Онлайн доклады

Онлайн доклады

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Пироговская офтальмологическая академия

Пироговская офтальмологическая академия

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Роговица V Новые достижения и перспективы

Конференция

Роговица V Новые достижения и перспективы

Научно-образовательные вебинары

Научно-образовательные вебинары

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Конгресс

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Конференция

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Конференция

Пироговский офтальмологический форум

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Пироговская офтальмологическая академия

Пироговская офтальмологическая академия

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Роговица V Новые достижения и перспективы

Конференция

Роговица V Новые достижения и перспективы

Научно-образовательные вебинары

Научно-образовательные вебинары

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Конгресс

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Конференция

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Конференция

Пироговский офтальмологический форум

Все видео...
Год
2019

Клинический полиморфизм наследственных заболеваний сетчатки при мутациях в генах ABCA4, PROM1, ELOVL4 и CNGB3


Органзации: В оригинале: ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней».
    

    Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

    

Общая характеристика работы



    Актуальность темы исследования

     Наследственные заболевания сетчатки (НЗС) – это большая группа клинически и генетически гетерогенных заболеваний. Всего в мире, по данным ВОЗ, насчитывается 45 миллионов слепых и 135 миллионов человек с серьезными нарушениями зрения. Известно, что среди всех случаев развития глазной патологии, приблизительно, в половине случаев глазные заболевания обусловлены наследственными причинами [Krebs, 2010]. Одно из ведущих мест среди причин инвалидности по зрению принадлежит наследственным дегенеративным заболеваниям сетчатки. На сегодняшний день идентифицированы более 260 генов, ассоциированных с различными формами НЗС [Duncan, J. L., 2018]. Болезнь Штаргардта (БШ) является наиболее распространенным заболеванием среди наследственных дистрофий сетчатки и ассоциируется с мутациями 4 генов (ABCA4, ELOVL4, PROM1, CNGB3), которые приводят к сходным клиническим проявлениям. Вместе с тем, мутации этих 4 генов могут быть причиной и других НЗС: палочко-колбочковой дистрофии (ПКД), ахроматопсии, пигментной абиотрофии (ПА). Один конкретный фенотип заболевания может быть результатом мутаций в различных генах, в то же время мутации одного гена могут проявляться многообразными фенотипами абиотрофии.

    Кроме того, ряд авторов при динамическом наблюдении отмечают прогрессирование дистрофии сетчатки, изначально верифицированной как БШ, в более тяжелую распространенную дегенерацию, впоследствии диагностированную как ПКД [Klevering B.J., 2004]. Некоторые авторы приходят к выводу, что в момент постановки диагноза, основываясь на генотипировании невозможно предсказать тяжесть состояния и прогрессирование заболевания. Поскольку мутации ABCA4 гена широко распространены среди населения в целом, различные члены семьи могут иметь разные комбинации мутаций, в результате фенотип и прогноз в одной и той же семье может быть разным. Другие авторы высказывают мысль, что различные типы мутаций могут обеспечивать более легкое или тяжелое течение заболевания [Quansheng Xi., 2009; Maugeri A., 1999].

    Несмотря на успехи, достигнутые в клиническом и молекулярно-генетическом исследовании наследственных заболеваний сетчатки, подчас сложно прийти к выводу, чем обусловлено прогрессирование первоначально легких форм НЗС в более тяжелые. Помимо этого, важной задачей остается тщательное клиническое обследование пациентов и выявление правильного диагноза для точной оценки влияния мутаций на развитие и прогрессирование НЗС.

    Для этого необходимы новые подходы к систематизации и интерпретации морфофункциональных симптомов. В последнее десятилетие были разработаны и внедрены в офтальмологическую практику новые технологии, которые обеспечивают количественную и качественную оценку морфофункциональных особенностей нейросенсорного и нейропроводящего аппарата глаза.

    Целью настоящей работы является изучение клинико-генетических характеристик наследственных заболеваний сетчатки при мутациях генов ABCA4, PROM1, ELOVL4 и CNGB3.

    Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

    1. Провести поиск мутаций генов ABCA4, PROM1, ELOVL4 и CNGB3 в выборке больных с клиническими признаками БШ, ПКД/КД, и ахроматопсии.

    2. Проанализировать спектр выявленных мутаций генов ABCA4, PROM1, ELOVL4 и CNGB3 при различных НЗС.

    3. Провести функциональный анализ мутаций сайта сплайсинга c.4540-1G>A, c.4540-2A>G и c.4634+1del в гене АВСА4, оценить их фенотипическое влияние.

    4. Изучить особенности клинического течения и морфофункциональные характеристики наследственных заболеваний сетчатки при различных типах мутаций на основании использования современных высокотехнологичных методов диагностики.

    5. Изучить клинико-генетические корреляции повреждений генов ABCA4, PROM1, ELOVL4 и CNGB3 в зависимости от типов и топологии мутаций, и оценить роль генетических факторов в прогрессировании НЗС.

    Научная новизна

    Впервые в РФ был проведен поиск мутаций с использованием высокопроизводительного параллельного секвенирования всех кодирующих участков генов ABCA4, ELOVL4, PROM1, CNGB3 и криптических сайтов сплайсинга в некодирующих областях гена ABCA4 при ПКД/КД и ахроматопсии.

    Впервые в российской популяции пациентов с ПКД был проведен поиск глубоких интронных мутаций гена ABCA4.

    Были получены клинико-генетические корреляции при частых мутациях гена ABCA4. Были определены типы мутаций, ассоциированные с тяжелым течением и прогрессированием НЗС.

    На основании комплексного обследования с помощью современных высокотехнологичных методов диагностики выявлены клинические особенности течения БШ, ПКД, и определены фенотипические варианты НЗС при различных типах мутаций.

    Впервые с помощью функционального анализа in vitro мутаций сайта сплайсинга c.4540-1G>A, c.4540-2A>G и c.4634+1del в гене АВСА4 показано, что исследованные генетические варианты являются тяжелыми или нуль-мутациями.

    Теоретическая и практическая значимость работы

    Проведенные исследования показали высокую теоретическую и практическую информативность комплексной клинической и молекулярно-генетической диагностики НЗС. Применение диагностической панели с полным покрытием всех кодирующих областей генов ABCA4, ELOVL4, PROM1, CNGB3, а также некодирующих участков концевых экзонов и участков генов, ответственных за сплайсинг мРНК, обеспечивает высокую эффективность выявления редких экзонных и интронных мутаций, необходимого для генетической верификации НЗС.

    Описаны клинико-генетические корреляции у пациентов с различными сочетаниями мутаций гена ABCA4, определены особенности течения, клинической картины НЗС, которые могут помочь практикующим врачам повысить точность диагностики и определить прогноз заболевания. Описаны клинические особенности НЗС при редко встречающихся мутациях генов PROM1, CNGB3.

    Проведение функционального анализа in vitro с использованием минигенов неисследованных ранее генетических вариантов сайтов сплайсинга позволяет оценить тяжесть мутации и дать прогноз их влияния на фенотип НЗС.

    Методология и методы диссертационного исследования

    Методологической основой диссертационной работы явилось применение комплекса методов научного познания. Работа выполнена в дизайне проспективного открытого исследования с использованием клинических, инструментальных, аналитических и статистических методов.

    Положения, выносимые на защиту

    Применение диагностической панели с полным покрытием всех кодирующих областей генов ABCA4, ELOVL4, PROM1, CNGB3, а также некодирующих участков концевых экзонов и участков генов, ответственных за сплайсинг мРНК, обеспечивает высокую эффективность выявления редких экзонных и интронных мутаций и генетической верификации НЗС.

    Описанные клинико-генетические корреляции при мутациях генов ABCA4, PROM1, CNGB3 позволяют прогнозировать течение НЗС, а также суммировать знания клинического течения при частых и редких мутациях. Мутации гена ABCA4 p.G1961E и p.[L541P;A1038V] являются наиболее часто встречающимися у жителей РФ. p.G1961E ассоциирована с лёгким течением НЗС даже при наличии в компаунд-гетерозиготном состоянии второй тяжелой мутации.

    Комплексная мутация p.[L541P;A1038V], а также мутации сайта сплайсинга в большинстве случаев определяют тяжелое течение. Мутации сайтов сплайсинга c.4540-1G>A, c.4540-2A>G и c.4634+1del в гене АВСА4 являются тяжелыми мутациями, которые приводят к нарушению нормального сплайсинга и возникновению преждевременного стоп кодона. Фенотипический эффект у каждого конкретного пациента находится в зависимости от тяжести мутаций, ассоциированных с НЗС. Патогенность мутаций можно определить с помощью функционального анализа.

    Степень достоверности и апробация результатов

    Степень достоверности результатов исследования определяется достаточным и репрезентативным объемом выборок, использованием современных методов исследования и подтверждена в процессе статистической обработки материала. Анализ результатов исследования и статистическая обработка выполнены с применением современных методов сбора и обработки научных данных. Научные положения и выводы, сформулированные в диссертации, аргументированы и логически вытекают из системного анализа результатов клинических и лабораторных исследований.

    Основные положения диссертации доложены на IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2017», на конференции "Молодых ученых Актуальные проблемы офтальмологии -2019 ", заседании проблемной комиссии ФГБНУ «НИИГБ» от июня 2019г.

    Личный вклад автора в проведенное исследование

    Личный вклад автора состоит в проведении клинических исследований, апробации результатов исследования, подготовке докладов и публикаций по теме диссертации. Обработка и интерпретация полученных результатов выполнена лично автором.

    Внедрение результатов работы в практику

    Результаты работы внедрены в клиническую практику на кафедре глазных болезней ПМГМУ им. И.М. Сеченова и в ФГБНУ «НИИГБ».

    Публикации

    По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 5 - в журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК, патент на изобретение «Способ прогнозирования атрофии зрительного нерва при болезни Штаргардта».

    Структура и объем диссертационной работы

    Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 193 источника, из них 8 отечественных и 185 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 26 рисунками.

    

Содержание работы



    Характеристика материала и методов исследования.

    В исследование был включен 61 пациент: 30 мужчин и 31 женщина с НЗС. Средний возраст на момент обследования 37,39±17,03.

    Критерием исключения из исследования было наличие других глазных заболеваний, кроме БШ, КД/ПКД, и ахроматопсии, которые могли повлиять на изменение функции зрения и результаты обследования.

    В группы контроля были включены здоровые добровольцы для проведения мф-ЭРГ (15 человек, 30 глаз), гЭРГ (17 человек, 34 глаза), ОКТ (17 человек, 33 глаза). Группы пациентов и группы контроля были однородны по возрасту (критерий Колмогорова-Смирнова, p>0,1).

    Помимо традиционных офтальмологических методов обследования оценивали цветовое зрение по полихроматическим таблицам для исследования цветоощущения Е.Б. Рабкина. Аутофлюоресценцию (АФ) выполняли на конфокальном сканирующем лазерном офтальмоскопе (HRA-2 «Heidelberg Engineering». С помощью АФ оценивали изменения пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), оценивали размеры, локализацию, степень выраженности атрофического очага, соответствующего атрофии ПЭС.

    ОКТ сетчатки и зрительного нерва проводили с помощью спектральных ретинотомографов RTVue-100 (США). Для оценки структурных изменений использовали следующие протоколы: cross line, ММ5, ONH. В режиме cross line оценивали изменения ПЭС и элипсоидную зону, а такж е с помощью компьютерного программного обеспечения измеряли горизонтальный и вертикальный размеры потери элипсоидной зоны, проходящие через центр фовеа, слой нервных волокон сетчатки (СНВС) в перипапиллярной зоне оценивали с помощью режима ONH.

    Компьютерную периметрию проводили с помощью статической программы M Dynamic (макулярной программы), при низкой остроте зрения – по программе LVC (Low vision) и полуавтоматической кинетической программы с объектом III/4е на периметре Octopus 900 (Interzeag AG, Switzerland). Электрофизиологические исследования включали регистрацию максимальной ганцфельд-ЭРГ (гЭРГ) и мультифокальной ЭРГ (мфЭРГ) («Tomey ЕР-1000 Multifocal», Германия).

    Молекулярно-генетические исследования. Высокопроизводительное параллельное секвенирование кодирующих (экзонных) последовательностей и прилежащих участков интронов генов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3 проводили на приборе Ion Torrent PGM (Life Technologies, США). Секвенирование ДНК по Сэнгеру проводили методом прямого автоматического секвенирования на приборе фирмы «Applied Biosystems» согласно протоколу фирмы-производителя. Секвенирование по Сэнгеру использовали также для анализа сегрегации генетических вариантов в семьях, в том числе – для определения цис/транс-положения мутаций p.L541P и p.A1038V, зачастую располагающихся на одном аллеле. Функциональный анализ патогенности мутаций сайтов сплайсинга в гене ABCA4 проводили с использованием конструкций минигенов, содержащих фрагменты гена ABCA4 дикого типа и изучаемые мутации.

    Статистический анализ проведен с помощью программы Statistica 6.0.

    

Результаты исследований



    Результаты клинических исследований

     Из 61 пациента, включенных в исследование, у 54 выявлены мутации в гене ABCA4. Средний возраст начала заболевания, оцененный со слов пациентов с мутациями в гене ABCA4 и по результатам анализа медицинской документации, составил 18,87±14,72 (5лет/65лет), длительность заболевания – 18,89±15,21 лет (2год/64 года).

    Острота зрения с коррекцией в среднем составляла 0,15±0,15 (0,001/ 0,7). В среднем количество нечитаемых таблиц составило 17,60±7,18 таблиц из 27. При исследовании ПЗ была выявлена центральная относительная и/или абсолютная скотома различной площади и степени депрессии световой чувствительности. У всех 54 обследуемых пациентов выявлены изменения, варьирующие от дезорганизации фоторецепторов/потери эллипсоидной зоны в макулярной области сетчатки до полной атрофии эллипсоидной зоны на всем протяжении среза ОКТ, выраженной атрофии ПЭС, значительного истончения сетчатки. Электрофизиологические изменения сетчатки варьировали от изменений мф-ЭРГ в пределах 1-3 «кольца» до выраженных нарушений параметров мф-ЭРГ и резко выраженных изменений гЭРГ.

    Все пациенты с мутациями в гене АВСА4 и c длительностью заболевания от 5 лет (44чел.) в зависимости от функциональных изменений были распределены в три основные группы: с легким, среднетяжелым и тяжелым течением заболевания (Табл.1).

    При сравнении групп пациентов была получена очень слабая корреляционная связь (K Спирмана=0,27, p<0,05) между тяжестью фенотипа и длительностью заболевания. При исследовании связи возраста начала заболевания и тяжести фенотипа выявили более значимую обратную корреляционную связь K=-0,42, p<0,05. Тем не менее полученная корреляционная связь также является слабой, что согласуется с отдельными клиническими примерами: более легкие формы течения НЗС при достаточно раннем начале и быстропрогрессирующее течение дистрофии сетчатки с выраженными морфофункциональными изменениями при позднем развитии заболевания.

    Анализ данных показал, что при длительности заболевания более 21 года у 9 из 19 пациентов (47%) с фенотипом I сохраняется относительно легкая клиническая картина, что, вероятно, свидетельствует о генетических механизмах влияния на фенотип НЗС. У 8 из 10 (80%) пациентов с тяжелым фенотипом, НЗС началось до 10 лет, в отличии от пациентов с легким фенотипом (5 из 19 пациентов, 26%) и среднетяжелым фенотипом (5 из 15 пациентов, 33%).

    При сравнении 3-х фенотипических групп пациентов с НЗС по показателям толщины сетчатки в фовеа, пара- и перифовеа и объема сетчатки в пределах 1мм³ , 3мм³ , 6 мм³ не было выявлено достоверной разницы. При сравнении с данными контрольной группы все показатели отличались на уровне p<0,001-0,000000.

    Оценивая толщину СНВС согласно нормативной базе данных прибора, истончение СНВС по среднему показателю выявлено только у пациентов с фенотипом II (13% глаз) и III (58% глаз), разница между всеми группами была оценена с помощью хи-квадрат Пирсона: 26,7450, сс=4, p<0,00001. Выявлена прямая корреляция средней силы между тяжестью фенотипа и состоянием СНВС, К=0,61, p<0,05.

    В целом по данным всех пациентов была установлена обратная связь между степенью повреждения эллипсоидной зоны и показателями остроты зрения (R=-0,72; p<0,05), количеством читаемых цветовых таблиц (R=-0,68; p<0,05) и световой чувствительности сетчатки MS (R=-0,68; p<0,05).

    У 7 пациентов с мутациями в гене PROM и CNGB3 средний возраст начала заболевания составил 15,00±8,20 (6лет/26лет), длительность заболевания – 14,57±9,11 лет (5лет/34 года). У этих пациентов также отмечены фенотипические проявления различной тяжести: у 2 пациентов с двумя мутациями в гене PROM1 и у 1 пациента с двумя мутациями в гене CNGB3 фенотип ассоциирован с среднетяжелой/тяжелой формой заболевания, типичной для ПКД; у 3 пациентов с одной выявленной мутацией в гене PROM1 и 1 пациента с мутациями в CNGB3 - более легкий фенотип.

    Результаты генетических исследований

    По результатам высокопроизводительного параллельного секвенирования генов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3 мутации в гене АВСА4 выявлены в 88,5% случаях (54 пациента), из них полное молекулярно-генетическое подтверждение клинического диагноза БШ (две мутации) получено в 87,03% (47 чел.), один патогенный аллель гена ABCA4 обнаружен у 7 больных (12,9%). Мутации в гене PROM1 выявлены у 5 пациентов (8,2%), в гене CNGB3 - у 2 пациентов (3,3%).

    В нашей выборке пациентов выявлены 43 различных мутаций гена АВСА4 (миссенс, нонсенс, сплайсинга, глубокая интронная, делеции со сдвигом рамки считывания) в гене АВСА4, из них наиболее частыми, действительно распространенными в выборке российских больных с БШ, являются две – p.[L541P;A1038V] и p.G1961E (37 чел.) (Табл. 2).

    Клинико-генетические корреляции при мутации p.G1961E в гене ABCA4

    По результатам высокопроизводительного параллельного секвенирования мутация p.G1961E, классифицируемая как «умеренная», в гене ABCA4 была обнаружена у 20 больных, что составило 37% от всех пациентов, наблюдающихся с НЗС и имеющих, по крайней мере, одну мутацию в гене АВСА. У пациентов с длительностью заболевания от 9 лет и более мутация p.G1961E в 81% случаев ассоциирована с лёгким течением НЗС, даже при наличии второй тяжелой мутации, и является предиктором более легкого течения заболевания. Однако в редких случаях встречается более тяжелый фенотип НЗС с мутацией p.G1961E, что, вероятно, обусловлено другими генетическими факторами. Мф-ЭРГ была изменена у всех 20 пациентов. У 7 из 8 пациентов с мутацией p.G1961E в сочетании с комплексной мутацией p.[L541P;A1038V] (в том числе у 6 при клинически легком течении), а также у двух пациентов без выявленной второй мутации обнаружены изменения гЭРГ, выраженные в разной степени.

    Клинико-генетические корреляции при мутации p.[L541P;A1038V] в гене ABCA4

    Гаплотип p.[L541P;A1038V], принятый за единую мутацию гена АВСА4 и классифицируемый многими авторами как «тяжелая» мутация, выявлен у 23 пациентов, что составило 37,7 % от всех пациентов имеющих, по крайней мере, одну мутацию в гене АВСА4. В 52,2% (12 чел.) случаев мутация p.[L541P;A1038V] определяет тяжелое течение. При двух тяжелых мутациях гена АВСА4 p.[L541P;A1038V] в гетерозиготном состоянии с p.S404X, p.R212C, c.4634+1G>-, p.G1977C, p.C1490Y, c.4540-2A>G изначальная БШ может прогрессировать с течением времени в тяжелую распространенную дегенерацию, диагностируемую как ПКД. В компаунд-гетерозиготном состоянии с миссенс-мутацией p.G1961E, а также с легкой мутацией p.G863A и у пациента без второй мутации выявлено относительно легкое течение БШ -39,1% (9чел.). Среднетяжелый фенотип отмечен в 8,7% (2 чел.) случаев, при сочетании мутации p.[L541P;A1038V] с умеренной мутацией c.5714+5C>T.

    При мягких/умеренных мутациях отмечено более позднее начало заболевания, в большинстве случаев с локальными поражениями сетчатки.

    Поздний дебют, по данным нашего исследования, был замечен преимущественно у пациентов с мутацией p.G1961E.

    В целом при сравнении всех показателей пациентов с мутациями p.G1961E (в компаунд-гетерозиготном состоянии с другими мутациями) (1гр.), с комплексной мутацией p.[L541P;A1038V] (в компаунд-гетерозиготном состоянии с другими мутациями) (2 гр.) и при сочетании этих мутаций (3 гр.) было выявлено, что дебют НЗС в 1 гр. наступал значимо позже по сравнению с пациентами 2гр. (p<0,00002) (Табл.3). Несмотря на то, что длительность заболевания в 1 и 2 группе были сопоставимы, структурные и функциональные показатели (показатели цветового зрения, КП, мфЭРГ и гЭРГ, потери эллипсоидной зоны) значимо отличаются, что свидетельствует о более легком течении НЗС у пациентов с p.G1961E в компаунд- гетерозиготном состоянии с другими мутациями по сравнению с комплексной мутацией.

    В то же время НЗС, ассоциированная с тяжелой мутацией p.[L541P;A1038V] в компаунд-гетерозиготном состоянии с p.G1961E, при наибольшей длительности заболевания практически не имеет статистически значимых отличий с 1-й группой, что еще раз подтверждает справедливость классификации мутации p.G1961E как «умеренной».

    Клинико-генетические корреляции при мутациях сайта сплайсинга в гене АВСА4

    Большинство мутаций сайтов сплайсинга в гене АВСА4 (в пределах 95%) являются тяжелыми, по механизму действия равнозначны нуль-мутациям, приводящим к полной утрате функции белка, и обычно ассоциируются с ПКД, ПА или с тяжелой формой БШ с последующим прогрессированием в течение времени. У наших пациентов с мутациями сайта сплайсинга и тяжелыми миссенс-мутациями в кампаунд-гетерозиготном состоянии, которые приводят к нарушению локализации белка в клетке и делают белок полностью неэффективным, фенотип соответствует тяжелой форме заболевания (ПКД) у 54,5% (6чел.). У остальных 27,3% (3чел.) наблюдали среднетяжелый, у 18,2% (2чел.) - легкий фенотип НЗС. У 2 пациентов со сроком наблюдения 2-3 года тяжесть фенотипа сложно фиксировать, хотя в настоящее время клиническая картина соответствует легкому течению.

    Особенности клинического течения НЗС у пациентов с редкими мутациями в гене АВСА4

    Помимо 2 частых мутаций (p.G1961E, p.[L541P;A1038V]), описанных выше, в нашей выборке у 79,6% (43 чел.) пациентов с НЗС обнаружены редкие мутации в гене АВСА4 (в общей сложности 41 редкая мутация). У 55,8% (24 чел.) редкие мутации выявлены в компаунд-гетерозиготном состоянии с частыми мутациями: у 23,2% (10 чел.) в сочетании с p.G1961E и у 32,5% (14 чел. ) - с мутацией p.[L541P;A1038V]. Редкие мутации сайта сплайсинга в гетерозиготном состоянии выявлены у 11,6% (5 чел.) . Фенотип у пациентов с редкими мутациями варьировал от легкой до тяжелой формы заболевания с различными фенотипическими проявлениями.

    У части пациентов были выявлены редкие генетические варианты гена ABCA4, степень патогенности которых была изучена ранее, мутации описаны как легкие и тяжелые (Табл.4). При сравнении морфофункциональных показателей 16 пациентов (32 глаз) при одинаковой длительности заболевания, у которых НЗС было ассоциировано с легкой и тяжелой мутациями (1 гр.) и двумя тяжелыми мутациями (2 гр.) было подтверждена значимая их разница, а также выявлена корреляция высокой степени клинических изменений соответственно тяжести мутаций по показателям остроты зрения, потери цветового зрения, тяжести фенотипу, потери элипсоидной зоны (К=0,8-0,85, p<0,05).

    Установлена прямая и обратная корреляционная связь высокой и средней степени между тяжестью мутаций и изменениями параметров P1[ms], P1[nV/deg2], P1[uV] мфЭРГ преимущественно в 3-5-м «кольцах» (К=0,57-0,94, p<0,05), а также показателей гЭРГ (К=0,56-0,78, p<0,05). Таким образом, для прогнозирования течения и прогрессирования НЗС, определения тяжести заболевания важно знать степень патогенности мутации.

    Функциональный анализ in vitro мутаций сайтов сплайсинга c.4540-1G>A, c.4540-2A>G и c.4634+1del с использованием минигенов ABCA4

    Для оценки патогенности интронных вариантов c.4540-1G>A, c.4540-2A>G и c.4634+1del, расположенных в пределах донорного и акцепторного сайтов сплайсинга 31-го экзона гена ABCA4, мы провели анализ сплайсинга in vitro с использованием минигенов. Анализ сплайсинга in vitro показал, что все протестированные варианты нарушают нормальный сплайсинг в области 31-го экзона гена ABCA4. Варианты c.4540-1G>A и c.4540-2A>G разрушают консенсусный динуклеотид акцепторного сайта сплайсинга и приводят к активации нижележащего криптического сайта сплайсинга. В результате происходит укорочение 31-го экзона на 2 нуклеотида.

    Для мутации c.4634+1del нами показано двоякое влияние на сплайсинг 31-го экзона гена ABCA4. Мажорным нарушением является укорочение 31-го экзона на 32 нуклеотида за счет активации внутриэкзонного криптического сайта сплайсинга. В меньшей доле молекул наблюдается аномальный пропуск 31-го экзона. В настоящем исследовании было доказано нарушение нормального сплайсинга в результате каждой из трех исследованных мутаций в гене АВСА4. Мутации c.4540-1G>A, c.4540-2A>G и c.4634+1del приводят к сдвигу рамки считывания и возникновению преждевременного стоп кодона, которое провоцирует деградацию мРНК за счет её нонсенс-опосредованного распада. Таким образом, исследованные генетические варианты являются нуль-мутациями гена ABCA4 и должны рассматриваться как тяжелые мутации. Их фенотипический эффект у каждого конкретного пациента находится в зависимости от мутаций, находящихся с ними в компаунд-гетерозиготном состоянии.

    

Выводы



    1. Впервые в РФ на достаточном клиническом материале (61 пациент, 122 глаза) проведен анализ клинико-генетических характеристик НЗС при мутациях генов ABCA4, PROM1, ELOVL4 и CNGB3 на основе современных высокотехнологичных методов диагностики и высокопроизводительного параллельного секвенирования ДНК.

    2. По результатам высокопроизводительного параллельного секвенирования мутации в гене АВСА4 выявлены в 88,5% случаях (54 пациента с БШ и ПКД), из них полное молекулярно-генетическое подтверждение клинического диагноза НЗС (две мутации) получено в 87% (47 чел.). Мутации в гене PROM1 выявлены в 8,2% (5 пациентов с ПКД и БШ), гене CNGB3 - 3,3% случаев (2 пациента с ПКД и ахроматопсией).

    3. Анализ спектра мутаций гена ABCA4 в 64,8% случаев (35 чел.) выявил две частые мутации p.[L541P;A1038V] и p.G1961E: их сочетание в 22,8% случаев, в 68,6% частые мутации находились в компаунд-гетерозиготном состоянии с выявленными редкими мутациями гена ABCA4. Структура типов редких мутаций гена ABCA4 оказалась следующей: 25 миссенс-мутаций (60,9%), 5 нонсенс-мутаций (12,2%), 8 мутаций сайта сплайсинга (19,5%), 2 делеции (4,9%), 1 дупликация (2,4%).

    4. У пациентов с длительностью заболевания более 5-ти лет выявлен легкий, среднетяжелый и тяжелый фенотип НЗС соответственно в 43,2%, 34,1% и 22,7% случаев. Обнаружена обратная корреляционная связь между возрастом начала заболевания и тяжестью фенотипа (K=-0,42, p<0,05).

    5. Изучены клинико-генетические корреляции повреждений гена ABCA4 в зависимости от типов и топологии мутаций:

    • Обнаружено, что мутация p.G1961E, выявленная у 20 пациентов, в 81% случаев ассоциирована с лёгким течением НЗС, даже при наличии второй тяжелой мутации, и является предиктором более легкого течения заболевания. Обнаружена диссоциация между структурно-функциональными и электрофизиологическими показателями: в 75% случаев при клинически легком фенотипе обнаружены выраженные в разной степени изменения гЭРГ.

    • Выявлено, что комплексная мутация p.[L541P;A1038V], обнаруженная у 23 пациентов, в 52,2% (12 чел.) случаев определяет тяжелое течение. Относительно легкое течение НЗС выявлено в 34,7% (8 чел.) случаев в компаунд-гетерозиготном состоянии с легкими мутациями p.G1961E, p.G863A.

    • Выявлена сильной и средней степени корреляционная связь между патогенностью частых и редких мутаций гена ABCA4 и морфофункциональными характеристиками НЗС.

    • Показано, что у пациентов с мутациями сайта сплайсинга в кампаунд-гетерозиготном состоянии с тяжелыми миссенс-мутациями фенотип соответствует тяжелой форме заболевания в 54,5% случаев (6 чел.). В 27,3% (3чел.) и 18,2% (2чел.) наблюдали среднетяжелый и легкий фенотип НЗС соответственно.

    6. Функциональный анализ in vitro мутаций сайта сплайсинга c.4540-1G>A, c.4540-2A>G и c.4634+1del в гене АВСА4 показал, что исследованные генетические варианты являются тяжелыми мутациями, которые приводят к нарушению нормального сплайсинга и возникновению преждевременного стоп-кодона. Их фенотипический эффект у каждого конкретного пациента находится в зависимости от мутаций, находящихся с ними в компаунд-гетерозиготном состоянии.

    

Практические рекомендации



    1. Пациентов с клиническими признаками НЗС (БШ, ПКД/КД, ахроматопсия) необходимо направлять на молекулярно-генетическоийо анализ методом высокопроизводительного параллельного секвенирования всех кодирующих участков генов ABCA4, ELOVL4, PROM1, CNGB3.

    2. В зависимости от тяжести мутации возможно прогнозировать течение и прогрессирование заболевания. Выявление у пациентов мутации p.G1961E позволяет прогнозировать более легкое течение, при диагнозе БШ и двух тяжелых мутациях большая вероятность прогрессирования в ПКД.

    3. При выявлении редких мутаций гена ABCA4 с неизвестной патогенностью целесообразно проводить функциональный анализ мутации.

    

Список работ, опубликованных по теме диссертации



    1. Шеремет Н.Л., Грушкэ И.Г., Жоржоладзе Н.В., Ронзина И.А., Кириллова К.И., Стрельников В.В. Клинический полиморфизм наследственных заболеваний сетчатки при мутациях гена АВСА4. Современные технологии в офтальмологии. 2017; 3:115-118.

    2. Стрельников В.В., Шеремет Н.Л., Жоржоладзе Н.В., Ронзина И.А., Грушкэ И.Г., Чухрова А.Л., Логинова А.Н., Танас А.С., Поляков А.В. Совершенствование молекулярно-генетической диагностики болезни Штаргардта в России //Сборник трудовIX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2017» - 2017. – Т. 2. – С. 292-293.

    3. Шеремет Н.Л., Жоржоладзе Н.В., Ронзина И.А., Грушкэ И.Г., Курбатов С.А., Чухрова А.Л., Логинова А.Н., Щербакова П.О., Танас А.С., Поляков А.В., Стрельников В.В. Молекулярно-генетическая диагностика болезни Штаргардта. Вестник офтальмологии. – 2017. – Т.133, №4. – С.4-11.

    4. Шеремет Н.Л., Грушкэ И.Г., Жоржоладзе Н.В., Кириллова К.И., Стрельников В.В. Наследственные заболевания сетчатки при мутациях гена ABCA4. Вестник офтальмологии. 2018;134(4):68-73.

    5. Жоржоладзе Н.В., Шеремет Н.Л., Ронзина И.А., Ханакова Н.А., Грушкэ И.Г., Стрельников В.В. Состояние слоя перипапиллярных нервных волокон у пациентов с болезнью Штаргардта по данным ОКТ-исследования. Журнал МНТК Екатеринбургский центр «Отражение». - №1, 2017. – С.14-17.

    6. Шеремет Н.Л., Грушкэ И.Г., Жоржоладзе Н.В., Ронзина И.А , Микаелян А.А., Танас А.С., Стрельников В.В. Полиморфизм клинических проявлений при мутациях сайта сплайсинга в гене АВСА4. Вестник офтальмологии. -2018.-Т.134, №6. –С.82-91. 2018;134(6): 83-93

    7. Н.Л. Шеремет, И.Г. Грушкэ, Н.В. Жоржоладзе, И.А Ронзина, А.А. Микаелян, В.В. Кадышев, А.С. Танас, К.И. Аношкин, В.В. Стрельников . Клинико-генетические корреляции у пациентов с наследственными заболеваниями сетчатки при комплексной мутации [L541P;A1038V] в гене АВСА4. Точка зрения. Восток-Запад: научно-практический журнал. 2018; 2:51-54.

    8. Наталия Леонидовна ШЕРЕМЕТ, Ирина Григорьевна ГРУШКЭ, Нино Владимировна ЖОРЖОЛАДЗЕ, Ирина Адольфовна РОНЗИНА, Азнив Ашотовна МИКАЕЛЯН, Сергей Александрович КУРБАТОВ, Виталий Викторович КАДЫШЕВ, Кирилл Игоревич АНОШКИН, Владимир Викторович СТРЕЛЬНИКОВ. СПЕКТР МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ И РАЗНООБРАЗИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ФОРМ БОЛЕЗНИ ШТАРГАРДТА. Сибирский научно медицинский журнал 2018;5(38):65-72

    9. Н.Л. Шеремет, И.Г. Грушкэ, Н.В. Жоржоладзе, И.А Ронзина, А.А. Микаелян, А.С. Танас, К.И. Аношкин, В.В. Стрельников. Клинико-генетические корреляции у пациентов с наследственными заболеваниями сетчатки при мутации p.G1961E в гене АВСА4. Вестник офтальмологии. 2019; 135(4): 10-18

    10. И.Г. Грушкэ, Н.Л. Шеремет, Н.В. Жоржоладзе, И.А Ронзина, А.А. Микаелян, А.С. Танас, К.И. Аношкин, В.В. Стрельников. Возможность прогнозирования тяжести клинического течения наследственных заболеваний сетчатки у пациентов с мутацией p.G1961E в гене АВСА4. Современные технологии в офтальмологии. 2019; . № 4 2019.Актуальные проблемы офтальмологии. С.63-67.

    11. Н.Л. Шеремет, И.А. Ронзина, В.В. Стрельников, А.А. Микаелян, И.Г. Грушкэ, Н.В. Жоржоладзе, С.Л. Киселев. Возможности электроокулографии в оценке функционального состояния сетчатки. Точка зрения. Восток-Запад: научно-практический журнал. 2019; 2:71-75.

    Список изобретений:

    Аветисов С.Э., Шеремет Н.Л., Жоржоладзе Н.В., Грушкэ И.Г., Ханакова Н.А., Стрельников В.В. Способ прогнозирования атрофии зрительного нерва при болезни Штаргардта. Патент РФ: заявка №2017104240 от 09.02.2017. Патент РФ на изобретение №2644693 от 13.02.2018

    

Список сокращений



    АФ – аутофлюоресценция

    НЗС –наследственные заболевания сетчатки

    БШ – болезнь Штаргардта

    ПКД – палочко-колбочковая дистрофия

    ПА – пигментная абиотрофия

    гЭРГ – ганцфельд-ЭРГ

    КП – компьютерная периметрия

    мф-ЭРГ – мультифокальная электроретинография

    ОКТ – оптическая когерентная томография

    ПЭС – пигментный эпителий сетчатки

    СНВС – слой нервных волокон сетчатки

    ОЗ – острота зрения


Город: Москва
Дата добавления: 26.12.2019 12:46:21, Дата изменения: 27.12.2019 11:46:09