединенный протеом жидкости передней камеры глаза, полученный в данном исследовании в сочетании с результатами исследований Chowdhury et al., 2010, Bennett et al., 2011, Murthy et al., 2015, Ji et al., 2015 (всего 883 белков).

    Дифференцировка кератиноцитов оказалась наиболее обогащенным биологическим процессом (GO: 0030216, p-value = 2,57 × 10 -4 ). Также в данной объединенной группе представлены структурные компоненты вещества хрусталика. Предположительно, развитие катаракты сопровождается повреждением вещества хрусталика, что приводит к выделению в жидкость передней камеры его компонентов, таких как альфа-кристаллин A, бета-кристаллины A3 и A4, ламин-A/C, плакофиллин-1 и тубулин альфа. Связь между найденными белками, особенно кристаллинами, и катарактогенезом описывалась ранее. Мутации в генах альфа-кристаллин А (CRYAA), бета-кристаллин А3 (CRYBA1) и бета-кристаллин А4 (CRYBA4) приводят к развитию катаракты [Yi J. et al., 2011].

    Аполипопротеин D – потенциальный биомаркер псевдо-эксфолиативного синдрома.

    При использовании статистического метода анализа, построения дерева решений, был получен многообещающий результат по классификации образцов жидкости передней камеры пациентов с псевдоэксфолиативным синдромом и без него. Выявлено диагнос-тическое правило, которое корректно классифицирует 26 из 29 образцов по наличию или отсутствию ПЭС путем сравнения средней интенсивности сигнала (LFQint) каждого образца (Рисунок 2).

    LFQint. – intensity-based label-free quantification, интенсивность сигнала при количественном анализе без использования изотопной метки – метод количественного анализа в масс-спектрометрии, который позволяет определить относительное количество белков при сравнении двух или более образцов. Метод основывается на измерении и сравнении интенсивностей пиков прекурсорных ионов. Его уникальность заключается в количественном анализе белков без использования стабильных изотопов в качестве меток

    Дерево решений было построено по нормированной интенсивности сигнала Аполипопротеина D.

    Наличие ПЭС связано с более низким уровнем этого белка. Аполипопротеин D представляет собой секретируемый гликопротеин. Одна из его функций - предотвращение перекисного окисления липидов [Bhatia S. et al., 2012]. Данный белок фигурирует в ряде исследований, изучающих молекулярные основы старения и развитие возрастных заболеваний [De Magalhaes J.P. et al., 2009]. В любом случае, на основе имеющихся данных, этот белок предположительно участвует в прогрессировании ПЭС. Целенаправленные исследования его уровня и изоформ в структурах глаза необходимы для определения точной роли аполипопротеина D в развитии ПЭС.

    Результаты анализа слезной жидкости.

    Определение общего белка в слезной жидкости дало существенные индивидуальные колебания, поэтому протеомный анализ путем масс-спектрометрии, которым мы располагали, можно признать неэффективным инструментом в случае слезы.

    Предварительный анализ также выявил в этой жидкости большое количество контаминантных белков, например, кератинов кожи.

    

Заключение



    Работа представляет собой комплексное клинико-лабораторное исследование. В соответствии с решавшимися задачами значительную часть работы составили биохимические (в основном протеомные) исследования.

    В работе доказано, что взятие на анализ жидкости передней камеры глаза во время операции факоэмульсификации катаракты не влияет на результат операции и не увеличивает сроки послеоперационного восстановления. В исследовании с помощью хромато-масс-спектрометрических методов высокого разрешения исследован протеом жидкости передней камеры глаза у пациентов с такими глазными заболеваниями, как катаракта, глаукома, а также псевдоэксфолиативный синдром. Доказана высокая информативность проведения данного анализа для поиска биомаркеров первичной открытоугольной глаукомы.

    

Выводы



    1. Протеомные исследования жидкости передней камеры глаза больных с катарактой, первичной открытоугольной глаукомой и псевдоэксфолиативным синдромом показали, что основной функцией белков жидкости передней камеры глаза является активность по ингибированию эндопептидаз, что является важным для предотвращения расщепления белков и нарушения прозрачности внутриглазных сред.

    2. При анализе данных интенсивности сигнала LFQ протеома жидкости передней камеры глаза пациентов с ПОУГ и без подтвержденного диагноза глаукомы с использованием многомерной статистики, не было найдено одиночного биомаркера или комбинации белков, которые можно рассматривать в качестве биомаркера. Это подтверждает необходимость проведения дальнейших протеомных исследований по поиску биомаркеров ПОУГ.

    3. В ходе исследования жидкости передней камеры методом масс-спектрометрии выявлено 12 уникальных белковых групп, характерных только для первичной открытоугольной глаукомы. Это является важным для проведения дальнейших исследований и для выявления возможных биомаркеров ПОУГ в жидкости передней камеры глаза.

    4. При использовании статистического метода анализа - построения дерева решений - было выявлено, что обнаруженный в жидкости передней камеры белок аполипопротеин D является потенциальным биомаркером псевдоэксфолиативного синдрома. Средняя интенсивность сигнала (LFQ int) аполипопротеина D менее 4,8 х 10 7 с чувствительностью 72,7% и специфичностью 100% прогнозирует псевдоэксфолиативный синдром.

    5. Исследование слезной жидкости в плане поиска биомаркеров ПОУГ является менее информативным, чем исследование жидкости передней камеры глаза из-за присутствия в слезной жидкости контаминантов, в частности, кератинов кожи, а также из-за высокой индивидуальной вариабельности содержания общего белка в этой жидкости.

    

Практические рекомендации



    1. Для ранней диагностики ПОУГ у пациентов с катарактой и подозрением на глаукому может быть применен метод протеомного анализа жидкости передней камеры глаза.

    2. Взятие на анализ жидкости передней камеры глаза во время операции ФЭК не ухудшает результатов операции и не увеличивает сроки послеоперационного восстановления.

    3. При исследовании жидкости передней камеры глаза пациентов с катарактой, ПОУГ и ПЭС необходимо обращать внимание на белковые группы, выявленные только при глаукоме.

    4. Взятие на анализ жидкости передней камеры при факоэмульсификации катаракты дает возможность проведения тонкого биохимического исследования для выявления возможных биомаркеров ПОУГ.

    

Список работ, опубликованных по теме диссертации



    1. Самохина Н.И. Возможности использования протеомного анализа в диагностике офтальмопатологии (обзор литературы) // Точка зрения. Восток – Запад – 2015 - № 1. С.260 -264.

    2. Полякова А.А., Самохина Н.И., Ильина И.Ю., Карпов Д.С., Пятницкий М.А., Згода В.Г., Мошковский С.А. Сравнительная протеомика жидкости передней камеры глаза при катаракте и глаукоме // Конференция молодых ученых Института биомедицинской химии: Сб. науч. тр. – Москва, 2015. - С.14.

    3. Самохина Н.И. Возможности использования протеомного анализа в диагностике заболеваний глазного яблока (тезисы) // VI конференции молодых ученых РМАПО с междунароным участием «Современная медицина: традиции и инновации»: Сб. науч. тр. - Москва, 2015. -С.124-127.

    4. Хацукова Б.Н., Сошина М.М., Самохина Н.И. Опыт применения фиксированной комбинации биматопроста и тимолола для профилактики офтальмогипертензии после ультразвуковой факоэмульсификации неосложненной катаракты // Конференция молодых ученых «Шаг в завтра»: Сб. науч. тр. - Москва, 2016 г. С.113-117.

    5. Самохина Н.И., Алексеев И.Б., Хацукова Б.Н., Сошина М.М., Нам Ю.А., Аливердиева М.А. Применение фиксированной комбинации биматопроста с тимололом для профилактики офтальмогипертензии после ультразвуковой факоэмульси-фикации неосложнённой катаракты // Офтальмологические ведомости. 2016. №9 (2) – с.69-73.

    6. Самохина Н.И., Кочергин С.А., Алексеев И.Б. Возможности протеомного анализа глазных жидкостей и тканей при некоторых заболеваниях органа зрения // Офтальмологические ведомости. 2016. №9 (1) – с. 29-37.

    7. Самохина Н.И., Кочергин С.А., Алексеев И.Б., Диагностическое значение протеомного анализа жидкости передней камеры глаза при катаракте, первичной открытоугольной глаукоме и псевдоэксфолиативном синдроме // Клиническая офтальмология. 2017. №1 – с. 13-17.

    8. Kliuchnikova A.A., Samokhina N.I., Ilina I.Y., Karpov D.S., Pyatnitskiy M.A., Kuznetsova K.G., Toropygin I.Y., Kochergin S.A., Alekseev I.B., Zgoda V.G., Archakov A.I., Moshkovskii S.A. Human aqueous humor proteome in cataract, glaucoma and pseudoexfoliation syndrome // Proteomics. 2016. № 16 (13) – с. 1938–1946.

    9. Кочергин С.А., Самохина Н.И. Протеомный анализ жидкости передней камеры глаза при катаракте, первичной открытоугольной глаукоме и псевдоэксфолиативном синдроме // 190 лет. Московская глазная больница. Сб. науч. тр. Под ред. А.Ф. Бровкиной. 2016 . С. 154-160.

    10. Алексеев И.Б., Хацукова Б.Н., Самохина Н.И., Сошина М.М. Результаты применения фиксированной комбинации биматопроста и тимолола для профилактики офтальмогипертензии после ультразвуковой факоэмульсификации неосложнённой катаракты // 190 лет. Московская глазная больница. Сб. науч. тр. Под ред. А.Ф. Бровкиной. 2016. С. 390-395.

    

Список сокращений



    ВГД – внутриглазное давление

    ДЗН – диск зрительного нерва

    ОЗСК – острота зрения с коррекцией

    ПОУГ – первичная открытоугольная глаукома

    ПЭС – псевдоэксфолиативный синдром

    Apo-C III (apolipoprotein C III) – аполипопротеин C III

    Apo-D (apolipoprotein D) – аполипопротеин D

    LFQ (label-free quantitation) – метод определения интенсивности сигнала

    PDGF (platelet-derived growth factor) – фактор роста тромбоцитов

    SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine) – кислый кальций-связывающий богатый цистеином белок

    VEGF (vascular endothelial growth factor) – сосудистый эндотелиальный фактор роста


Город: Москва
Дата добавления: 13.12.2019 11:54:20, Дата изменения: 16.12.2019 11:39:17