Исследование свойств полимерных матриц-носителей для культивированных лимбальных стволовых клеток в эксперименте

    

    Научные руководители: доктор медицинских наук, доцент Куликов Алексей Николаевич кандидат биологических наук, доцент Блинова Миральда Ивановна

    

    Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

    

Общая характеристика работы

    Актуальность темы исследования

     По данным отечественных и зарубежных авторов, в настоящее время в мире насчитывается около 36 миллионов слепых и 216 миллионов слабовидящих людей [Bourne R.R. et al., 2017; Flaxman S.R., et al., 2017; Нероев В.В., 2015]. Заболевания и повреждения роговицы занимают четвертое место (4%) в структуре глазной патологии, уступая лишь катаракте (51%), глаукоме (8%) и возрастной макулярной дегенерации (5%) [World Health Organization, 2010; Pascolini D. et al., 2010]. Наиболее распространенными из них являются язвы и помутнения роговицы после перенесенной инфекционной патологии, травм или ожогов, а также ксерофтальмия в детском возрасте [Lim A.S., 1997].

    По данным отечественных авторов [Либман Е.С., Рязанов Д.П., 2014], число слепых и слабовидящих в Российской Федерации, зарегистрированных Всероссийским обществом слепых, составляет 213 тыс. человек, а уровень слепоты и слабовидения – 101,9 на 100 тыс. населения. Удельный вес патологии роговицы среди слепых и слабовидящих людей составляет от 4 до 5% [Нероев В.В., 2015].

    Во время современных локальных вооруженных конфликтов [Нечаев Э.А., 2002, Волков В.В. с соавт., 2018] взрывные поражения органа зрения составляют до 80-90% от всех огнестрельных повреждений глаз и в большинстве случаев сопровождаются механическими повреждениями и ожогами роговицы, которые могут привести к потере зрительных функций, а при неблагоприятном течении – даже к потере органа зрения [Черныш В.Ф. с соавт, 2013, 2015]. Ожоги глаз у военнослужащих составляют 6,4% (тяжелые ожоги – 9,5%, особо тяжелые ожоги – 1,0%.) [Николаев С.Н., 2011] случаев всех травм и в большинстве случаев приводят к развитию сосудистых помутнений роговицы с различной степенью выраженности [Черныш В.Ф., Бойко Э.В, 2017].

    Основным методом хирургического лечения такой патологии роговицы в настоящее время является сквозная кератопластика [Пучковская Н.А. с соавт., 1971; Федоров С.Н. с соавт, 1981; Дронов М.М, 1997; Слонимский А.Ю., 2001; Reinhard Т. et al., 2013]. Однако выполнение пересадки роговицы при наличии тотального сосудистого бельма практически всегда обречено на неудачу в связи с неизбежным его рецидивированием [Слонимский А.Ю., 2001; Макаров П.В. с соавт., 2007; Черныш В.Ф., Бойко Э.В., 2017].

    Степень разработанности темы исследования

    Одной из главных причин сосудистых помутнений роговицы является дисфункция лимбальных стволовых клеток (ЛСК), клинически проявляющаяся состоянием, получившим название лимбальной недостаточности [Holland E.J. et al. 2002, Черныш В.Ф., Бойко Э.В., 2017; Малюгин Б.Э. с соавт., 2019]. В настоящее время в качестве одного из способов устранения лимбальной недостаточности (ЛН) исследуется возможность трансплантации на роговицу культивируемых in vitro ЛСК [Grueterich M. et al., 2003]. Наиболее распространенным в мире носителем для культивирования ЛСК является амниотическая мембрана (АМ) [Grueterich M. et al., 2003; Pellegrini G. et al., 1997]. В то же время риск передачи гемотрансмиссивных заболеваний при использовании АМ для вышеуказанных целей обусловливает необходимость поиска новых видов матриц-носителей, изготавливаемых из биологических или синтетических материалов.

    В нашей стране накапливается опыт разработки и использования различного рода «биоинженерных конструкций» в хирургии роговицы (Ченцова Е.В. с соавт., 2015, 2016; Егорова Н.С. с соавт., 2016, 2017; Борзенок С.А. с соавт., 2018, 2019). Ведутся активные исследования материалов природного происхождения, которые могут быть использованы в качестве матрицы для культивирования стволовых клеток различного происхождения, в том числе ЛСК: коллаген, фибрин, хитозан с желатином, фиброин шелка, кератин [Ченцова Е.В. с соавт., 2016; Куликов А.Н. с соавт., 2018]. Однако процесс изготовления данных материалов достаточно трудоемкий, а также несет в себе риски передачи трансмиссивных заболеваний.

    По данным литературы, большой перспективностью в области регенеративной медицины обладают синтетические материалы [Головкин А.С. с соавт., 2018]. Имеются публикации о возможности использования в качестве материалов для изготовления матриц-носителей ЛСК таких синтетических материалов, как поли(лактид-гликолид) [Deshpande P. et al., 2010, 2013] и поли-ε-капролактон [Sharma S. et al., 2011]. Однако данные исследования имеют малочисленный характер и лишь описывают свойства и характеристики одного конкретного материала без сравнения с другими.

    Таким образом, проблема исследования возможности использования различных синтетических материалов, а также поиска оптимального из них с целью создания, в перспективе, отечественного биомедицинского клеточного продукта для лечения лимбальной недостаточности имеет высокую научно-практическую значимость и определяет актуальность данной работы.

    Цель исследования

    Изучить в эксперименте свойства трех видов синтетических полиэфирных матриц, провести их сравнительную оценку и определить оптимальную в качестве носителя для культивирования и трансплантации лимбальных стволовых клеток.

    Задачи исследования

    1. Изучить оптические и механические свойства матриц, изготовленных на основе синтетических полиэфиров: поли(лактид-гликолид) (85/15), поли(лактидкапролактон) (85/15) и поли-ε-капролактон в сравнении с амниотической мембраной.

    2. Исследовать в условиях in vitro биосовместимость различных клеточных культур (лимбальных стволовых клеток человека и кролика, а также клеток трансформированной линии эпителия роговицы человека) с изучаемыми полимерными матрицами.

    3. Исследовать и сравнить сроки биодеградации изучаемых матриц на глазной поверхности лабораторных животных в эксперименте in vivo.

    4. На основании полученных результатов определить вариант матрицыносителя для культивирования in vitro лимбальных стволовых клеток с целью трансплантации на роговицу при устранении лимбальной недостаточности.

    Новизна диссертационного исследования для науки и практики

    1. Впервые выполнено сравнительное исследование оптических и механических свойств синтетических полиэфирных матриц, изготовленных на основе поли(лактид-гликолида), поли(лактид-капролактона) и поли-ε-капролактона различной толщины и амниотической мембраны.

    2. Впервые установлены сроки биодеградации матриц из поли(лактидгликолида), поли(лактид-капролактона) и поли-ε-капролактона различной толщины в условиях in vivo на глазной поверхности лабораторных животных.

    3. Впервые установлена биосовместимость синтетических матриц на основе поли(лактид-гликолида), поли(лактид-капролактона) и поли-ε-капролактона с различными клеточными культурами (лимбальными стволовыми клетками человека и кролика, а также с клетками трансформированной линии эпителия роговицы человека).

    4. Впервые по результатам сравнительного экспериментального исследования обосновано использование поли(лактид-капролактона) толщиной 5 мкм в качестве материала матрицы-носителя культивированных лимбальных стволовых клеток – как наиболее подходящей из рассмотренных для трансплантации на роговицу с целью устранения лимбальной недостаточности.

    Теоретическая и практическая значимость работы

    1. Результаты исследований в условиях in vitro позволили получить данные об оптических и механических свойствах, биосовметимости с различными клеточными культурами матриц, изготовленных из трех видов синтетических материалов различной толщины.

    2. Результаты исследований в условиях in vivo продемонстрировали сроки биодеградации синтетических матриц различной толщины, что позволило определить материал и необходимую толщину матрицы-носителя с минимальными сроками лизиса на глазной поверхности лабораторных животных.

    3. Результаты работы позволили определить вариант синтетической матрицыносителя для культивирования и трансплантации лимбальных стволовых клеток на роговицу для целей устранения лимбальной недостаточности.

    Методология и методы диссертационного исследования

    Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного исследования. Работа выполнена в дизайне сравнительного открытого экспериментального исследования с использованием клинических, инструментальных, цитологических и аналитических методов.

    Основные положения, выносимые на защиту

    1. По оптическим и механическим свойствам наиболее приближенными к предъявляемым требованиям характеристиками обладают матрицы из поли(лактидкапролактона).

    2. Исследованные синтетические матрицы являются перспективными носителями культивированных лимбальных стволовых клеток, так как биосовместимы с различными клеточными культурами роговицы и имеют способность к биодеградации, а по оптическим и механическим свойствам превосходят амниотическую мембрану.

    3. Матрица, изготовленная из поли(лактид-капролактона), толщиной 5 мкм может рассматриваться как оптимальный вариант носителя лимбальных стволовых клеток для трансплантации их на роговицу с целью устранения лимбальной недостаточности.

    Степень достоверности и апробация результатов исследования

    Степень достоверности результатов проведенных исследований определяется количеством наблюдений, использованием адекватных методов исследования и подтверждается в процессе анализа материала. Значимость различий средних значений количественных показателей оценивалась с помощью метода дисперсионного анализа с использованием методики LSD теста Фишера, а также непараметрического метода Краскела-Уоллиса. Научные положения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, строго аргументированы и логически вытекают из результатов исследования.

    Личный вклад автора в проведенное исследование

    Автором лично разработаны дизайн и программа исследования. Личный вклад автора в выполнении сложных исследований – 80%. Самостоятельно осуществлен сбор полученных данных. Автором освоены методики, применяемые для получения и оценки результатов, выполнен анализ и описание результатов основных исследований, сформулированы выводы и основные положения, выносимые на защиту.

    Внедрение результатов работы в практику

    Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе и научной работе на кафедре офтальмологии ВМедА имени С.М. Кирова. Полученные экспериментальные данные являются основой для разработки на базе Института цитологии РАН биомедицинского клеточного продукта, представляющего собой культивированные ЛСК, трансплантируемые на глазную поверхность на матриценосителе, перспективного для внедрения в клиническую практику.

    Апробация работы

    Основные положения работы представлены в виде докладов и обсуждены на итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей Военномедицинской академии (Санкт-Петербург, 2018 г.), итоговой конференции военнонаучного общества слушателей I факультета руководящего медицинского состава Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2018-2019 гг.), XIII Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (2018 г.), XX Всероссийском конгрессе с международным участием «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии» (2019 г.).

    Публикации

    По теме диссертационного исследования опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для опубликования основных результатов диссертаций на соискание учёной степени кандидата медицинских наук.

    Структура и объём работы

    Диссертация изложена на 99 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 158 источников (из них 46 отечественных и 112 иностранных). Работа содержит 9 таблиц и 36 рисунков.

    

Содержание работы

    Материалы и методы исследования

     Методика изготовления синтетических полимерных матриц. Для приготовления матриц использовали поли-L-лактид-гликолид (85/15) (ПЛГ) (Purac, США), поли-Lлактид-капролактон (85/15) (ПЛК) (Purac, США) и поли-ε-капролактон (ПКЛ) (SigmaAldrich, США). Материалы ПЛГ и ПЛК имели степень чистоты Medical Grade. Все полимеры растворяли в трихлорметане (Реактив, Россия) до конечной концентрации в 2 мг/мл и наносили их на предметные стёкла. После испарения растворителя на воздухе изготовленные матрицы сушили при температуре 37 °С до полного удаления растворителя (Рис. 1). Толщина образцов каждой из исследуемых синтетических матриц составляла 5, 10, 15 и 30 мкм.

    Методика исследования прозрачности синтетических полимерных матриц из ПЛГ, ПЛК, ПКЛ и АМ. Для исследования прозрачности синтетических матриц из ПЛГ, ПЛК, ПКЛ и АМ использовали гелий-неоновый лазер DH-HN150 (Beijing, Китай) с длиной волны 632,8 нм, измеритель профиля пучка BC106N (Thorlabs, США) и линзы с фокусным расстоянием 50 и 75 мм. Исследовали матрицы размерами 20 на 20 мм и толщиной 5, 10, 15 и 30 мкм, АМ. Количество образцов в каждой группе исследования равнялось 5. В качестве контроля выполнялось исследование кварцевого стекла (стекло КУ-1 кварцевое оптическое). Выполняли определение величины диффузного рассеяния света при прохождении через исследуемый материал. Полученные значения прозрачности матриц выражали в процентах (%).

    Методика исследования механических свойств синтетических полимерных матриц из ПЛГ, ПЛК, ПКЛ и АМ. Исследование механических свойств синтетических матриц из ПЛГ, ПЛК, ПКЛ и АМ выполняли на универсальной установке INSTRON 1122 (Instron, США) в режиме одноосного растяжения. Исследовали матрицы толщиной 5, 10 и 15 мкм и АМ. Количество образцов в каждой группе исследования равнялось 5.

    Скорость растяжения материалов составляла 10 мм/мин. В процессе испытаний записывали диаграммы растяжения материалов, т.е. зависимости σ(ε), на основе которых определялись следующие величины: прочность (σр, мегапаскаль (МПа)); относительное удлинение при разрыве (εр, в процентах (%)), характеризующее эластичность материала; модуль жесткости (Е, мегапаскаль (МПа)).

    Методики оценки биосовместимости синтетических полимерных матриц из ПЛГ, ПЛК и ПКЛ с ЛСК человека и кролика, а также с клетками трансформированной линии эпителия роговицы человека. Для оценки биосовместимости матриц из ПЛГ, ПЛК, ПКЛ использовали первичные культуры ЛСК человека и кролика, а также клетки трансформированной линии эпителия роговицы человека (HCE). Лимбальные стволовые клетки (ЛСК) человека и кролика были выделены из фрагментов лимба кадаверных глаз человека (в течение 24 часов после смерти) и цельных энуклиированных глаз здоровых кроликов. Клетки HCE были получены из коллекции клеток Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург).

    Идентификацию популяций культивируемых ЛСК кролика и человека осуществляли методом непрямой иммунофлуоресценции, используя антитела против стволовых маркеров (ABCB5, ABCG2, ALDH3A1) и маркеров эпителиальной дифференцировки (CK 3/12, CK14, CK15).

    ЛСК человека и кролика высевали на поверхность матриц в концентрации 2×10⁴ клеток/см², а клетки НСЕ – в концентрации 5×10⁴ клеток/см². Подсчет клеток производился на оборудовании TC 20 (Bio-Rad, США). В качестве контроля использовали клетки, культивируемые в стандартных условиях без полимерных синтетических матриц. Было проведено 3 серии независимых экспериментов с последующей оценкой полученных результатов с использованием нижеуказанных методик.

     Жизнеспособность и способность клеток к адгезии оценивали по их морфологии с использованием метода фазово-контрастной микроскопии (ФКМ) при помощи инвертированного микроскопа Eclipse TS100 (Nikon, Япония).

    Пролиферативную активность ЛСК человека и кролика, а также клеток линии HCE на поверхности синтетических полимерных матриц из ПЛГ, ПЛК и ПКЛ оценивали при помощи колориметрического теста с генциановым фиолетовым. Клетки высевали на поверхность матриц и культивировали в стандартных условиях в течение трех суток. В качестве контроля использовалась обычная культуральная посуда. Определяли среднее значение оптической плотности экстрагированного из клеток красителя генцианового фиолетового, выраженной в процентах (%) от контроля.

    Для оценки влияния матриц из ПЛГ, ПЛК, ПКЛ на организацию актинового цитоскелета культивируемых на них клеток использовали ЛСК кролика. Анализ организации актинового цитоскелета распластанных на матрицах клеток проводили с помощью системы флуоресцентной визуализации клеток ZOE™ (Bio-Rad, США).

    Методика оценки способности клеток к миграции с поверхности матриц в условиях in vitro. Для оценки способности и скорости миграции культивируемых клеток с поверхности матриц использовали ЛСК человека. Исследование проводили в условиях in vitro c помощью модели с использованием коллагеновых гидрогелей. В культуральных планшетах формировали гидрогели на основе коллагена 1-го типа по методике, описанной ранее [Безушко А.В. и соавт., 2017]. ЛСК человека высевали на матрицы и через 12 часов матрицы с клетками переносили на поверхность гидрогелей (клетками вниз), затем культивировали в стандартных условиях в течение 28 суток. На разных сроках культивирования проводили фотофиксацию и оценивали морфологию клеток и их относительное количество в процессе исследования под инвертированным микроскопом Eclipse TS100 (Nikon, Япония).

    Методика оценки сроков биодеградации синтетических полимерных матриц в условиях in vivo. Исследование сроков биодеградации (в днях) матриц из синтетических полимеров выполняли на 18-ти кроликах (36 глаз). В зависимости от исследуемого материала были сформированы 3 группы: с использованием матриц из ПЛГ (группа I), матриц из ПЛК (группа II) и матриц из ПКЛ (группа III). В зависимости от толщины материала каждую группу разделили на 3 подгруппы: 5 мкм – подгруппа «А», 10 мкм – «Б», 15 мкм – «В».

    Изготовленные стерильные образцы матриц круглой формы диаметром 20 мм в условиях учебной операционной клиники офтальмологии ВМедА имени С.М. Кирова под микроскопом укладывали на поверхность роговицы с захватом на 1-2 мм перилимбальной конъюнктивы, к которой фиксировали матрицу по краям 8 узловыми швами нейлоновой нитью 10/0 (Рис. 2, А и Б).

     В послеоперационном периоде проводили консервативное лечение в объеме: инстилляции комбинированных глазных капель 0,1% дексаметазона и 0,3% гентамицина 3 раза в день (до 21 сут.). Сроки наблюдения составили – 3, 10, 21, 30 сут. Выполнялась биомикроскопия глаз в каждой группе исследования на щелевой лампе BD900 (HaagStreit, Швейцария) с фотографированием. Оценивался процесс биодеградации матриц в динамике (истончение матриц в области наложения швов, появление участков деструкции) и сроки их полной деградации. Под полной биодеградацией подразумевали отсутствие матриц на глазной поверхности, либо наличие остатков матриц в местах наложения швов с их отсутствием на поверхности роговицы.

    Статистические методы исследования. Оценка статистической значимости различий между изучаемыми количественными показателями в трех и более экспериментальных группах, распределение которых соответствовало нормальному или близкому к нему закону распределения, проводилась с помощью дисперсионного анализа (ANOVA), построения на его основе 95% доверительных интервалов и расчета критерия Фишера с помощью LSD теста. Оценка значимости различия признаков с законом распределения отличным от нормального, проведена с помощью непараметрической альтернативы одномерному дисперсионному анализу – медианного критерия Краскела-Уоллиса. Выбор метода позволял проводить статистический анализ данных в группах с малым количеством наблюдений (малый объем выборок).

    Статистическая обработка и анализ первичных данных проводилась с помощью программы STATISTICA (Tibco, США).

    

Результаты исследований

    Таким образом, по результатам проведенных исследований наиболее высокими показателями прозрачности обладают матрицы из синтетических материалов ПЛГ и ПЛК.

    Результаты исследования механических свойств. Полученные в ходе исследования показатели прочности, относительного удлинения при разрыве и модуля жесткости синтетических матриц и АМ представлены в таблице 2.

    Результаты исследования прозрачности. С учетом полученных результатов было отмечено, что матрицы из ПЛГ и ПЛК различной толщины имели очень высокие показатели прозрачности (98-99%) (Табл. 1). Матрицы из ПКЛ обладали значительно меньшими показателями прозрачности (до 80% при толщине материала 5 мкм) по сравнению с матрицами из ПЛГ и ПЛК (p<0,001) (Рис. 3), которые имели тенденцию к уменьшению при увеличении толщины материала (до 19% при толщине материала 30 мкм). Прозрачность АМ по результатам исследования составила до 75%, что также достоверно меньше показателей матриц из ПЛГ и ПЛК и подтверждает полупрозрачные свойства данного материала (p<0,001).

     В связи с имевшимся несоответствием полученных результатов закону нормального распределения статистическая обработка данных проводилась с использованием медианного теста Краскела-Уоллиса (Рис. 4-6) прочности исследуемых материалов.

    Исходя из полученных данных, было отмечено, что матрицы из ПЛГ имели достаточно высокую прочность, но низкую эластичность и чрезмерно высокую жесткость. Матрицы из ПЛК имели достоверно меньшую прочность (p<0,001) и более низкую жесткость (р<0,05), чем матрицы из ПЛГ. Статистически значимых различий показателей эластичности между матрицами из ПЛГ и ПКЛ выявлено не было (р>0,05).

    Матрицы из ПКЛ имели низкие показатели прочности, однако более высокую эластичность и меньшую жесткость в сравнении с матрицами из ПЛГ и ПЛК (p<0,001). АМ имела более низкую прочность (p<0,001) и модуль жесткости, но высокую эластичность по сравнению с матрицами из ПЛГ (р<0,05). Достоверных отличий показателей прочности и эластичности между АМ и матрицами из ПЛК и ПКЛ выявлено не было (р>0,05). По результатам оценки жесткости было выявлено, что АМ имела несколько меньший модуль жесткости, чем матрицы из ПКЛ (р<0,05), а при сравнении данного показателя между АМ и ПКЛ достоверных отличий выявлено не было (р>0,05).

    Таким образом, наиболее приближенными к АМ показателями прочности, эластичности и жесткости по результатам проведенных нами исследований обладали матрицы из ПКЛ и ПЛК толщиной 5 мкм.

    Результаты выделения ЛСК кролика и человека. Традиционным способом – с помощью ферментативного метода выделения клеток из биоптатов лимбальной ткани была получена первичная культура ЛСК кролика и человека. В среднем в течение 7-14 дней на площади 21 см² образовывался монослой числом до 7-9 х10⁵ клеток. Результаты иммунофенотипирования ЛСК человека и кролика. По результатам проведенного иммуногистохимического исследования было выявлено, что полученная культура клеток фрагментов лимба экспрессировала маркеры стволовости (ABCB5, ABCG2, ALDH3A1) и маркеры эпителиальной дифференцировки (CK 3/12, CK14, CK15), что свидетельствовало о наличии у данных клеточных культур признаков стволовых клеток и способности к дифференцировке в эпителиальном направлении.

     Результаты исследования биосовместимости синтетических матриц с ЛСК кролика и человека и клетками линии HCE. По результатам исследований в условиях in vitro было показано, что ЛСК человека и кролика, а также клетки НСЕ адгезировали на поверхности всех типов исследуемых синтетических полимерных матриц. В контрольном варианте ЛСК человека и кролика, а также клетки НСЕ были хорошо распластаны, имели типичную морфологию и на 2-е сутки культивирования формировали субконфлюентный монослой (Рис. 7 A, Д, И). Морфология ЛСК кролика, культивируемых на всех исследуемых типах матриц, не отличалась от контроля, однако плотность клеток была несколько меньше.

    Также, при изучении биосовместимости оценивали пролиферативную активность ЛСК человека и кролика, клеток линии HCE при культивировании на поверхности матриц из ПЛГ, ПЛК и ПКЛ. Результаты исследования представлены в таблице 3.

    Было выявлено, что в контроле, независимо от клеточного типа, наблюдалась более активная пролиферация всех типов клеток (p<0,001). Однако при культивировании на матрицах клетки сохраняли способность к делению. Статистически значимых различий в показателях биосовместимости с клетками всех исследуемых синтетических материалов выявлено не было (p>0,05) (Рис. 8-9). При этом на 2-е сутки культивирования на матрицах было достаточное количество жизнеспособных клеток для поддержания популяции.

    В ходе анализа организации актинового цитоскелета ЛСК кролика, находящихся на матрицах (Рис. 10), показано, что клетки на всех экспериментальных образцах были хорошо распластаны, имели характерную для данного типа форму и размер. Актин был в основном сосредоточен в пучках филаментов. Межклеточные контакты практически отсутствовали как в контроле, так и в экспериментальных вариантах. Во всех случаях наблюдали митотическую активность.

    Актиновый цитоскелет окрашен родамин-фаллоидином (красный), ядра – DAPI (синий). Таким образом, результаты оценки биосовместимости синтетических полимерных матриц с ЛСК и клетками HCE показали, что на поверхности матриц возможно поддержание клеточных культур в условиях in vitro.

     Результаты оценки способности клеток к миграции с поверхности матриц в условиях in vitro. Для оценки скорости миграции ЛСК с поверхности матрицы использовали коллагеновый гидрогель. В условиях in vitro было показано, что ЛСК человека начинали мигрировать с поверхности матриц на прилегающий коллагеновый гидрогель в течение 24 ч. Однако скорость миграции была достаточно низкой, наибольшая миграционная активность наблюдалась в области контакта края матрицы и коллагенового геля. Было выявлено, что клетки мигрировали не только на поверхность гидрогеля, но и в его толщу. К концу 4-й недели культивирования наблюдалось большое количество клеток на поверхности и в толще гидрогеля (Рис. 11), а также на поверхности матрицы. Скорость и активность миграции ЛСК с матриц разных типов была сопоставима с контролем.

    Итак, по результатам проведенного исследования было отмечено, что матрицы, заселенные клетками, способны выступать в качестве «транзитного средства» и могут обеспечить доставку клеток в зону интереса при трансплантации, в том числе, и на глазную поверхность.

    Результаты исследования сроков биодеградации матриц из поли(лактидгликолида), поли(лактид-капролактона) и поли-ε-капролактона в условиях in vivo. При сравнении сроков биодеградации было выявлено, что матрицы из ПЛК (5 мкм) начинали лизироваться уже на 10-е сутки, тогда как на образцах матриц из ПЛГ (5 мкм) достоверные признаки биодеградации наблюдались значительно позже (21-е сутки).

    Первые признаки лизиса матриц из ПКЛ наблюдались на 30 сутки лишь в подгруппе с толщиной образцов 5 мкм. Полная биодеградация матриц из ПЛК с толщиной 5 мкм занимала не более 30 суток (Рис. 12). Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что скорость биодеградации матриц из ПЛК толщиной 5 мкм протекала быстрее, чем из ПЛГ этой же толщины (p<0,05), и по своим срокам сопоставима со сроками лизирования амниотической мембраны на поверхности роговицы [Нероев В.В. с соавт., 2013].

    

Выводы

    1. Матрицы из поли(лактид-гликолида) и поли(лактид-капролактона) толщиной от 5 мкм до 30 мкм имеют наибольшие показатели прозрачности – 98-99%, что превышает прозрачность матриц из поли-ε-капролактона (от 80±7 до 19±3% при толщине материала от 5 до 30 мкм, соответственно) и амниотической мембраны (75±7%).

    2. Наиболее приближенными к амниотической мембране механическими свойствами обладают матрицы из поли-ε-капролактона, а также из поли(лактидкапролактона) толщиной 5 мкм.

    3. Матрицы из поли(лактид-гликолида), поли(лактид-капролактона) и поли-ε- капролактона биосовместимы с лимбальными стволовыми клетками человека и кролика и с клетками трансформированной линии эпителия роговицы человека.

     4. Матрицы из поли(лактид-капролактона) толщиной 5 мкм имеют минимальные сроки биодеградации (около 30 суток) из изучаемых в работе, что является наиболее приемлемым для целей трансплантации культивированных ЛСК на роговицу.

    5. Разработанная матрица из поли(лактид-капролактона) толщиной 5 мкм может рассматриваться как оптимальный вариант носителя ЛСК для трансплантации на роговицу с целью устранения лимбальной недостаточности.

    

Практические рекомендации

    1. Синтетический полимерный материал поли(лактид-капролактон) толщиной 5 мкм может быть использован для изготовления матриц-носителей лимбальных стволовых клеток в процессе разработки биомедицинского клеточного продукта для целей устранения лимбальной недостаточности.

    

Список работ, опубликованных по теме диссертации

    1. Карпович В.В. Экспериментальная оценка биомеханических, оптических свойств и биодеградации матриц на основе синтетических полимеров для использования их в оптикореконструктивной офтальмохирургии / В.В. Карпович // Материалы итоговой конференции военно-научного общества курсантов, студентов и слушателей Военномедицинской академии имени С.М. Кирова: 2018 г. – СПб.: ВМедА. 2018. – С. 285-287.

    2. Современные подходы к проблеме выбора носителя для культивирования стволовых клеток роговицы в лечении лимбальной недостаточности / А.Н. Куликов, С.В. Чурашов, В.Ф. Черныш [и др.] // Офтальмологические ведомости. – 2018. – Т. 11, № 2. – С. 48-56.

    3. Экспериментальное исследование прозрачности, механических свойств и биодеградации синтетических полимерных матриц как возможных носителей для культивируемых лимбальных эпителиальных стволовых клеток / В.В. Карпович, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов [и др.] // Современные технологии в офтальмологии. – 2018. – № 4. – С. 150-154.

    4. Карпович В.В. Экспериментальная оценка биомеханических, оптических свойств и биодеградации матриц на основе синтетических полимеров для использования их в оптикореконструктивной офтальмохирургии / В.В Карпович // Известия Российской Военно-медицинской академии. – 2018. – Т. 37., № 1, S1. – С. 285-288.

    5. Исследование прозрачности, механических свойств и биодеградации синтетических полимерных матриц как возможных носителей для культивируемых лимбальных эпителиальных стволовых клеток (экспериментальное исследование) / В.В. Карпович, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов [и др.] // Российский общенациональный офтальмологический форум. – 2018. – Т. 2. – С. 475-479.

    6. Исследование свойств синтетических полимерных матриц, изготовленных для трансплантации культивированных лимбальных стволовых клеток с целью устранения лимбальной недостаточности / В.В. Карпович, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов [и др.] // Вестник Российской военно-медицинской академии. – 2019. – № 1 (65). – С. 165-170.

    7. Карпович В.В. Сравнительная оценка некоторых синтетических полимерных матриц при использовании в качестве носителей культивированных лимбальных клеток для устранения лимбальной недостаточности / В.В. Карпович // Материалы итоговой конференции военно-научного общества курсантов, студентов и слушателей Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова: 2019 г. – Спб.: ВМедА. – 2019. – С. 202-204.

    8. Исследование сроков биодеградации синтетических полимерных матриц как перспективных носителей лимбальных стволовых клеток / В.В. Карпович, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов [и др.] // Современные технологии в офтальмологии. – 2019. – № 5 (30). – С 322-325.

    9. Экспериментальное исследование синтетических полимерных материалов как основы в создании перспективных матриц-носителей для культивирования лимбальных стволовых клеток / В.В. Карпович, А.Н. Куликов, С.В. Чурашов [и др.] // Саратовский научно-медицинский журнал. – 2019. – Том 15, № 2. – С 495-501.

    

Список сокращений

    АМ – амниотическая мембрана

    ЛН – лимбальная недостаточность

    ЛСК – лимбальные стволовые клетки

    ЛТ – лимбальная трансплантация

    ПКЛ – поли-ε-капролактон

    ПЛГ – поли(лактид-гликолид)

    ПЛК - поли(лактид-капролактон)

    ФКМ – фазово-контрастная микроскопия

    HCE – клетки трансформированной линии эпителия роговицы человека