Онлайн доклады

Онлайн доклады

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Пироговская офтальмологическая академия

Пироговская офтальмологическая академия

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Роговица V Новые достижения и перспективы

Конференция

Роговица V Новые достижения и перспективы

Научно-образовательные вебинары

Научно-образовательные вебинары

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Конгресс

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Конференция

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Конференция

Пироговский офтальмологический форум

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики и хирургического лечения патологии заднего отдела глазного яблока и зрительного нерва Межрегиональная научно-практическая конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Инновационные технологии диагностики, терапии и хирургии патологии переднего отдела глазного яблока, глаукомы и придаточного аппарата органа зрения Межрегиональная научно-практическая конференция

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Белые ночи - 2021 Сателлитные симпозиумы в рамках XXVII Международного офтальмологического конгресса

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Sochi Cornea 2021 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Пироговская офтальмологическая академия

Пироговская офтальмологическая академия

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Актуальные вопросы офтальмологии. Круглый стол компании «Бауш Хелс»

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор. II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Роговица V Новые достижения и перспективы

Конференция

Роговица V Новые достижения и перспективы

Научно-образовательные вебинары

Научно-образовательные вебинары

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ-2020

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Конгресс

Расширенное заседание Экспертного Совета по проблемам глаукомы и группы «Научный авангард»

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Сателлитные симпозиумы в рамках XII Съезда Общества офтальмологов России

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Конференция

Современные технологии лечения заболеваний глаз. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Конференция

Пироговский офтальмологический форум

Все видео...
Год
2020

Влияние антибактериальной терапии на состав и свойства микрофлоры конъюнктивы при интравитреальных инъекциях


Органзации: В оригинале: ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»
    Научные руководители:

    доктор медицинских наук Будзинская Мария Викторовна

    доктор биологических наук Страховская Марина Глебовна

    

    Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

    

Общая характеристика работы



    Актуальность темы и степень ее разработанности

     Одним из самых распространенных способов лечения ретинальной патологии является интравитреальная инъекция (ИВИ) антивазопролиферативных препаратов. Инфекционные осложнения при данных инъекциях возникают редко, однако не следует пренебрегать методами профилактики их развития. Наиболее грозным и неблагоприятным осложнением из них является эндофтальмит.

    Основными источниками инфицирования являются патогены края век и конъюнктивы, которые проникают в стекловидную камеру с контаминированной инъекционной иглой [de Caro J.J., 2008] или через раневой канал [Иошин И.Э., 2017; Hunyor A.P., 2018; Kim S.J. 2010]. Считается, что одним из наиболее частых возбудителей эндофтальмита является Staphylococcus epidermidis [Dave S.B., 2013; Uckay I., 2009; Rogers K.L. 2009]. Этот вид является преобладающим в нормальной микрофлоре глаза, однако может вызывать и серьезные инфекционные осложнения.

    Среди штаммов S. epidermidis широко распространены специфические гены резистентности к антибиотикам [Otto M., 2009]. Большинство этих генов плазмидные и чаще встречаются у метициллин-резистентных штаммов [Miragaia M., 2002]. Высокий уровень резистентности у S. epidermidis является следствием нерациональной антибиотикотерапии [Otto M., 2009; Storey P., 2016] и серьезной проблемой при ведении больных с интравитреальными инъекциями (ИВИ), что требует применения эффективных периоперационных методов профилактики инфекционных осложнений.

    Что касается профилактических курсов антибактериальных препаратов до и после ИВИ, то до недавнего времени обычной практикой являлось назначение антибиотиков местного действия в виде глазных капель (тобрамицин, неомицин+полимиксин b+дексаметазон и др.). Однако, короткие многократные курсы антибиотиков, сопровождающие повторяющиеся ИВИ, приводят к селекции резистентной микрофлоры конъюнктивы [Milder E., 2012; Dorrepaal S.J., 2014]. В этом случае альтернативой антибиотикам в качестве предоперационной подготовки глаза и послеоперационной профилактики инфекционных осложнений может стать применение антисептиков. В глазной хирургии «золотым стандартом» профилактики инфекционных осложнений считается повидон-йод [Merani R., 2016]. Хлоргексидин, антисептик из груп пы бигуанидов, также зарекомендовал себя как эффективное антибактериальное средство для применения в операционной. В исследовании, проведенном Gili et al. [Gili N.J., 2018], после обработки конъюнктивальной полости 0,05% раствором хлоргексидина, было отмечено уменьшение числа бактерий на 82%, при этом содержание КНС снизилось на 90%. Еще один бигуанид – пиклоксидин дигидрохлорид (N,N''-бис[[(4-хлорфенил)амино]иминометил]-1,4-пиперазиндикарбоксимидамид дигидрохлорид) - антисептик широкого спектра действия из группы бигуанидов. Препарат активен в отношении S. aureus, Escherichia coli, Sarcina lutea, Chlamydia trachomatis [Истомина Т.К., 2018].

    Однако, в литературе не описаны данные по применению пиклоксидина в терапии пациентов с ИВИ, а также его эффективность в отношении антибиотикорезистентных конъюнктивальных изолятов, в том числе S. epidermidis.

    Цель исследования – изучение влияния антибактериальной терапии на состав и свойства микрофлоры конъюнктивы при интравитреальных инъекциях.

    Задачи исследования:

    1. Определить видовой состав микрофлоры конъюнктивы глаза

    2. Исследовать чувствительность микрофлоры конъюнктивы глаза к антибиотикам, применяемым в офтальмологической практике

    3. Провести анализ между использованием местных антибиотиков и уровнем резистентных штаммов у пациентов после многократных интравитреальных инъекций

    4. Оценить эффективность применения антисептика пиклоксидина как средства для профилактики инфекционных постинъекционных осложнений

    5. Разработать практические рекомендации для ведения пациентов с интравитреальными инъекциями с целью минимизации риска возникновения инфекционных осложнений

    Научная новизна работы:

    1. Впервые на репрезентативной выборке изучен состав микрофлоры конъюнктивы пациентов с различным анамнезом по интравитреальным инъекциям.

    2. Получены данные о повышенном уровне антибиотикорезистентности изолятов, выделенных с конъюнктивы у пациентов, получивших 20 и более ИВИ в анамнезе с сопутствующими курсами антибиотикотерапии.

    3. Проанализирована антибактериальная эффективность препаратов тобрамицин и пиклоксидин при их применении до и после однократной интравитреальной инъекции.

    4. Изучен механизм действия антисептика пиклоксидина на конъюнктивальных изолятах, выделенных у пациентов различных групп и различающихся по чувствительности к антибиотикам.

    Теоретическая и практическая значимость работы

    В проведенном исследовании определен типичный видовой состав микрофлоры глазной поверхности, изучена чувствительность конъюнктивальной микрофлоры к основным группам антибиотиков. В работе проанализирован бактерицидный эффект антисептика пиклоксидина в отношении чувствительных и резистентных к антибиотикам конъюнктивальных изолятов бактерий.

    Установлено, что взаимодействие пиклоксидина с клетками бактерий не зависит от их антибиотикорезистентности, что создает основу для использования данного антисептика в случае инфицирования глазной поверхности штаммами бактерий, устойчивыми к глазным антибиотикам. При изучении механизма действия пиклоксидина показано эффективное связывание положительно заряженных молекул антисептика с отрицательно заряженной поверхностью микроорганизмов, ведущее к нарушению ее проницаемости и разрушению клетки.

    Методология и методы диссертационного исследования

    Методологической основой диссертационной работы явилось применение комплекса методов научного познания. Работа выполнена в дизайне проспективного открытого исследования с использованием клинических, инструментальных, морфологических, аналитических и статистических методов.

    Положения, выносимые на защиту:

     1. Антибиотикорезистентная микрофлора глаза представлена коагулазонегативными стафилококками, в первую очередь Staphylococcus epidermidis.

    2. У пациентов, получивших 20 и более интравитреальных инъекций и сопутствующих курсов антибиотикотерапии препаратами тобрамицин и неомицин + полимиксин b + дексаметазон, выявлено двухкратное увеличение содержания полирезистентных изолятов в составе микрофлоры конъюнктивы.

    3. Антисептик пиклоксидин обладает высоким бактерицидным потенциалом и может служить альтернативным средством для периоперационного использования в хирургии интравитреальных инъекций.

    Степень достоверности работы и апробация результатов

    Степень достоверности результатов проведенных исследований определяется достаточным и репрезентативным объемом выборок, применением современных методов исследования, широко распространенных при проведении научных исследований и на практике, что позволило получить результаты с признаками научной новизны, полноты и достоверности. Статистический анализ материалов исследования выполнен с применением современных методов обработки научных данных. Выводы и заключения, представленные в диссертационной работе, подтверждены и обоснованы данными системного анализа результатов клинико-инструментальных исследований.

    Материалы диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на XXIV Международном офтальмологическом конгрессе «Белые ночи» (Санкт-Петербург, 2018), 7-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные те хнологии лечения витреоретинальной патологии» (Сочи, 2019г.), Х Международной конференции по офтальмологии «Восток-Запад» (Уфа, 2019).

    Личный вклад автора в проведенное исследование:

    Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования: в разработке идеи работы, анализе изученности темы по данным современной литературы, в определении цели и задач, выборе методов исследования, статистической обработке полученных результатов с последующей интерпретацией, формулировании положений на защиту, выводов и практических рекомендаций. Автором лично проведены сбор материала для данного исследования, литературы для обзора современны х данных по теме диссертационной работы, выполнении этапов исследования, а также получении основных результатов, изложенных в работе.

    Внедрение результатов работы

    Результаты настоящего исследования внедрены в лечебную деятельность и применяются в работе Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт глазных болезней».

    Публикации

    По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них – 3 в журналах, входящих в перечень рецензируемых журналов и изданий, рекомендованных ВАК.

    Структура и объем диссертационной работы

    Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами. Библиографический указатель содержит 149 источников (31 отечественных и 118 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 9 рисунками.

    

Содержание работы



    Материалы и методы исследования

    В исследование было включено 80 больных (80 глаз). Больные были разделены на 3 группы по критериям количества проведенных ИВИ и местных средств, применяемых до и после ИВИ: I группа – больные, получившие 20 и более ИВИ в анамнезе и сопутствующие курсы антибиотикотерапии (группа «Многократные ИВИ») – 20 глаз (20 проб); IIа группа – больные, которым предстояло лечение ИВИ и которым был назначен антисептический препарат пиклоксидин за 3 дня до интравитреальной инъекции и в течение 5 дней после интравитреальной инъекции (группа «Пиклоксидин») – 20 глаз, 40 проб (до и после лечения); IIb группа – больные, которым предстояло лечение ИВИ и которым был назначен антибиотик тобрамицин за 3 дня до интравитреальной инъекции и в течение 5 дней после интравитреальной инъекции (группа «Тобрамицин») – 20 глаз, 40 проб (до и после лечения); III группа – 20 человек, сопоставимых по возрасту, без интравитреальных инъекций и офтальмологических операций в анамнезе (группа «Контроль») – 20 глаз (20 проб). Пациенты были включены в исследование при соответствии следующим критериям: наблюдение или лечение в отделе Патологии сетчатки и зрительного нерва и согласие пациента на участие в исследовании. Критериями исключения являлись: возраст моложе 50 лет, прием системных антибиотиков в а намнезе в течение 3 месяцев до взятия посева и на момент исследования, гипотензивный капельный режим по поводу глаукомы, применение глазных капель для лечения сопутствующей офтальмологической патологии на момент исследования и офтальмологические операции в анамнезе. Помимо этого, у пациентов IIа («Пиклоксидин») и IIb («Тобрамицин») групп, критерием исключения являлось употребление антибактериальных капель (антибиотиков либо антисептиков) в анамнезе и на момент исследования.

    Определение видового состава конъюнктивальных изолятов и их чувствительности к антибиотикам проводилось с помощью автоматизированного бактериологического анализатора BD Phoenix 100 и было выполнено на базе Федерального научно-клинического центра специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России. Общее число образцов микрофлоры конъюнктивы составляло 120 проб. У пациентов I («Многократные ИВИ») и III («Контроль») групп посев выполнялся однократно, взято по 20 проб в каждой группе. У пациентов II группы (подгруппы IIа -«Пиклоксидин» и IIb - «Тобрамцин») забор материала проводился до инъекции и до назначения капель с антисептиком или антибиотиком (20 проб в каждой подгруппе) и после инъекции и завершения курса профилактического лечения (20 проб в каждой подгруппе). У пациентов групп I, IIa, IIb забор материала проводился на следующее утро после завершения курса капель (накануне вечером).

    Определение чувствительности изолятов микрофлоры конъюнктивы к антисептическому препарату пиклоксидин дигидрохлорида и изучение механизма действия пиклоксидина на бактериальные клетки проводилось на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. В исследование по определению чувствительности изолятов включено 47 антибиотикорезистентных и антибиотикочувствительных культур бактерий, полученных из посевов проб с конъюнктивы всех групп. Минимальная подавляющая рост концентрация, МПК, и минимальная бактерицидная концентрация, МБК, определялись методом серийных разведений пиклоксидина в жидкой питательной среде. Для каждого изолята и всех разведений пиклоксидина, а также контрольных образцов без препарата, регистрировали оптическую плотность при 490 нм с помощью Perkin Elmer Wallac 1420 Multilabel Counter в начальный момент времени, при внесении препарата в жидкую питательную среду, а также в течение 96 ч роста бактерий с соответствующими разведениями при 37 0 С. За минимальную подавляющую рост концентрацию, МПК, принимали такую, при которой рост культур отсутствовал через 24 ч, а за минимальную бактерицидную концентрацию, МБК, - через 72 ч.

    Для подтверждения бактерицидного действия препарата после регистрации оптической плотности через 96 ч проводили контрольные высевы на твердую питательную среду.

    Исследование ультраструктуры бактериальной клетки при воздействии антисептика пиклоксидин дигидрохлорида проводили методом сканирующей электронной микроскопии с помощью двухлучевого сканирующего ионно-электронного микроскопа Quanta 200 3D (FEI Company, USA). Было исследовано 12 антибиотикорезистентных и антибиотикочувствительных культур изолятов бактерий, выделенных из посевов проб с конъюнктивы. Для каждого изолята бактерий получены изображения ультраструктуры клеток без воздействия, при воздействии пиклоксидина без разведения в течение 15 минут и при воздействии препаратом в разведении 1:16 в течение 60 минут, всего получено 72 снимка.

    Определение эффективности связывания антисептика пиклоксидин дигидрохлорида клетками антибиотикорезистентных и антибиотикочувствительных изолятов микрофлоры конъюнктивы методом измерения дзета-потенциала. Всего было исследовано 40 изолятов, выделенных у пациентов различных групп. Исследование было направлено на измерение поверхностного заряда (дзета-потенциала) клеток бактерийантибиотикорезистентных и антибиотикочувствительных изолятов и определение эффективности связывания пиклоксидин дигидрохлорида по нейтрализации отрицательно заряженной поверхности клеток бактерий положительно заряженными молекулами антисептика. Измерения дзета-потенциала проводили на анализаторе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK).

    Все данные, полученные в ходе исследования и анализа пациентов, были внесены в базу данных Microsoft Excel. Статистическая обработка результатов проводилась в пакете программ Statistica 10.0. Различия считались достоверными при p – уровне значимости меньше 0,05 (5%).

    Результаты собственных исследований

     Определение видового состава конъюнктивальных изолятов и их чувствительности к антибиотикам

    Общая характеристика видового состава конъюнктивальных изолятов

    Было собрано 120 мазков с конъюнктивы 80 глаз. Из этих 120 мазков 58 были положительными, из которых культивированы 59 изолятов. Большинство изолятов (55 из 59; 93,2%) представляло собой различные виды стафилококков (Staphylococcus epidermidis (70,9%), затем следовали S. aureus (12,7%), S. hominis (7,3%), S. haemolyticus (5,5%), S. caprae (1,8%), S. lugdunensis (1,8%)), то есть, грамположительную флору. Также были выделены грамотрицательные микроорганизмы (по 1 изоляту) – Enterococcus cloacae (6,8%), Escherichia coli (6,8%), Pseudomonas aeruginosa (6,8%), P. luteola (6,8%).

    Видовой состав и чувствительность к антибиотикам конъюнктивальных изолятов, полученных в группах контроля, «Пиклоксидин» и «Тобрамицин» до лечения

    В контрольной группе, группах «Тобрамицин» и «Пиклоксидин » до лечения на момент взятия посевов из конъюнктивальной полости статус пациентов был одинаков относительно употребления в анамнезе офтальмологических капель, в том числе антибиотиков и антисептиков (p>0,05 для Критерия Краскала-Уоллиса).

    У пациентов данных групп преобладала грамположительная флора, а по частоте выделения доминировал S.epidermidis (Таблица 1). В этих группах 15 из выделенных 41 изолятов были полирезистентны (36,6%), среди них преобладали коагулазонегативные стафилококки (33 изолята, 15 резистентных, 45,45%), из них 28 изолятов S.epidermidis (10 резистентных, 35,71%). Таким образом, у потенциальных офтальмологических больных (группы IIa и IIb до лечения) был выявлен высокий (33,33%) уровень резистентности уже на исходном уро вне. Что касается устойчивости изолятов конъюнктивы к антибиотикам, применяемым в офтальмологической практике, то каждый десятый изолят (11,1%) обладал устойчивостью к тетрациклину, каждый седьмой (14,8%) – к фторхинолонам и каждый пятый (18,5%) – к аминогликозидам.

    Видовой состав и чувствительность к антибиотикам конъюнктивальных изолятов, полученных в группе I пациентов с многократными инъекциями

    В группе I пациентов с 20 и более ИВИ (Таблица 1) рост микрофлоры отмечался в 11 случаях (55%) из 20. Одиннадцать культур представляли собой стафилококки (S.epidermidis (66,66 %), S.haemoyticus (16,67%), S.aureus (8,33%)).

    У 1 пациента обнаружена грамотрицательная Pseudomonas aureginosa (8,33%).

    Таким образом, КНС составляли 90,9% от общего числа выделенных стафилококков. В данной группе не было выделено чувствительных штаммов. Резистентность к 1 антибиотику отмечена только у грамотрицательных P.aeruginosa (8,33%), к 3 антибиотикам - у 2 изолятов (16,67%). У 1 изолята (8,33%) была обнаружена резистентность к 4 антибиотикам, а 7 изолятов (66,67%) были резистентны к 5-13 антибиотикам. Все изоляты S.epidermidis были полирезистентны. Таким образом, в группе III (с многократными ИВИ и сопутствующими курсами профилактики антибиотиками тобрамицин/ неомицин+полимиксин b+дексаметазон) полирезистентность проявляли 9 из 12 изолятов (75%), что почти в два раза превышает средний процент полирезистентных изолятов (30-43%) в группах пациентов без ИВИ в анамнезе (различия достоверны, p<0,05 для критерия Манна-Уитни для всех попарных сравнений групп с множественными ИВИ).

    Примечательно, что у пациентов, получавших курсы антибиотикотерапии препаратами аминогликозида тобрамицина и аминогликозида неомицина, полимиксина B и дексаметазона (Рис.1), наблюдалась резистентность и к другим антибиотикам, что говорит о возникновении феномена перекрестной резистентности.

    В таблице 2 просуммированы все случаи проявления резистентности у выделенных в двух группах пациентов культур по отдельным антибиотикам.

    Значительный рост количества резистентных изолятов в группе пациентов, получивших 20 и более инъекций, по сравнению с контрольной, наблюдается к пенициллину G, доксициклину, гентамицину, тобрамицину, эритромицину, клиндамицину, моксифлоксацину, фузидовой кислоте, хлорамфениколу и триметоприм/сульфаметоксазолу (p<0,05 для критерия Манна-Уитни).

    Видовой состав и чувствительность к антибиотикам конъюнктивальных изолятов, полученных в группах «Пиклоксидин» и «Тобрамицин » после лечения

    После завершения курса препаратов тобрамицин и пиклоксидин, положительными были 2 и 4 посева из 20, соответственно. Выделенные после лечения изоляты были следствием вторичного бактериального заражения штаммами, отличающимися от исходных. Эффективность пиклоксидина была близка к таковой тобрамицина при однократном применении (p=0,0417 для Критерия Манна-Уитни).

    Полученные данные свидетельствуют о том, что применение пиклоксидина может рассматриваться в качестве альтернативы антибиотику для профилактического применения при процедуре ИВИ. Для подтверждения эффективности пиклоксидин дигидрохлорида в отношении изолятов конъюнктивы были проведены исследования in vitro по определению чувствительности изолятов и механизма его бактерицидного действия.

    Определение чувствительности к антисептическому препарату пиклоксидин дигидрохлорида изолятов микрофлоры конъюнктивы

    С помощью микрометода серийных разведений в жидкой питательной среде были проанализированы динамики роста 44 изолятов стафилококков без и в присутствии пиклоксидин дигидрохлорида. Эти изоляты включали 5 изолятов S. aureus (1 чувствительный к антибиотикам, 4 устойчивых к 1-2 классам антибиотиков), 33 изолята S. epidermidis (2 чувствительных к антибиотикам, 15 устойчивых к 1-2 классам антибиотиков и 16 полирезистентных), 2 S. haemolyticus (1 устойчивый к 2 классам антибиотиков и 1 полирезистентный), 3 S. hominis (1 чувствительный и 2 полирезистентных), 1 S. caprae (полирезистентный). В исследование также были включены три грамотрицательных изолята: P. aeruginosa, P. luteola и E. coli.

    На рис. 2 приведены типичные динамики роста (по увеличению оптической плотности культур) для двух изолятов S. epidermidis: изолят №1 получен от больного до лечения, обладал устойчивостью к клиндамицину, хлора мфениколу и эритромицину. Изолят № 2, полученный от больного с многократными ИВИ и повторяющимися курсами антибиотикотерапии, проявлял устойчивость к ампициллину и оксациллину (метициллин-резистентный стафилококк), доксициклину, клиндамицину, эритромицину, аминогликозидам гентамицину и тобрамицину.

    В соответствии с полученными динамиками роста и контрольными высевами на твердую среду, у 43 изолятов стафилококков МПК=МБК=15,625 мкг/мл пиклоксидин дигидрохлорида, у одного изолята S.epidermidis МПК=15,625 мкг/мл, а МБК составляла 31,25 мкг/мл. Чувствительность грамотрицательной микрофлоры к пиклоксидин дигидрохлориду ниже, чем у грамположительной.

    Для E.coli МПК=МБК=62,5 мкг/мл пиклоксидин дигидрохлорида; для P.luteola МПК=15,625 мкг/мл, а МБК=31,25 мкг/мл; наиболее устойчивым являлся изолят P.aeruginosa, у которого слабый рост через 24 и 96 ч отмечен даже при концентрации пиклоксидин дигидрохлорида 250 мкг/мл, то есть в двухкратном разведении препарата пиклоксидин. Этот изолят выделен у пациента, получившего 20 и более интравитреальных инъекций и сопутствующих курсов антибиотикотерапии.

    Таким образом, в исследовании in vitro, где применялся микрометод серийных разведений, пиклоксидин дигидрохлорид показал высокую эффективность в подавлении роста стафилококков, E. coli и P. luteola, а также бактерицидную активность в отношении этих изолятов.

    В таблице 3 приведены усредненные показатели параметров роста по увеличению оптической плотности изолятов стафилококков без добавления пиклоксидина и с его добавлением в самой низкой концентрации (разведение 1:32). С целью выявления возможных различий в чувствительности к пиклоксидину антибиотикочувствительных и резистентных штаммов, особенно полирезистентных, КНС были сгруппированы согласно их уровню резистентности к антибиотикам. S.aureus составили одну группу, так как среди немногих изолятов S.aureus полирезистентные штаммы выявлены не были. Как видно из таблицы 3, группы стафилококков в процессе роста характеризуются близкими значениями средней оптической плотности. В результате проведенного анализа мы не обнаружили различий в бактерицидном действии пиклоксидина на полирезистентные изоляты по сравнению с антибиотикочувствительными или резистентными не более чем к двум препаратам, а также между КНС и S.aureus.

    Данные другого теста in vitro, в котором изучали инактивацию бактерий пиклоксидин дигидрохлоридом при временах воздействия антисептика до 1 ч, также свидетельствуют о высокой бактерицидной активности пиклоксидина. Инкубация в течение 15 мин с 500 мкг/мл или 60 минут с 31,25 мкг/мл пиклоксидин дигидрохлорида привела к полной потере КОЕ 10 грамположительных изолятов конъюнктивы, как чувствительных к антибиотикам, так и полирезистентных (4 S. epidermidis: 2 чувствительных к антибиотикам и 2 полирезистентных, 2 S. hominis: чувствительный и полирезистентный, S. caprae, S. haemolyticus и 2 S. aureus). Инкубация P. aeruginosa или E. coli (10 8 КОЕ/мл) непосредственно в антисептике (500 мкг/мл пиклоксидин дигидрохлорида) в течение 15 минут также приводила к полной потере КОЕ. Полученные данные подтверждают перспективность использования данного глазного антисептика для профилактики инфицирования конъюнктивы, в том числе при проведении ИВИ.

    Исследование ультраструктуры бактериальной клетки при воздействии антисептика пиклоксидин дигидрохлорида

    При воздействии 500 мкг/мл пиклоксидин дигидрохлорида в течение 15 мин у всех стафилококков, вне зависимости от уровня чувствительности к антибиотикам, наблюдали потерю правильной округлой формы, эффект слипания, а у капсулированных клеток - появление агрегатов на поверхности клеток в результате разрушения капсулы. При увеличении времени воздействия до 60 мин даже при снижении концентрации пиклоксидин дигидрохлорида в 16 раз в клеточных стенках наблюдали образование пор диаметром 12-23 нм (Рис. 3).

    У грамотрицательных антибиотикочувствительных E.coli при воздействии 500 мкг/мл пиклоксидин дигидрохлорида 15 мин или при 16-кратном разведении пиклоксидина дигидрохлорида 60 мин наблюдали образование пор в клеточных стенках размером 23-82 нм, разрывы клеточных стенок на полюсах клеток.

    Таким образом, по результатам данного исследования на 12 отличающихся по своей чувствительности к антибиотикам конъюнктивальных изолятов бактерий можно сделать вывод, что пиклоксидин дигидрохлорид обладает выраженным деструктивным действием на наружные структуры бактерий, клеточную стенку и капсулярные образования. Связи между морфологическими изменениями при воздействии пиклоксидина, их типом и степенью выраженности, с антибиотикорезистентностью исследованных изолятов выявлено не было. А увеличение клеточной проницаемости (при образовании пор), разрушение капсулы способствует проникновению препарата внутрь бактерии.

    Определение эффективности связывания пиклоксидина клетками антибиотикорезистентных и антибиотикочувствительных изолятов микрофлоры конъюнктивы методом измерения дзета-потенциала

    Клетки исследованных изолятов с конъюнктивы пациентов их разных групп в отсутствии пиклоксидина несли отрицательный поверхностный потенциал (дзета-потенциал) в диапазоне (-14,7)-(-36,1) мВ. В присутствии возрастающих концентраций пиклоксидина дигидрохлорида происходило уменьшение отрицательного дзета-потенциала бактерий, то есть сдвиг к нейтральным или слабоположительным значениям. Различий в эффективности нейтрализации пиклоксидином клеток бактерий исследованных антибиотикочувствительных и антибиотикорезистентных изолятов нами обнаружено не было (p=0,765 для критерия Краскала-Уоллиса между группами с разной антибитикорезистентностью). Полученные данные свидетельствуют об эффективном электростатическом связывании положительно заряженных молекул пиклоксидина с отрицательно-заряженными группами на поверхности клеточных стенок бактерий. Нами не выявлено значимых различий между изолятами S. epidermidis с различной резистентностью к антибиотикам в отношении эффективности связывания пиклоксидина.

    

Выводы:



    1. Впервые на репрезентативном клиническом материале (120 мазков с конъюнктивы глаз) на основе клинических, биофизических и морфологических исследований изучено влияние антибактериальной терапии на состав и свойства микрофлоры конъюнктивы при интравитреальных инъекциях.

    2. В микрофлоре конъюнктивы доминирующее положение занимают грамположительные бактерии (более 93%), среди которых основным видом является эпидермальный стафилококк (70,9%).

    3. У больных, которым предстояло проведение интравитреальных инъекций, выявлен высокий (33,3%) уровень полирезистентной микрофлоры конъюнктивы. Среди изолятов бактерий устойчивость к антибиотикам, применяемым в офтальмологической практике, составляла 11,1% к тетрациклину, 14,8% – к фторхинолонам и 18,5% – к аминогликозидам.

    4. У пациентов, получивших 20 и более интравитреальных инъекций и сопутствующих курсов антибиотикотерапии препаратами тобрамицин и неомицин+полимиксин b+дексаметазон наблюдается существенный рост устойчивости микрофлоры конъюнктивы к широкому спектр у антибиотиков, 75% изолятов проявляли полирезистентность. В 91% случаев выявлена резистентность изолятов стафилококков к аминогликозидам, гентамицину и тобрамицину.

    5. В группе пациентов, получивших однократный курс антибактериальной терапии с пиклоксидином за 3 дня до и в течение 5 дней после интравитреальной инъекции, роста микрофлоры после лечения не наблюдалось у 80% пациентов, что сравнимо с эффективностью аналогичного курса антибиотикотерапии с тобрамицином, после которого роста микрофлоры не наблюдалось у 90% пациентов.

    6. Клетки конъюнктивальных изолятов бактерий характеризуются отрицательным поверхностным потенциалом, который нейтрализуется пиклоксидин дигидрохлоридом, что свидетельствует об эффективном электростатическом связывании положительно заряженных молекул пиклоксидина с отрицательно-заряженными группами молекул клеточных стенок бактерий. Результаты электронно-микроскопического исследования показали, что пиклоксидин дигидрохлорид обладает выраженным деструктивным действием на капсулу и плазмолемму бактерий, что приводит к лизису и выходу внутриклеточного содержимого.

    7. Для конъюнктивальных изолятов стафилококков минимальная бактерицидная концентрация пиклоксидин дигидрохлорида составляла 31,25 мкг/мл, для E.coli – 62,5 мкг/мл, для P.aeruginosa - 500 мкг/мл.

    Различий в бактерицидных концентрациях, типе и степени проявления цитотоксического действия и эффективности нейтрализации пиклоксидином дзета-потенциала клеток антибиотико-чувствительных и антибиотико-резистентных штаммов не выявлено.

    

Практические рекомендации



    1. Всем пациентам, которым планируется проведение ИВИ, рекомендовано проведение бактериологического исследования содержимого конъюнктивального мешка для корректного подбора антимикробной терапии. При выявлении резистентности изолятов рекомендовано воздержание от назначения местных антибиотиков и применение антисептика пиклоксидина.

    2. Пиклоксидин целесообразно применять при повторяющихся курсах антибактериальной терапии, когда возникает риск выработки антибиотикорезистентности глазной микрофлоры.

    

Список работ, опубликованных по теме диссертации:



    1. Воронин Г.В., Будзинская М.В., Страховская М.Г., Халатян А.С. Резистентность к антибиотикам у пациентов на фоне многократных интравитреальных инъекций // Вестник Офтальмологии. – 2019. – №3. – С.109-112.

    2. Будзинская М.В., Страховская М.Г., Андреева И.В., Халатян А.С. Микрофлора конъюнктивы и ее чувствительность к антибиотикам после многократных интравитреальных инъекций // Вестник Офтальмологии. – 2019. – №5 (2). – С.135-141.

    3. Budzinskaya M.V., Khalatyan A.S., Strakhovskaya M.G., Zhukhovitsky V.G. Ocular flora in patients undergoing intravitreal injections: antibiotic resistance patterns and susceptibility to antiseptic picloxydine // International Journal of Ophthalmology. — 2020. — Vol. 13. — N. 1. – P.85-92.

    4. Будзинская М.В., Страховская М.Г., Халатян А.С. Вопросы антибиотикорезистентности у пациентов после многократных интравитреальных инъекций // Вопросы теоретической и клинической медицины. – 2018. – №2(21). – С.34-38.

    5. Халатян А.С., Будзинская М.В., Страховская М.Г., Андреева И.В. Антимикробные препараты местного действия для профилактики инфекционных осложнений интравитреальных инъекций // Точка зрения. Восток-Запад. – 2019. – №3. – С.75-78.

    6. Халатян А.С., Будзинская М.В., Холина Е.Г., Страховская М.Г., Шевлягина Н.В., Жуховицкий В.Г. Бактерицидное действие пиклоксидина на штаммы Staphylococcus epidermidis, выделенные с конъюнктивы на фоне интравитреальных инъекций // Современные технологии в офтальмологии. – 2019. – №1(26). – С.315-320.

    7. Yugay N.Y., Novikov N.I., Subbot S.A., Khalatyan A.S. Fast and easy visualization method of impression cytology probe with microbiota detection on the ocular surface // 26 th International Student Congress Of (bio) Medical Sciences. Book of Abstracts. – 2019. – P.412.

    

Список сокращений, используемых в работе:



    ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

    ИВИ – интравитреальная инъекция

    ИСМП – инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи

    КНС – коагулазонегативный стафилококк

    КОЕ – колониеобразующая единица

    МБК – минимальная бактерицидная концентрация

    МИК – минимальная ингибирующая концентрация

    мкг/мл – микрограмм на миллилитр

    МПК – минимальная подавляющая концентрация

    AAO (American Academy of Ophthalmology) – Американская ассоциация офтальмологов

    ARCANE (Antibiotic Resitance of Conjunctiva and Nasopharynx Evaluation) – исследование по определению воздействия местных антибиотиков на схемы устойчивости флоры конъюнктивы и носоглотки при повторном их применении

    BD Phoenix 100 – система для автоматической идентификации микроорганизмов и определения чувствительности к антибиотикам

    DRCR.net (The Diabetic Retinopathy Clinical Research Network) – сеть клинических исследований по диабетической ретинопатии

    ESCRS (European Society of Cataract and Refractive Surgeons) – Европейское общество катарактальных и рефракционных хирургов

    FEI Company USA – американская компания, специализирующаяся в области средств электронной микроскопии

    MDR (Multidrug resistance) – множественная лекарственная устойчивость

    PBS (Phosphate buffered saline) – натрий-фосфатный буфер (фосфатный буфер)

    SOS-система репарации ДНК – защитная система бактерий, которая активируется в ответ на повреждения ДНК

    SPI-Module Sputter Coater (SPI Supplies, США) – модуль для напыления электронопроводящего слоя золота, используется в электронной микроскопии

    TSB (Tryptic Soy Broth) – триптиказо-соевый бульон

    VEGF (Vascular endothelial growth factor) – фактор роста эндотелия сосудов

    VISION (VEGF Inhibition Study in Ocular Neovascularization) – Исследование по подавлению фактора роста эндотелия сосудов при глазной неоваскуляризации


Город: Москва
Дата добавления: 02.03.2020 16:05:58, Дата изменения: 10.03.2020 15:44:37