Онлайн доклады

Онлайн доклады

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

XIX Конгресс Российского глаукомного общества  «19+ Друзей Президента»

XIX Конгресс Российского глаукомного общества «19+ Друзей Президента»

Пироговский офтальмологический форум

Пироговский офтальмологический форум

Кератиты, язвы роговицы

Вебинар

Кератиты, язвы роговицы

Актуальные вопросы офтальмологии

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Сателлитный симпозиум

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Все видео...
Год
2020

Применение культивированных буккальных эпителиальных клеток в лечении лимбальной недостаточности (Экспериментальное исследование)


Органзации: В оригинале: ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации
    

    Научный руководитель: доктор медицинских наук, доцент Куликов Алексей Николаевич

    

    Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

    

Общая характеристика работы



    Актуальность темы исследования

     В настоящее время считается, что одной из главных причин формирования сосудистых бельм является гибель стволовых клеток (СК) роговичного эпителия вследствие различных патологических состояний глазной поверхности [Burman S., 2004].

    В соответствии с современными представлениями, базальные клетки эпителия роговичной части лимба являются олигопотентными стволовыми клетками эпителия роговичного фенотипа (в иностранной литературе: corneal epithelial stem cells) [Davenger M., Evensen A., 1971; Thoft R.A., 1983; Koizumi N. et al., 2001; Lavker R. et al., 2004]. Популяция этих клеток расположена в складках палисада (палисадах) Vogt, преимущественно в роговичной части лимба [Nakamura T.et al., 2016]. В связи с этим, такие клетки называют еще лимбальными эпителиальными стволовыми клетками (ЛЭСК) (в иностранной литературе: limbal epithelial stem cell – LESC) [Zhao Y., Ma, L., 2015] или лимбальными стволовыми клеткам (ЛСК) (в иностранной литературе: limbal stem cell – LSC) [Rama P. et al., 2010].

    Зона роговичного лимба также рассматривается как анатомический барьер для конъюнктивального эпителия, содержащего бокаловидные клетки и добавочные слезные железы, обеспечивающие формирование нормальной перикорнеальной пленки, которая способствует питанию эпителиальных клеток роговицы [Кашникова О.А., 2000]. На основе такой взаимосвязи эпителиев был предложен термин «Глазная поверхность» (в иностранной литературе: «ocular surface») [Thoft R.A., Friend J., 1977].

    Повреждение или полная гибель популяции ЛЭСК, а также нарушение их пролиферации считаются причиной развития патологического состояния, именуемого как «недостаточность лимбальных стволовых клеток», «синдром лимбальной недостаточности» или просто «лимбальная недостаточность» (ЛН) [Вит В.В., 2003; Черныш В.Ф., Бойко Э.В., Шишкин М.М., 2004; Ситник Г.В., 2005; Черныш В.Ф., Бойко Э.В., 2008; Бездетко П.А. с соавт., 2010], (в иностранной литературе : limbal stem cell deficiency – LSCD) [Dua H.S., 2000; Grueterlich M., et al., 2002; Nakamura T. et al., 2016].

    Клинически ЛН проявляется возникновением персистирующих и рецидивирующих эпителиальных дефектов роговицы, хроническим воспалением глазной поверхности, ведущим к конъюнктивализации роговицы с врастанием в строму новообразованных сосудов и формированием фиброваскулярного паннуса (сосудистого бельма) [Черныш В.Ф., Бойко Э.В., Шишкин М.М., 2004; Милюдин Е.С., 2006; Puangsricharern V., Tseng S.C.G., 1995; Dua H.S., 2000]. Все это приводит к значительному понижению остроты зрения пораженных глаз [Pfister R.R., 1994; Grueterich M. et al., 2003].

    В условиях тотальной ЛН восстановление прозрачности роговицы посредством традиционной кератопластики обречено на неудачу ввиду неизбежности рецидива фиброваскулярного паннуса и помутнения роговичного трансплантата [Черныш В.Ф., Бойко Э.В., 2008].

    Решение данной проблемы возможно только после восстановления нормального эпителиального покрова роговицы и анатомического барьера для конъюнктивального эпителия.

    В настоящее время в мире существует два подхода реконструктивной хирургии. Первый основан на пересадке лимбальных тканей, содержащих ЛЭСК (лимбальной трансплантации – ЛТ). При аутологичной лимбальной трансплантации ткань берется из парного неповрежденного глаза пациента. В случае же отсутствия источника аутологичной ткани используют аллогенный материал, забор которого осуществляется у живого донора или кадаверного источника. Второй подход представляется наиболее перспективным и основан на трансплантации культивированных эпителиальных СК. Технологии трансплантации культивированного лимбального эпителия (в иностранной литературе: cultured limbal epithelial transplantation – CLET) и эпителия слизистой полости рта (в иностранной литературе: cultivated oral mucosal epithelial transplantation – COMET) позволяют нарастить полноценный, в том числе и аутологичный, эпителиальный покров роговицы из биоптата размером около 1 х 1 мм. Это определяет перспективность методик COMET и CLET в лечении глаз пациентов с тотальным фиброваскулярным паннусом при тотальной ЛН. Однако в России данное направление только начинает развиваться. При этом в иностранной литературе информация о протоколах введения в культуру стволовых клеток эпителия полости рта (СКЭПР), конкретных методиках подготовки клеточных трансплантатов (на основе культивированных СКЭПР) и объеме необходимого хирургического пособия представлена крайне скудно, что не позволяет использовать их в клинике.

    Степень разработанности темы

    Первая классификация ЛТ была предложена в 1996 г. [Holland E.J., Schwarz G., 1996] и модернизирована в 2011 году [Daya S.M., et al., 2011].

    Одна из первых оптимальных хирургических методик реконструкции роговицы (аллогенная кератоэпителиопластика) была описана еще в 1984 году [Thoft R.A., 1984]. Она оказалась эффективной при лечении периферических роговичных язв, обеспечивая ткани эпителиоцитами роговичного фенотипа, что способствовало предотвращению конъюнктивализации. Однако аллогенность трансплантата определяла гистонесовместимость тканей донора и реципиента и не исключала рецидивов конъюнктивализации. В 1989 году впервые была выполнена успешная аутологичная ЛТ в клинике [Kenyon K.R., Tseng S.C., 1989]. Затем операция получила широкое признание и в настоящее время остается методом выбора при лечении односторонней ЛН. Однако, в случаях даже незначительного повреждения лимба парного глаза, забор трансплантатов связан с риском развития на глазудоноре ятрогенной ЛН, а при двустороннем поражении – невозможен.

    В 1997 году впервые была показана возможность трансплантации на пораженную глазную поверхность in vitro культивированных ЛЭСК [Pellegrini G., et al., 1997]. Технология трансплантации культивированного лимбального эпителия (в иностранной литературе: cultured limbal epithelial transplantation – CLET) обеспечивает забор минимального количества клеточного материала, не нанося сколько-нибудь значимого повреждения лимбальной зоны глаза-донора.

    В настоящее время аутологичная CLET считается эффективным способом лечения односторонней ЛН [Nakamura T., et al., 2004]. Она создает условия для длительного поддержания камбиального резерва роговицы, так как трансплантированные ЛЭСК в более чем 75% случаях сохраняют свою жизнеспособность в течение 10 лет [Rama P., et al., 2010]. Вместе с тем выполнение аутологичной CLET невозможно при тяжелой двусторонней ЛН, так как в таких условиях отсутствуют источники ЛЭСК.

    В свете «теории о филогенетически обусловленной регенерации» [Хлопин Н.Г., 1946; Заварзин А.А., 1986] альтернативным источником эпителиоцитов может служить слизистая оболочка полости рта (СОПР).

    Этот эпителий выстилает внутреннюю поверхность губ, щек, дна полости рта, альвеолярных отростков, оральной поверхности мягкого неба и вентральной поверхности языка. При этом, наиболее доступными для забора клеточно-тканевых биоптатов являются буккальный эпителий и эпителий губы.

    В нашей стране успешное применение СОПР для профилактики и лечения послеожоговых осложнений было показано еще в 1973 году [Даниличев В.Ф., 1973]. Однако использование биоптатов СОПР для выделения из них стволовых клеток и последующей их трансплантации на роговичную поверхность в условиях двусторонней ЛН, было предложено гораздо позже [Nakamura T. et al., 2003; Nishida K.et al., 2004; Nakamura T. et al., 2016]. При трансплантации культивированного аутологичного эпителия слизистой полости рта (в иностранной литературе: cultivated oral mucosal epithelial transplantation – COMET) лечебный эффект достигается благодаря восстановлению камбиального резерва роговицы за счет привнесенных стволовых клеток выстилающего эпителия полости рта (СКЭПР) и напрямую зависит от их количества.

    Таким образом, культивированные СКЭПР могут функционировать в качестве альтернативного источника эпителизации роговицы, а COMET может рассматриваться как вполне приемлемый метод реконструкции ее поверхности [Nakamura T. et al., 2016]. При этом, ввиду его аутологичности, отсутствует проблема гистосовместимости, что в свою очередь снижает риск послеоперационных осложнений. Однако, в литературе имеются также данные о частичном рецидиве фиброваскулярного паннуса после COMET, развивающемся в результате гибели трансплантированных культивированных аутологичных СКЭПР [Nakamura T., et al., 2007; Nakamura T. et al., 2016].

    При этом в России направление реконструктивной хирургии роговицы при помощи культивированных стволовых клеток буккального эпителия только начинает развиваться. Так в 2015 году был оптимизирован метод выделения и культивирования клеток буккального эпителия [Ченцова Е.В. с соавт., 2015], разработана комбинированная биоинженерная конструкция, содержащая в своем составе культивированный буккальный эпителий [Ченцова Е.В. с соавт., 2016], а также оценена эффективность ее трансплантации на роговицу при лечении глубоких эпителиально-стромальных дефектов [Егорова Н.С. с соавт., 2017].

    Вместе с тем вопрос использования биоптатов СОПР для выделения из них стволовых клеток и последующей их трансплантации на роговичную поверхность в условиях двусторонней ЛН в нашей стране до сих пор остается открытым. В этой связи недостаток информации о протоколах введения в культуру СКЭПР, конкретных методиках подготовки клеточных трансплантатов (на основе культивированных СКЭПР) и объеме необходимого хирургического пособия на сегодняшний день не позволяет использовать данную методику в клинике, и станет возможным только после экспериментальной ее апробации.

    Цель исследования

    Экспериментально определить возможность использования культивированных буккальных эпителиальных клеток для реконструкции роговичной поверхности в условиях тотальной лимбальной недостаточности путем их трансплантации на амниотической мембране.

    Задачи исследования

    1. Изучить морфологические особенности эпителизации роговицы в условиях тотальной лимбальной недостаточности на лабораторных животных.

    2. Сравнить эффективность трех способов забора биоптатов слизистой оболочки полости рта для выделения и дальнейшего культивирования низкодифференцированных буккальных клеток.

    3. Изучить морфологические особенности эпителизации роговицы в условиях тотальной лимбальной недостаточности после устранения фиброваскулярного паннуса путем трансплантации культивированных буккальных эпителиальных клеток на амниотической мембране.

    Научная новизна

    1. Экспериментально показано, что патологическая эпителизация роговицы в условиях тотальной лимбальной недостаточности идет по заместительному типу и за счет конъюнктивального эпителия.

    2. Разработан способ забора биоптатов слизистой оболочки полости рта для выделения низкодифференцированных буккальных клеток.

    3. Разработана методика устранения экспериментальной лимбальной недостаточности посредством клеточно-тканевого трансплантата на основе деэпителизированной амниотической мембраны с культивированными буккальными эпителиальными клетками в условиях тотальной лимбальной недостаточности.

    4. Экспериментально показано, что после устранения экспериментальной лимбальной недостаточности по разработанной методике операции наблюдается отсутствие рецидива фиброваскулярного паннуса и сохранение прозрачности роговицы в течение 90 суток.

    Теоретическая и практическая значимость работы

    1. Изучены морфологические особенности эпителизации роговицы в условиях экспериментальной тотальной лимбальной недостаточности.

    2. Определен эффективный для выделения низкодифференцированных буккальных клеток способ забора биоптатов слизистой оболочки полости рта.

    3. Разработана методика реконструктивной хирургии роговичной поверхности в условиях тотальной лимбальной недостаточности с использованием клеточно-тканевого трансплантата на основе деэпителизированной амниотической мембраны с культивированными буккальными эпителиальными клетками.

    4. Изучены морфологические особенности эпителизации роговицы в условиях тотальной лимбальной недостаточности после реконструкции роговичной поверхности по разработанной методике операции, а также после ее покрытия деэпителизированной амниотической мембраной без культивированных стволовых клеток.

    Методология исследования

    Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного открытого экспериментального исследования с использованием клинических, инструментальных, аналитических и статистических методов.

    Положения, выносимые на защиту

    1. Фиброваскулярный паннус при тотальной лимбальной недостаточности является проявлением патологической регенерации заместительного типа, механизмы которой активируются ввиду невозможности завершения эпителизации по репаративному пути.

    2. Забор слизистой оболочки полости рта способом «эпителиально-тканевых биоптатов» является, среди исследуемых, единственным эффективным для выделения и дальнейшего культивирования низкодифференцированных буккальных эпителиальных клеток. При этом для выделения данных клеток возможно применять методики как «ферментативной дезагрегации», так и «эксплантов».

    3. Клеточно-тканевой трансплантат с культивированными буккальными эпителиальными клетками на основе деэпителизированной амниотической мембраны, фиксированный к роговичной поверхности «клетками вверх», при тотальной лимбальной недостаточности обеспечивает эффективную эпителизацию роговицы, обладает способностью к интеграции в строму роговицы и несет на своей поверхности монослой культивированных стволовых клеток.

    Реализация и внедрение полученных результатов работы

    Полученные в диссертационном исследовании результаты используются в научной, учебной и лечебной работе кафедры и клиники офтальмологии ВМедА имени С.М. Кирова. Апробация и публикация материалов исследования

    Результаты работы доложены на: Научно-практической конференции с международным участием «X Российский общенациональный офтальмологический форум» (Москва, 2017 г.), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2017 г.), XIV Всероссийской юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения» (Москва, 2017 г.), Юбилейной научнопрактической конференции «Общая и военная офтальмология», посвященной 200-летнему юбилею основания кафедры офтальмологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2018 г.), Научно-практической конференции с международным участием «XI Российский общенациональный офтальмологический форум» (Москва, 2018 г.), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2018 г.), XV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения» (Москва, 2018 г.), Международной конференции «StemCellBio-2018: фундаментальная наука как основа трансляционной медицины» (Санкт-Петербург, 2018 г.), VI Молодежной конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2018 г.), XXII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2018 г.), ХХХ Юбилейной всероссийской научнопрактической конференции «Оренбургской Конференции Офтальмологов», посвященной 30- летию Оренбургского филиала МНТК Микрохирургия глаза (Оренбург, 2019 г.), 37-м Конгрессе европейской ассоциации рефракционных и катарактальных хирургов (ESCRS) (Париж, 2019 г.), Международном военно-техническом форуме «АРМИЯ-2019» (Москва, 2019 г.), XXIII Международной выставке средств обеспечения безопасности государства «Интерполитех-2019» (Анапа, 2019 г.), IV Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2019 г.).

    Публикации

    По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, 5 из них – в печатных изданиях, рецензируемых ВАК, 1 – в журнале, входящем в базу данных Scopus. Оформлено 15 рационализаторских предложений. Получено 2 патента на изобретение. Один из патентов (RU № 2680471) вошел в список 100 лучших изобретений России за 2019 год и первое полугодие 2020 года. Оба патента на изобретения входят в «Технологию реконструкции глазной поверхности после тяжелых боевых поражений глаз», отмеченную серебряной медалью решением Международного Жюри на XXIII Московском международном Салоне изобретений и инновационных технологий «АРХИМЕД 2020».

    Личный вклад автора в проведённое исследование

    Автор лично участвовал на всём протяжении выполнения диссертационной работы, включая формирование основной идеи исследования, разработку дизайна и методов его проведения. Соискателем самостоятельно проведены анализ текущей литературы, организованы и выполнены экспериментальные исследования in vivo, подготовка материалов к текущим публикациям и написание самой диссертации. Автор принял непосредственное участие в экспериментальных исследованиях in vitro. Автором освоены методики, применяемые для получения и оценки результатов, выполнен анализ и описание результатов, полученных в ходе исследовании, сформулированы выводы, практические рекомендации и основные положения, выносимые на защиту.

    Структура и объем диссертации

    Материалы исследования изложены на 146 страницах машинописного текста, иллюстрированы 10 таблицами и 66 рисунками. Диссертация состоит из введения, пяти глав (обзора литературы, описания материала и методов исследований, трех глав собственных исследований), выводов, заключения, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 184 источника (58 русскоязычных и 126 зарубежных).

    Материал и методы

     Работа выполнена на 52 кроликах (104 глаза). На реализацию эксперимента получено разрешение Комитета по вопросам этики при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (протокол № 212 от 25 сентября 2018 года).

    В I серии экспериментов оценивали морфологические особенности регенерации эпителия роговицы после тотального механического удаления лимбальных тканей и деэпителизации – 1-я (основная) группа, а также заживления интактной роговицы только после тотальной ее деэпителизации – 2-я (контрольная) группа.

    Биомикроскопическое исследование роговицы глаз экспериментальных животных выполняли сразу после операции, а также на 1, 7, 15, 30, 60 и 90-е сутки после операции на операционном микроскопе «МХ-ОФ 3» (ЛОМО, Россия) при увеличении 10× и 16×. Для документации и анализа полученных результатов проводили фоторегистрацию.

    Для количественной оценки площади деэпителизации, а также хода ее эпителизации в процентах использовали проекционную сетку с 385 ячейками (одна ячейка ≈ 0,26 %) [Сухинин М.В., 2010]. Сетку помещали на цифровой фотоснимок во фронтальной проекции роговицы и по сумме площади ячеек, прокрашиваемых флюоресцеином, судили о площади деэпителизации роговицы. Интенсивность помутнения роговицы оценивалась по 10-бальной шкале ВойноЯсенецкого В.В.: 1-2 – прозрачная, 3 – почти прозрачная, 4-5 – полупрозрачная, 6-10 – мутная [Войно-Ясенецкий В.В., 1979]. Степень неоваскуляризации роговицы оценивалась по 4-х бальной шкале в зависимости от длины новообразованных сосудов в баллах: 0 – отсутствие сосудов, 1 – до 2 мм, 2 – до 4 мм, 3 – до 6 мм [Inatomi T., et al., 2006].

    Морфологическое исследование проводилось на базе патологоанатомического отделения Федерального государственного бюджетного учреждения Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.Н. Никифорова МЧС России под руководством кандидата медицинских наук, врача-патологоанатома И.А. Самусенко. Для изучения морфологических особенностей патогенеза экспериментальной ЛН было выполнено гистологическое исследование глаз кроликов 1-й (основной) группы – в сравнении с интактными глазами экспериментальных животных.

    Для прижизненного определения фенотипа покрывающего роговицу эпителия на 30 сутки после операции было выполнено цитологическое исследование, посредством импрессионной цитологии (ИЦ) во всех группах I и III серии экспериментов (в сериях in vivo).

    Для прижизненного контроля регенерации роговицы использовали оптический когерентный томограф «3D OCT 2000» (Topcon, Япония) во всех группах I серии экспериментов сразу после моделирования ЛН и на 30 сутки после операции.

    Во II серии экспериментов сравнивали эффективность трех способов забора биоптатов СОПР для выделения и дальнейшего культивирования низкодифференцированных буккальных эпителиальных клеток. Для этого забор СОПР осуществляли способами «скарификации эпителия» (1-я группа), «эпителиальных лоскутов» (2-я группа), «эпителиально-тканевых биоптатов» (3-я группа).

    Забор всех биоптатов СОПР кроликов выполняли с верхней губы после предварительной обработки СОПР 70% раствором этилового спирта. Далее материал транспортировали в Центр клеточных технологий ИНЦ РАН. Количество заборов определялось исходя из эффективности конкретного способа, исходя из возможности получения низкодифференцированных клеток.

    Для выделения СКЭПР из биоптатов СОПР использовали две методики: миграционная (эксплантов) (по 5 выделений в 1-й и 2-й группах, 50 выделений в 3-й группе) и ферментативной дезагрегации (по 5 выделений в 1-й и 2-й группах, 50 выделений в 3-й группе). Таким образом в настоящей серии было сформировано 6 подгрупп.

    Прижизненное наблюдение за морфологическим состоянием и пролиферативной активностью клеток осуществляли при помощи инвертированного микроскопа «Eclipse TS100» (Nikon, Япония). Культивирование клеток проводили в питательной среде «KSFM» или «DMEMF12-KSFM» (Gibco, США), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку при 37°С в атмосфере 5% СО2. Идентификацию популяции культивируемых клеток осуществляли методом непрямой иммунофлуоресценции, используя антитела против стволовых маркеров (ABCB5, ABCG2, ALDH3A1) и маркеров эпителиальной дифференцировки (цитокератины 3/12, 14, 15).

    Забор амниотической оболочки выполняли в стерильных условиях операционной после планового кесарева сечения. Полученную АМ механически фиксировали в расправленном состоянии по предложенному нами способу – патент на изобретение № RU 2680471 от 06.06.2018 г. Для деэпителизации АМ использовали метод «ферментативной деэпителизации» путем обработки 0,25 % раствором «Trypsin-EDTA» (Invitrogen, США).

    Культивирование СКЭПР выполняли только на эпителиальной стороне АМ.

    Трансплантацию культивированных на АМ СКЭПР на глазную поверхность выполняли после иссечения фиброваскулярного паннуса роговицы путем поверхностной кератэктомии.

    В III серии экспериментов всем животным предварительно была смоделирована тотальная ЛН путем механического удаления роговично-конъюнктивального лоскута в виде ленты толщиной около 0,2 мм и шириной 4,0 мм и деэпителизации роговицы. Спустя 30 суток после операции развивался тотальный фиброваскулярный паннус. Далее оценивали морфологические особенности регенерации эпителия роговицы после иссечения тотального фиброваскулярного паннуса и трансплантации деэпителизированной амниотической мембраны с культивированными буккальными эпителиальными клетками. Для этого было сформировано 3 экспериментальные группы:

    В 1-ой основной группе экспериментальным животным выполняли иссечение фиброваскулярного паннуса и подшивание клеточно-тканевых трансплантатов с культивированными СКЭПР, ориентированных клетками вниз. Во 2-ой основной группе иссекали фиброваскулярный паннус и подшивали клеточно-тканевые трансплантаты с культивированными СКЭПР, но ориентированные клетками вверх. В 3-й (контрольной) группе выполняли иссечение фиброваскулярного паннуса и подшивание деэпителизированной АМ без культивированных СКЭПР.

    Биомикроскопическое исследование, фоторегистрацию, оценку площади деэпителизации, интенсивность помутнения и степень неоваскуляризации роговицы, а также морфологическое и цитологическое исследование выполнялось аналогично I серии.

    Статистическую обработку полученных данных проводили методами вариационной статистики при помощи программы Microsoft Exel 2016. Количественные показатели представлены в виде M ± m, где M – среднеарифметическое значение, а m – стандартная средняя ошибка. Оценку различий между выборками проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Критический уровень значимости был принят p < 0,05.

    Оценка значимости различия величин критериев с законом распределения, отличным от нормального, проведена с помощью непараметрических методов Манна-Уитни и КраскелаУоллиса. Выбор методов позволял проводить статистический анализ данных в группах с малым количеством наблюдений (малый объем выборок). Статистическая обработка и анализ первичных данных проводилась с помощью программы «Statistica version 10» (StatSoft, Inc. 2011).

    

Результаты исследований



     I серия: сравнение морфологических особенностей регенерации эпителия роговицы после тотального механического удаления лимбальных тканей и деэпителизации – 1-я (основная) группа, а также заживления интактной роговицы только после тотальной ее деэпителизации – 2-я (контрольная) группа.

    После операции в обеих группах наблюдали нормальную прозрачность роговиц – 1±0 балл и тотальная их деэпителизация – 100±0 %.

    Начиная уже с 7-х суток эксперимента наблюдались статистически значимые различия в динамике заживления исследуемых роговиц по всем трем критериям сравнения (прозрачность, васкуляризация и эпителизация). Прозрачность роговиц в 1-й группе была хуже – 4,5±0,85 баллов, по сравнению со 2-й – 3,3±0,82 балла (p < 0,05). При этом неоваскуляризация роговиц кроликов 1-й группы протекала активнее – 1,5±0,53 баллов, чем во 2-й группе – 0 баллов (p < 0,05), где интенсивнее сокращалась область деэпителизированной роговицы (1-я группа - 85,0±4,0%, 2-я группа – 50,0±2,0 % (p < 0,05)).

    На 15-е сутки эксперимента в 1-й (основной) группе регистрировали выраженное понижение прозрачности роговицы за счет ее отека (9,0±0,82 баллов), что резко отличалось от 2- й (контрольной) группы, где роговица сохраняла свою прозрачность – 1,5±0,52 балла (p < 0,05).

    Ранее намеченную тенденцию сохраняла и динамика неоваскуляризации роговицы (1-я группа – 3,1±0,57 баллов, 2-я группа – 1±0 балл (p < 0,05)). При этом в 1-й группе область деэпителизации при этом занимала 38,0±3%, а во 2-й – 2,0±1,0% (p < 0,05).

    К 30-м суткам после операции в 1-й группе усилился отек роговицы, прозрачность роговицы ухудшилась (10,0±0 баллов), во 2-й группе роговица оставалась прозрачной – 1,0±0 балла (p < 0,05). При этом определялась массивная неоваскуляризация всей поверхности роговицы – 4,0±0 балла, что в сравнении со 2-й группой – 1±0 балл определяло статистически значимое различие по данному критерию (p < 0,05). Область деэпителизации не определялась в обоих группах (0%).

    По данным оптической когерентной томографии, в 1-й группе на 30-е сутки развития экспериментальной ЛН в оптической зоне наблюдался выраженный отек роговичной ткани (до 1034 мкм), а в области лимба – «наползание» на роговицу прозрачной конъюнктивы и оптически плотной субконъюнктивальной ткани толщиной до 242 мкм.

    На 60-е и 90-е сутки эксперимента в 1-й (основной) группе наблюдали развитие грубого фиброваскулярного паннуса. Прозрачность роговицы также, как и на 30-е сутки оценивалась в 10,0±0 баллов, а неоваскуляризация присутствовала на всей поверхности (4,0±0 балла). Вместе с тем область деэпителизации не определялась 0 %. Вместе с тем биомикроскопическая картина глазной поверхности кроликов во 2-й (контрольной) группе не отличалась от зарегистрированной на 30-е сутки.

    По данным импрессионной цитологии, выполненной на 90-е сутки, в 1-й группе исследуемые роговицы покрывал эпителий конъюнктивального фенотипа, характеризующийся наличием в нем бокаловидных клеток, окрашивающихся в синий цвет, во 2-й эпителий, не содержащий бокаловидные клетки, что характеризовало его как роговичный. Статистический анализ, полученных в настоящем эксперименте данных, представлен на рисунках 2-4.

     Таким образом, экспериментальная ЛН развивалась только на глазах животных основной группы, а заживление роговицы после нанесенного повреждения сопровождалось ее помутнением и появлением персистирующей эрозии. При этом эпителизация была возможна только по мере распространения новообразованных сосудов к области эрозии.

    По гистологическим данным спустя уже несколько часов после моделирования экспериментальной ЛН в лимбальных тканях регистрировалось начало воспалительного ответа тканей на нанесенное повреждение, которое в процессе развития фиброваскулярного паннуса усиливалось и сопровождалось нарастанием на роговицу «молодой» грануляционной ткани с последующей ее трансформацией в «зрелую» соединительную (рубцовую) ткань. При этом на разные сроки прослеживалась взаимосвязь между количеством сосудов в роговице и состоянием эпителиального покрова роговицы глаз кроликов, оцененным при биомикроскопии.

    Активизация эпителизации роговицы наблюдалась к 15-м суткам развития ЛН, в то время как гистологически в это время определялось увеличение сосудов капиллярного типа. Кроме того, гистологически было отмечено начало появления нейтрофильной лейкоцитарной инфильтрации стромы роговицы, которая, как известно, сопровождается повышением редоксстатуса, что в свою очередь является причиной вторичной альтерации (посредством высвобождающихся протеолитических ферментов и кислородных радикалов) при развитии патологического процесса в роговице. Поэтому, к 30-м суткам эксперимента в роговице гистологически отмечалось выраженное усиление гистиоцитарной, лимфоцитарной и нейтрофильной лейкоцитарной инфильтрации, что является показателем усиления воспалительной реакции в тканях. Вместе с тем резкое увеличение количества сосудов капиллярного типа в сочетании с образованием субэпителиальной грануляционной ткани являются проявлением процесса заместительной регенерации роговицы, которая к 2-му месяцу способствовала купированию воспаления и замещению грануляций на зрелую соединительную ткань с резким снижением количества сосудов капиллярного типа.

    Таким образом, патогенез экспериментальной ЛН по гистологическим данным опосредован формированием в роговице грануляционной, а затем «зрелой» соединительной ткани, воспалительной реакцией, ангиогенезом и пролиферацией многослойного цилиндрического эпителия конъюнктивы с бокаловидными клетками и замещения им дефекта многослойного плоского неороговевающего эпителия роговицы.

    II серия: сравнение эффективности трех способов забора биоптатов СОПР.

    Выявлено, что из биоптатов СОПР кроликов, во всех группах выделение клеток возможно, как по методике ферментативной дезагрегации, так и эксплантов (миграционной). Однако в первых двух группах, где забор осуществляли путем скарификации эпителия (1-я группа) и забора эпителиального лоскута СОПР (2-я группа) выделялись только высокодифференцированные клетки, которые не прикреплялись к поверхности культурального сосуда и удалялись при смене питательной среды.

    В 3-й группе (забор «эпителиально-тканевых биоптатов») при выделении клеток СОПР по методике ферментативной дезагрегации и эксплантов (миграционной), наряду с высокодифференцированными клетками, выделялись и низкодифференцированные, которые хорошо адгезировали на поверхность культуральной посуды и создавали множественные колонии, которые в процессе культивирования сливались с образованием плотного монослоя к 7-м суткам. Большое количество высокодифференцированных клеток к поверхности культурального сосуда не прикреплялись и удалялись при смене питательной среды.

    До 1-го пассажа при выделении клеток по обеим методикам (эксплантатов и ферментативной дезагрегации ткани) популяция была представлена как эпителиоподобными, так и веретенообразными клетками. Однако уже после 2-го пассажа в популяции преобладали только клетки с веретенообразной формой. Культивированные клетки, выделенные из эпителиальнотканевых биоптатов СОПР кролика, позитивно окрашивались антителами против стволовых маркеров ABCB5, ABCG2, ALDH3A1 и цитокератинов 3/12 и 15. Негативное окрашивание было выявлено на цитокератины 5, 14, 19. В следовых количествах определялось также окрашивание на маркер Integrinβ1.

    Исходя из полученных результатов следует, что оптимальным из исследуемых способом забора СОПР с целью дальнейшего выделения из них СКЭПР является забор эпителиальнотканевых биоптатов (3-я группа). Это связано с тем, что ткани забираются вместе с эпителиальными гребешками, в которых содержится пролиферативный пул буккального эпителия (низкодифференцированные клетки). При этом для получения популяции СКЭПР возможно использовать методики как ферментативной дезагрегации, так и эксплантов, позволяющие в короткие сроки получить конфлюэнтный монослой низкодифференцированных клеток, которые по данным иммуноцитохимии характеризуется как СКЭПР (Рисунок 5).

    III серия: сравнительная оценка морфологических особенностей регенерации эпителия роговицы при устранении экспериментальной лимбальной недостаточности путем подшивания клеточно-тканевых трансплантатов с культивированными буккальными эпителиальными клетками, ориентированных клетками вниз (1-я группа), ориентированных клетками вверх (2-я группа), а также деэпителизированной амниотической мембраны (3-я группа).

     Биомикроскопия. После операции во всех группах статистически достоверно восстанавливалась прозрачность роговиц – до 1,6±0,51 баллов в 1-й группе, до 1,5±0,52 баллов во 2-й группе и до 1,5±0,52 баллов в 3-й группе по сравнению с показателями прозрачности до иссечения фиброваскулярного паннуса – 10,0±0 баллов (p < 0,05).

    К 7-м суткам эксперимента во всех группах выявлен частичный лизис клеточно-тканевого трансплантата, что в разной степени отрицательно сказывалось на прозрачности исследуемых роговиц. При этом худшие результаты регистрировались во 2-й (6,5±1,08 баллов) и 3-й (5,9±0,73 баллов) группах по сравнению с 1-й группой – 3,8±0,63 балла (p < 0,05). При этом показатели васкуляризации роговиц были почти идентичны во всех группах – 1,3±0,48 баллов в 1-й группе, 1,0±0,31 балла во 2-й группе и 0,7±0,82 балла в 3-й группе. Вместе с тем эпителизация исследуемых роговиц у кроликов 2-й группы (область деэпителизации 2,0±0,5 %) статистически достоверно (p < 0,05) была активнее по сравнению с 1-й (область деэпителизации 58,0±2,0%) и 3- й (область деэпителизации 48,0±2,0%) группами.

    К 15-м суткам эксперимента прозрачность роговиц во 2-й группе (4,3±0,67 баллов) оказалась наилучшей (p < 0,05) по сравнению с 1-й (7,1±0,74 балла) и 3-й (7,8±0,78 баллов) группами. Статистически значимой была также и меньшая выраженность васкуляризации роговиц во 2-й группе (2,0±0,0 балла) по сравнению с 1-й (3,0±0,47 баллов) и 3-й (2,8±0,91 балл) группами (p < 0,05). Наилучшие показатели эпителизации (p < 0,05) также регистрировались во 2-й (область деэпителизации не определялась – 0 %) и 3-й (область деэпителизации 2,0±0,2%) группах по сравнению с 1-й группой (область деэпителизации 11,0±0,8%).

    К 30-м суткам эксперимента прозрачность роговиц во всех группах повысилась, при этом во 2-й группе (3,8±0,42 балла) она так же оставалась наилучшей (p < 0,05) по сравнению с 1-й (5,4±0,52 балла) и 3-й (5,8±0,78 баллов) группами. Статистически значимой оставалась и меньшая выраженность васкуляризации роговиц во 2-й группе (2,4±0,51 балл) по сравнению с 1-й (4,0±0,0 балла) и 3-й (4,0±0,0 балла) группами (p < 0,05). Вместе с тем показатели эпителизации роговиц во 2-й группе статистически значимо (p < 0,05) ухудшились (область деэпителизации 18,0±2,0%) по сравнению с 1-й и 3-й группой, где эпителизация была полной (область деэпителизации 0 %).

    На 60-е сутки эксперимента регистрировали повышение прозрачности роговиц во всех группах, при этом во 2-й группе (2,8±0,42 балла) она так же оставалась наилучшей (p < 0,05) по сравнению с 1-й (5,0±0,0 балла) и 3-й (5,0±0,47 баллов) группами. Наименьшая выраженность васкуляризации роговиц регистрировалась во 2-й группе (2,3±0,48 баллов) по сравнению с 1-й (4,0±0,0 балла) и 3-й (4,0±0,0 балла) группами (p < 0,05). При этом во всех группах роговицы были полностью эпителизированы (область деэпителизации не определялась – 0%).

    На 90-е сутки эксперимента в 1-й и 3-й группах в биомикроскопической картине глазной поверхности какая-либо динамика не регистрировались. Во 2-й группе выявили повышение прозрачности роговицы по периферии и в оптической области до 1,6±0,51 балла, а также резкое уменьшением калибра сосудов на фоне стабильной динамики относительно показателей интенсивности васкуляризации (2,3±0,48 баллов). При этом во всех группах роговицы были полностью эпителизированы (область деэпителизации не определялась – 0%) (Рисунок 6). Статистический анализ полученных данных представлен на рисунках 7-9.

    Импрессионная цитология. Исследование показало, что в 1-й (основной) и 3-й (контрольной) группах роговицу покрывал эпителий конъюнктивального фенотипа, характеризующийся наличием в нем бокаловидных клеток, окрашивающихся в синий цвет. Во 2-й (основной) группе определялся эпителий, не содержащий бокаловидные клетки.

    Морфологически клетки, определяемые посредством ИЦ, имели выраженное сходство с популяциями клеток, выделяемыми из эпителиально-тканевых биоптатов СОПР.

    Гистология. Регенерация исследуемых роговиц по гистологическим данным в различные сроки характеризовалась репаративными процессами, затрагивающими трансформацию сосудистого русла области лимба: сосуды венозного типа замещались сосудами капиллярного типа, сформированной грануляционной или зрелой соединительной тканью. При этом в различные сроки регенерация характеризовалась формированием грануляционной и соединительной ткани, различной степенью воспалительной реакции и ангиогенезом.

    По гистологическим данным в различные сроки регенерация характеризовалась пролиферацией многослойного цилиндрического эпителия конъюнктивы с бокаловидными клетками в 1-й (основной) и 3-й (контрольной) группах (Рисунок 10 А) и многослойным плоским неороговевающим эпителием роговицы (без бокаловидных клеток) во 2-й (основной) группе с замещением ими эпителиального дефекта (Рисунок 10 Б).

    Заключение

    Как известно, независимо от этиологии того или иного патологического процесса, ответная реакция тканей роговицы однотипна и выражается во взаимосвязанном протекании трех основных фаз воспаления: альтерации (повреждение), экссудации (нарушение микроциркуляции) и пролиферации (начало восстановления поврежденных тканей). При этом снижение зрительных функций в исходе различных патологических процессов в роговице находится в прямой зависимости от интенсивности образовавшихся помутнений, степень которых определяется выраженностью воспалительной реакции и характером регенерации тканей.

    Гисто- и органотипическое восстановление роговицы во многом связано с регенераторным потенциалом ее многослойного плоского эпителия. Именно он обеспечивает заживление роговицы не только при поверхностных ее деэпителизациях, но и при более глубоких повреждениях.

    В свою очередь, рассматривая механизмы регенерации роговицы необходимо отметить, что классическая патофизиология выделяет физиологическую и патологическую регенерацию тканей организма человека. Физиологическая регенерация направлена на постоянное обновление и поддержание их целостности. Патологическая обеспечивает восстановление при повреждении.

    К видам такого восстановления относится репаративная регенерация (при которой полностью восстанавливается структура и функция поврежденных тканей) и заместительная (при которой полное восстановление структуры и функции невозможно, а дефекты замещаются клеточными элементами, гистоморфологически не характерными для данной ткани).

    По результатам исследования выяснено, что экспериментальная ЛН развивалась только на глазах животных 1-й (основной) группы, где выполняли тотальную механическую резекцию лимбальных тканей, деэпителизацию и перитомию конъюнктивы. При этом заживление роговицы после нанесенного повреждения сопровождалось ее помутнением и появлением персистирующей эрозии. Кроме того, эпителизация завершалась только тогда, когда новообразованные сосуды достигали области эрозии. Во 2-й (контрольной) группе заживление поврежденной роговицы шло по пути репарации ее эпителия без формирования помутнения стромы.

    По гистологическим данным, полученным в I серии экспериментов, спустя уже несколько часов после операции в 1-й (основной) группе в лимбальных тканях регистрировалось начало воспалительного ответа тканей на нанесенное повреждение, который в процессе развития фиброваскулярного паннуса усиливался и сопровождался нарастанием на роговицу «молодой» грануляционной ткани с последующей ее трансформацией в «зрелую» соединительную (рубцовую) ткань.

    Трансформация сосудистого русла при этом шла по пути уменьшения количества сосудов венозного и замещения сосудами капиллярного типа в лимбальной области. При этом на разные сроки прослеживалась взаимосвязь между количеством сосудов в роговице и состоянием ее эпителиального покрова, оцененным при биомикроскопии глаз кроликов.

    Так, активизация эпителизации роговицы наблюдалась к 15-м суткам развития ЛН, в то время как гистологически в это время определялось увеличение сосудов капиллярного типа. Кроме того, гистологически было отмечено начало появления нейтрофильной лейкоцитарной инфильтрации стромы роговицы.

    Эти наблюдения объясняются с позиций классических патофизиологических подходов к рассмотрению гистохимического ответа организма человека на нанесенное повреждение.

    Как говорилось ранее, ответная реакция тканей человека на нанесенное повреждение выражается во взаимосвязанном протекании трех основных фаз воспаления, а любое воспаление неразрывно связано с активацией ферментных систем протеолиза. Основным депо протеаз роговицы является ее эпителий, а значит при его повреждении их источником становятся и элементы воспалительного инфильтрата. В ответ на разрушение эпителия роговицы или других ее клеточных элементов происходит высвобождение коллагеназ и иных литических ферментов, что в итоге приводит к деструкции роговичного коллагена. В литературе имеются также данные о том, что коллагеназы могут инициировать деструкцию коллагена, в результате чего образуются продукты, которые легко денатурируются и становятся более чувствительными к протеазам. Таким образом, эпителий роговицы, с одной стороны, играет важную роль в регенерации, но при его разрушении, с другой стороны, запускается вторичный механизм деструкции роговичного коллагена, что препятствует заживлению.

    Как известно, высвобождающийся в результате воспаления, фактор некроза опухоли (ФНО α) активизирует миграцию эпителиоцитов к деэпителизированному участку, одновременно блокируя их пролиферацию. Этот механизм рассматривается как защитная реакция, направленная на ускорение реэпителизации роговицы.

    Подтверждением этому служит описанное многими авторами длительное сохранение эпителиальных дефектов при стромальных язвах, а также повреждение роговицы в условиях персистирующей эрозии у кроликов в 1 (основной) группы I серии экспериментов, выполненных в рамках настоящей диссертационной работы.

    Вместе с тем высвобождающееся большое количество протеаз способны активировать систему комплемента и цитокины, такие как IL-6, IL-8 и фактор некроза опухоли и т.д. При этом каждая реакция сопровождается образованием катализатора для последующего этапа активации комплемента, что способствует быстрому и многократному усилению иммунного ответа в поврежденных тканях. При этом самой многочисленной популяцией клеток иммунофагоцитарной системы являются нейтрофильные лейкоциты, а за их активацию и миграцию в очаг воспаления отвечают именно белки системы комплемента и цитокины. Все это объясняет появление нейтрофильной лейкоцитарной инфильтрации стромы кроликов 1 (основной) группы на 15-х сутках развития лимбальной недостаточности.

    В свою очередь, нейтрофилы неразрывно рассматривают с процессами воспалительной реакции, а их активация радикально меняет метаболизм нейтрофильного лейкоцита, так как потребление им глюкозы увеличивается в 30 раз. Это сопровождается усилением образования кислородных радикалов (повышением редокс-статуса), способных разорвать любую С-Н или С-С связь, неизбежно повреждая близлежащие ткани.

    Подтверждением протекания этого процесса в роговице глаза являются результаты многих экспериментальных исследований показывающих, что при заживлении ранений роговицы в регенерируемой ткани происходит накопление гликогена.

    Таким образом, в ответ на нанесенное повреждение тканей (первичная альтерация), высвобождающиеся протеолитические ферменты и кислородные радикалы являются причиной вторичной альтерации.

    В этой связи у кроликов 1 (основной) группы к 30 суткам эксперимента в роговице гистологически отмечалось выраженное усиление гистиоцитарной, лимфоцитарной и нейтрофильной лейкоцитарной инфильтрации, что является показателем усиления воспалительной реакции в тканях.

    Однако, несмотря на стремительно повышающуюся в очаге воспаления концентрацию протеолитических ферментов, в роговице неизбежно запускается процесс регенерации, так как именно протеазы активируют кератоциты стромы.

    Вместе с тем известно, что находящиеся в сыворотке крови α1-антит-рипсин и α2- макроглобулин ингибируют трипсин, коллагеназы и другие протеазы. Таким образом, прекращается дальнейшее разрушение поврежденной в организме ткани. Поэтому в офтальмологии при лечении заболеваний роговицы ранее с успехом применялись ингибиторы коллагеназ, такие как цистеин, дитиотрентол, пеницилиамин и этилендиаминтетраацетат (ЭДТА).

    Так как ингибиторы протеолитических ферментов содержатся в сыворотке крови, то в очаг поражения, на наш взгляд, они могут попадать посредством нескольких путей. Во-первых, посредством сосудов краевой петлистой сети в результате диффузии их через строму роговицы, а во-вторых, по новообразованным сосудам. Вместе с тем мы не исключаем существование еще одного механизма доставки ингибиторов протеолиза в очаг воспаления. Было выяснено, что при изъязвлениях роговицы, кератитах и конъюнктивитах повышается антипротеолитическая активность слезной жидкости. Однако доставка антипротеазных ферментов посредством первичных механизмов (слезы и краевой петлистой сети) по всей видимости является недостаточной для купирования процессов деструкции тканей. Поэтому посредством неоваскуляризации роговицы включается вторичный механизм их доставки, в результате чего воспаление регрессирует.

    Это объясняется тем, что механизм доставки антипротеазных веществ через новообразованные кровеносные сосуды является более продуктивным. Он способствует не только поступлению ингибиторов протеолиза непосредственно в очаг поражения, но и поддержанию их высокой концентрации, в результате чего ферменты протеолиза лучше связываются, создается своеобразный биохимический (антипротеазный) барьер, что прекращает дальнейшую деструкцию тканей и распространение воспалительной инфильтрации.

    Все это объясняет уменьшение количества сосудов венозного и замещения сосудами капиллярного типа в лимбальной области и резкое увеличение количества сосудов капиллярного типа в строме роговицы (в грануляционной ткани) у кроликов 1 (основной) группы. Вместе с тем резкое увеличение количества сосудов капиллярного типа в сочетании с образованием субэпителиальной грануляционной ткани являются проявлением процесса заместительной регенерации роговицы, которая к 2-му месяцу способствовала купированию воспаления и замещению грануляций на зрелую соединительную ткань с резким снижением количества сосудов капиллярного типа.

    Таким образом, согласно полученным в I серии экспериментов данным, патогенез экспериментальной ЛН, протекая по общим принципам восстановления тканей, проходит все стадии асептического воспаления. В стадию альтерации, в ответ на нанесенное повреждение, в результате высвобождения различных внутриклеточных, в том числе протеолитических ферментов, запускаются разрушительные биохимические процессы, сопровождающиеся вторичным повреждением стромального коллагена. В ответ на это происходит повышение проницаемости сосудов, что приводит к увеличению отека роговицы. Так начинается стадия экссудации, при которой в зону воспаления мигрируют нейтрофилы. В конечном итоге происходит постепенное замещение процессов разрушения на восстановление, что является началом стадии пролиферации, при которой, по гистологическим данным, происходит формирование в роговице грануляционной, а затем «зрелой» соединительной ткани. Воспалительная реакция купируется, ангиогенез стабилизируется, а поверхность роговицы покрывается многослойным цилиндрическим эпителием конъюнктивы (с бокаловидными клетками) ввиду отсутствия источника многослойного плоского неороговевающего эпителия роговицы.

    Полученные экспериментальные данные показывают, что механизмы заживления роговицы при экспериментальной лимбальной недостаточности направлены на реваскуляризацию поврежденных тканей, посредством чего усиливается доставка к очагу воспаления антипротеолитических, антиоксидантных и питательных веществ, способствующих купированию воспаления. В ответ на это снижается активность фактора некроза опухоли (ФНО α), что активизирует эпителизацию роговицы.

    В этой связи формирование фиброваскулярного паннуса является проявлением заместительной регенерации, направленной на скорейшую эпителизацию роговицы путем пролиферации конъюнктивального эпителия (конъюнктивализации) и восстановление нормального функционирования лимбального микроокружения. Поэтому для предотвращения развития рецидива фиброваскулярного паннуса после его хирургического иссечения целесообразно не только восстановление лимбального барьера, но и реконструкция роговичной поверхности для создания адекватных условий ее эпителизации.

    Исходя из полученных результатов во II серии следует, что оптимальным из исследуемых способом забора биоптатов СОПР с целью дальнейшего выделения из них СКЭПР является забор эпителиально-тканевых биоптатов СОПР (3-я группа). Это связано с тем, что при таком методе биоптат забирается вместе с эпителиальными гребешками, в которых содержится пролиферативный пул буккального эпителия (низкодифференцированные клетки).

    При этом для получения популяции СКЭПР возможно использовать методики как ферментативной дезагрегации, так и эксплантов, позволяющие в короткие сроки получить конфлюэнтный монослой низкодифференцированных клеток, которые по данным иммуноцитохимии характеризуется как СКЭПР.

    Культивированные клетки СОПР кроликов, выделенные из эпителиально-тканевых биоптатов, обладают антиапоптотической (за счет ABCB5) и метаболической (за счет ABCG2) активностью, а также способны противостоять разрушающему действию кислородных радикалов при повышении клеточного редокс-статуса (посредством ALDH3A1), что роднит их с лимбальными эпителиальными стволовыми клетками. Кроме того, полученная нами популяция содержала как дифференцированные эпителиоциты (экспрессия цитокератина 3/12), так и недифференцированные клетки (экспрессия цитокератина 15), что, учитывая срок культивирования (2-3 пассаж) и интенсивность окраски на основные маркеры стволовых клеток, является доказательством получения стабильной самоподдерживающейся культуры, содержащей СКЭПР, дающих популяцию уже дифференцирующихся эпителиоцитов.

    Исходя из полученных результатов в III серии следует, что трансплантация культивированных буккальных эпителиальных клеток на деэпителизированной амниотической мембране «клетками вверх» (2-я основная группа) представляется наиболее перспективным способом устранения тотальной экспериментальной лимбальной недостаточности. Он позволяет добиться полной эпителизации роговичной поверхности и отсутствия рецидива фиброваскулярного паннуса с сохранением прозрачности роговицы на срок не менее 90-х суток по сравнению с покрытием деэпителизированной амниотической мембраной без культивированных клеток (3-я контрольная группа) и трансплантацией культивированных буккальных эпителиальных клеток на деэпителизированной амниотической мембране «клетками вниз» (1-я основная группа).

    По результатам импрессионной цитологии исследуемых роговиц выяснено, что в 1-й (основной) и 3-й (контрольной) группах роговицу покрывал эпителий конъюнктивального фенотипа, характеризующийся наличием в нем бокаловидных клеток, окрашивающихся в синий цвет. Во 2-й (основной) группе определялся эпителий, не содержащий бокаловидные клетки, при этом клетки были представлены двумя типами. Первые имели плоскую полигональную форму, а вторые в виде соединенных между собой скоплений с удлиненной формой клеток. При этом все клетки имели более выраженное базофильное прокрашивание цитоплазмы по сравнению с конъюнктивальными.

    Регенерация исследуемых роговиц по гистологическим данным в различные сроки характеризовалась репаративными процессами, затрагивающими трансформацию сосудистого русла в области лимба: сосуды венозного типа замещались сосудами капиллярного типа, сформированной грануляционной или зрелой соединительной тканью. При этом по гистологическим данным в различные сроки регенерация характеризовалась формированием грануляционной и соединительной ткани, различной степенью воспалительной реакции и ангиогенезом.

    По гистологическим данным в различные сроки регенерация характеризовалась пролиферацией многослойного цилиндрического эпителия конъюнктивы с бокаловидными клетками в 1-й (основной) и 3-й (контрольной) группах и многослойным плоским неороговевающим эпителием во 2-й (основной) группе с замещением ими эпителиального дефекта. Во 2-й (основной) группе, где выполнялось подшивание клеточно-тканевого трансплантата с культивированными СКЭПР, ориентированными «клетками вверх», регенерация эпителия исследуемых роговиц по гистологическим данным в различные сроки характеризовалась пролиферацией многослойного плоского эпителия и отсутствием в роговице бокаловидных клеток.

    В результате настоящего исследования разработана и апробирована в эксперименте методика устранения экспериментальной лимбальной недостаточности посредством клеточнотканевого трансплантата на основе деэпителизированной амниотической мембраны с культивированными стволовыми клетками слизистой полости рта в условиях тотальной лимбальной недостаточности. Установлено, что устранение экспериментальной лимбальной недостаточности возможно после иссечения фиброваскулярного паннуса и трансплантации культивированных буккальных эпителиальных клеток на деэпителизированной амниотической мембране «клетками вверх». Это позволяет добиться полной эпителизации роговичной поверхности и отсутствия рецидива фиброваскулярного паннуса с сохранением прозрачности роговицы экспериментальных животных в течение 90-х суток.

    Таким образом, полученные в результате настоящего исследования данные имеют существенное практическое значение и являются основой для внедрения разработанной методики в клиническую практику российских офтальмохирургов.

    

Выводы



    1. При тотальной экспериментальной лимбальной недостаточности эпителизация роговицы осуществляется по пути заместительной регенерации в ответ на несостоятельность реэпителизации роговицы за счет роговичного эпителия, вследствие чего длительно поддерживается воспалительный процесс, что в условиях отсутствия нормального анатомического лимбального барьера приводит к нарастанию фиброваскулярной ткани.

    2. Патогенез тотальной экспериментальной лимбальной недостаточности по гистологическим данным опосредован формированием в роговице грануляционной, а затем зрелой соединительной ткани, воспалительной реакцией, ангиогенезом и пролиферацией многослойного цилиндрического эпителия конъюнктивы с бокаловидными клетками и замещения им дефекта многослойного плоского неороговевающего эпителия роговицы.

    3. При выделении буккальных эпителиальных клеток способами скарифицированного эпителия или эпителиальных лоскутов введенные в культуру клетки морфологически являются только высокодифференцированными – неспособными к дальнейшему культивированию.

    4. Получение в культуре низкодифференцированных буккальных эпителиальных клеток (способных к дальнейшему культивированию), положительно окрашивающихся антителами против основных стволовых маркеров (ABCB5, ABCG2, ALDH3A1), возможно в результате их выделения как по ферментативной, так и миграционной методике из биоптатов слизистой оболочки полости рта, полученных способом эпителиально-тканевых биоптатов.

    5. В условиях тотальной экспериментальной лимбальной недостаточности трансплантация культивированных буккальных эпителиальных клеток на деэпителизированной амниотической мембране «клетками вверх» позволяет добиться полной эпителизации роговичной поверхности и отсутствия рецидива фиброваскулярного паннуса с сохранением прозрачности роговицы на срок не менее 90-х суток по сравнению с покрытием деэпителизированной амниотической мембраной без культивированных клеток и трансплантацией культивированных буккальных эпителиальных клеток на деэпителизированной амниотической мембране «клетками вниз».

    6. По гистологическим данным регенерация эпителия роговицы после устранения тотального фиброваскулярного паннуса и подшивания клеточно-тканевого трансплантата с культивированными буккальными эпителиальными клетками, ориентированными «клетками вверх», в различные сроки характеризовалась пролиферацией многослойного плоского эпителия и отсутствием в роговице бокаловидных клеток.

    

Практические рекомендации



    1. Для получения в культуре низкодифференцированных буккальных эпителиальных клеток для их дальнейшего культивирования целесообразно использовать эпителиальнотканевые биоптаты слизистой оболочки полости рта.

    2. Введение в культуру низкодифференцированных буккальных эпителиальных клеток возможно как по ферментативной, так и миграционной (эксплантов) методике выделения этих клеток.

    3. При тотальной лимбальной недостаточности для достижения полной эпителизации роговичной поверхности и отсутствия рецидива фиброваскулярного паннуса с сохранением прозрачности роговицы на срок не менее 90-х суток целесообразно выполнение трансплантации культивированных буккальных эпителиальных клеток на деэпителизированной амниотической мембране ориентированных «клетками вверх».

    

Список сокращений



    АМ – амниотическая мембрана;

    ВАК – высшая аттестационная комиссия;

    ВМедА им. С.М. Кирова – ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ;

    ИНЦ РАН – ФГБУН «Институт цитологии» РАН;

    ИЦ – импрессионная цитология;

    КЭ – кератэктомия;

    ЛН – лимбальная недостаточность;

    ЛТ – лимбальная трансплантация;

    ЛЭСК – лимбальные эпителиальные стволовые клетки;

    ТА-клетки – транзиторные амплифицирующие клетки;

    СКЭПР – стволовые клетки выстилающего эпителия полости рта;

    СОПР – слизистая оболочка полости рта;

    CLET– cultured limbal epithelial transplantation (eng.) – трансплантация культивированных лимбальных эпителиоцитов;

    COMET – cultivated oral mucosal epithelial transplantation (eng.) – трансплантация культивированного эпителия слизистой полости рта.

    

Список работ, опубликованных по теме диссертации



    1. Черныш, В.Ф. Вариант применения амниотической мембраны для эпителизации роговицы в ранние сроки течения тяжелого ожога глаза. Случай из практики / В.Ф. Черныш, С.В. Чурашов, А.Н. Куликов, И.О. Гаврилюк // Российский общенациональный офтальмологический форум. – 2017. – Т. 2. – С. 725-729.

    2. Гаврилюк, И.О. Экспериментально-технический комплекс для изучения лимбальной недостаточности на лабораторных животных / И.О. Гаврилюк, А.Н. Куликов, В.Ф. Черныш, С.В. Чурашов, А.С. Дубовиков, А.В. Безушко // Российский общенациональный офтальмологический форум. – 2017. – Т. 2. – С. 519-522.

    3. Дубовиков, А.С. Исследование возможности применения культивированных на амниотической мембране лимбальных эпителиальных стволовых клеток для лечения лимбальной недостаточности в эксперименте / А.С. Дубовиков, А.В. Безушко, И.О. Гаврилюк, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш, М.И. Блинова, О.И. Александрова // Современные технологии в офтальмологии. – 2017. – № 4. – С. 72-75.

    4. Гаврилюк, И.О. Усовершенствование методики подготовки препаратов эпителия роговицы для импрессионной цитологии с целью витальной оценки его фенотипа в эксперименте / И.О. Гаврилюк, А.Н. Куликов, В.Ф. Черныш, С.В. Чурашов, И.А. Злобин // Современные технологии в офтальмологии. – 2017. – № 4. – С. 55-57.

    5. Безушко, А.В. Модификация экспериментальной механической модели лимбальной недостаточности / А.В. Безушко, А.С. Дубовиков, А.А. Суетов, И.О. Гаврилюк, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш // Современные технологии в офтальмологии. – 2017. – № 4. – С. 26- 28.

    6. Безушко, А.В. Модифицированная механическая модель лимбальной недостаточности / А.В. Безушко, А.С. Дубовиков, А.А. Суетов, И.О. Гаврилюк, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш // Современные технологии в офтальмологии. – 2017. – № 3. – С. 32-36.

    7. Куликов, А.Н. О применении амниотической мембраны для оптимизации эпителизации роговицы в ранние сроки течения тяжелого ожога глаза (клиническое наблюдение) / А.Н. Куликов, В.Ф. Черныш, С.В. Чурашов, И.О. Гаврилюк // Современные технологии в офтальмологии. – 2017. – № 3. – С. 130-132.

    8. Дубовиков, А.С. О применении культивированных на амниотической мембране стволовых клеток роговичного эпителия для устранения лимбальной недостаточности в эксперименте / А.С. Дубовиков, А.В. Безушко, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш, М.И. Блинова, О.И. Александрова, А.А. Суетов, И.О. Гаврилюк // Практическая медицина. – 2017. – Т. 2, № 9 (110). – С. 67-71.

    9. Безушко, А.В. Исследование возможности применения культивированных аутологичных лимбальных эпителиальных стволовых клеток на коллагеновом скаффолде для устранения лимбальной недостаточности в эксперименте / А.В. Безушко, А.С. Дубовиков, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш, М.И. Блинова, О.И. Александрова, А.А. Суетов, И.О. Гаврилюк // Практическая медицина. – 2017. – Т. 2, № 9 (110). – С. 32-37.

    10. Куликов, А.Н. Применение коллагенового скаффолда в качестве носителя культивированных аутологичных лимбальных стволовых клеток с целью устранения лимбальной недостаточности в эксперименте / А.Н. Куликов, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш, А.В. Безушко, А.С. Дубовиков, М.И. Блинова, О.И. Александрова, А.А. Суетов, И.О. Гаврилюк, Ю.И. Хорольская // Российский общенациональный офтальмологический форум. – 2018. – Т. 2. – С. 491-493.

    11. Гаврилюк, И.О. К вопросу о заборе, выделении и культивировании стволовых клеток эпителия слизистой полости рта / И.О. Гаврилюк, О.И. Александрова, Ю.И. Хорольская, К.Э. Журенков, А.Ю. Кузнецова, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш, А.С. Дубовиков, А.В. Безушко, М.И. Блинова // Современные технологии в офтальмологии. – 2018. – № 4. – С. 60-63.

    12. Куликов, А.Н. Применение коллагенового скаффолда в качестве носителя культивированных аутологичных лимбальных эпителиальных клеток для устранения лимбальной недостаточности в эксперименте / А.Н. Куликов, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш, А.В. Безушко, А.С. Дубовиков, М.И. Блинова, О.И. Александрова, А.А. Суетов, И.О. Гаврилюк, Ю.И. Хорольская // Современные технологии в офтальмологии. – 2018. – № 3. – С. 116-120.

    13. Безушко, А.В. Модификация механической модели лимбальной недостаточности / А.В. Безушко, А.С. Дубовиков, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш, А.А. Суетов, И.О. Гаврилюк // Офтальмология. – 2018. – Т. 15, № 1. – С. 51-57.28

    14. Дубовиков, А.С. Лимбальная недостаточность: этиология, патогенез, принципы и перспективы хирургического лечения (обзор литературы) / А.С. Дубовиков, И.О. Гаврилюк, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш, А.В. Безушко // Российский офтальмологический журнал. – 2019. – Т. 12, № 1. – С. 103-111.

    15. Александрова, О.И. Стволовые клетки лимба и слизистой полости рта для терапии дисфункции лимбального эпителия / О.И. Александрова, Ю.И. Хорольская, И.О. Гаврилюк, Г.А. Писугина, К.Э. Журенков, Т.В. Машель, Д.А. Переплетчикова, А.С. Дубовиков, А.В. Безушко, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш, И.Н. Околов, М.И. Блинова // StenCellBio-2018: фундаментальная наука как основа трансляционной медицины: тез. докл. Междунар. конф. – Санкт-Петербург, 2018. – С. 10.

    16. Писугина, Г.А. Введение в культуру in vitro и характеристика стволовых клеток лимба человека и кролика / Г.А. Писугина, О.И. Александрова, Ю.И. Хорольская, К.Э. Журенков, Т.В. Машель, Д.А. Переплетчикова, В.В. Зенин, В.В. Карпович, И.О. Гаврилюк, М.И. Блинова // StenCellBio-2018: фундаментальная наука как основа трансляционной медицины: тез. докл. Междунар. конф. – Санкт-Петербург, 2018. – С. 161-162.

    17. Машель, Т.В. Разработка биоинженерных конструкций искусственной роговицы на основе амниотической мембраны и стволовых клеток лимба и слизистой полости рта / Т.В. Машель, О.И. Александрова, Ю.И. Хорольская, Д.А. Переплетчикова, Г.А. Писугина, К.Э. Журенков, И.О. Гаврилюк, М.И. Блинова // StenCellBio-2018: фундаментальная наука как основа трансляционной медицины: тез. докл. Междунар. конф. – Санкт-Петербург, 2018. – С. 65.

    18. Журенков, К.Э. Введение в культуру in vitro клеток буккального эпителия с целью использования их в тканевой инженерии / К.Э. Журенков, О.И. Александрова, И.О. Гаврилюк, Ю.И. Хорольская, Г.А. Писугина, Т.В. Машель, Д.А. Переплетчикова, М.И. Блинова // VI Молодежная конференция по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН: тез. докл. – Санкт-Петербург, 2018. – С. 36-37.

    19. Машель, Т.В. Использование амниотической мембраны как матрицы для культивирования лимбальных стволовых клеток при лечении синдрома лимбальной недостаточности / Т.В. Машель, Д.А. Переплетчикова, К.Э. Журенков, И.О. Гаврилюк, Г.А. Писугина, Ю.И. Хорольская, О.И. Александрова, М.И. Блинова // VI Молодежная конференция по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН: тез. докл. – Санкт-Петербург, 2018. – С. 71-72.

    20. Писугина, Г.А. Введение в культуру in vitro лимбальных стволовых клеток с целью их использования в регенеративной офтальмохирургии / Г.А. Писугина, О.И. Александрова, Ю.И. Хорольская, К.Э. Журенков, Д.А. Переплетчикова, Т.В. Машель, В.В. Карпович, И.О. Гаврилюк, М.И. Блинова // Биология – наука XXI века: тез. докл. 22-ой Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых. – Пущино, 2018. – С. 88.

    21. Александрова, О.И. К вопросу о подготовке амниотической мембраны в качестве скаффолда для культивируемых клеток при создании биоинженерных конструкций роговицы / О.И. Александрова, И.О. Гаврилюк, Т.В. Машель, В.Ф. Черныш, С.В. Чурашов, А.Н. Куликов, М.И. Блинова // Саратовский научно-медицинский журнал. – 2019. – Т. 15, № 2. – С. 409-413.29

    22. Гаврилюк, И.О. Механическая подготовка амниотической мембраны при создании биоинженерных конструкций для востановления эпителия роговицы / И.О. Гаврилюк, О.И. Александрова, А.Ю. Кузнецова, Т.В. Машель, А.С. Селезнев, В.Ф. Черныш, С.В. Чурашов, М.И. Блинова, А.Н. Куликов // Вестник Российской Военно-медицинской академии. – 2019. – Т. 4, № 68. – С. 116-120.

    

OAI-PMH ID: oai:eyepress.ru:avtoreferat513

Город: Москва
Дата добавления: 23.11.2020 15:57:35, Дата изменения: 26.01.2021 12:36:54



Johnson & Johnson
Alcon
Bausch + Lomb
Reper
NorthStar
ЭТП
Rayner
Senju
Гельтек
santen
Акрихин
Ziemer
Eyetec
МАМО
Tradomed
Nanoptika
R-optics
Фокус
sentiss
nidek