КУГУШЕВА АННА ЭДУАРДОВНА
ПРОГНОЗИРОВАНИЕ, ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ПЕРСИСТИРУЮЩИХ ЭРОЗИЙ И ЯЗВ ТРАНСПЛАНТАТА РОГОВИЦЫ ПРИ СКВОЗНОЙ КЕРАТОПЛАСТИКЕ ВЫСОКОГО РИСКА.
14. 01. 07. — глазные болезни
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва — 2013
Работа выполнена в ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России (директор института — заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Нероев В.В.).
Научные руководители: доктор медицинских наук Макаров Павел Васильевич доктор биологических наук, професор Слепова Ольга Семеновна
Официальные оппоненты: Борзенок Сергей Анатольевич — доктор медицинских наук, профессор, руководитель центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова». Круглова Татьяна Борисовна — доктор медицинских наук, главный научный сотрудник отдела патологии глаз у детей ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России.
Ведущая организация: ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России.
Защита диссертации состоится «10» декабря 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.042.01 при ФГБУ «МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России (105062, Москва, ул. Садовая-Черногрязская, 14/19).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России (105062, Москва, ул. Садовая-Черногрязская, 14/19).
Автореферат разослан «____» ноября 2013 года.
Ученый секретарь диссертационного совета: доктор медицинских наук, профессор Киселёва Т.Н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы. Пересадка роговицы в группах «кератопластики высокого риска» (КПВР), прежде всего после ожогов глаз и офтальмогерпеса, остается одной из наиболее трудных проблем офтальмохирургии.
Накопленный в литературе материал свидетельствует о том, что системная иммуносупрессивная терапия с применением циклоспорина А (препарат выбора в трансплантологии), как правило, позволяла купировать аутоиммунные реакции, направленные против роговицы, предотвратить классическую «реакцию отторжения трансплантата» (РОТ), повысить функциональные результаты операции (Копаева В.Г., 1982.; Мороз З.И., 1994; Борзенок С.А., 1995, 2008; Каспаров А.А., 1999; Варданян И.Р., 2000; Макаров П.В., 2003; Балаян Т.Г., 2008; Оганесян О.Г., 2011; Slomovic A.R., 1996; Hill J.C., 2002; Weisbord D.J., 2003; Бордюгова Г.Г, 1989; Нероев В.В.с соавт, 2013; Ченцова Е.В., Гундорова Р.А., 2013). Вместе с тем, анализ архивного материала отдела травматологии и реконструктивной хирургии МНИИ ГБ им. Гельмгольца за последние 10 лет показал, что у 75% пациентов, перенесших сквозную кератопластику «высоко риска» (КПВР), развились осложнения, приведшие к частичной (24,5%) или полной (35,5%) потере прозрачности трансплантата. В 41,6% неблагоприятный исход ассоциировался с развитием эрозий и язв роговицы, причины которых в большинстве случаев оставались неясными. В проблеме КПВР целенаправленные исследования этого отягоща-ющего фактора практически не проводились. Данные об этиопатогенезе эрозий и язв кератотрансплантата, как и о сроках и причинах их появления в раннем или отдаленном послеоперационном (п/о) периоде отсутствуют.
В качестве отягощающих факторов, влияющих на исход КПВР, в литературе рассматриваются нарушения в различных звеньях иммунитета (субпопуляционный состав клеток крови, аутоиммунитет, цитокины и др.) (Илуридзе С.Л. 1982; Тазетдинова Н.Р., 1990; Слепова О.С. с соавт. 2008; Gore S.M., Colombe B.W., 1997; King W.J., 2000; Slegers T.P., 2000; Niederkorn J.Y., 2002; Ahmadi A.J., 2002; Bertelmann E., 2003; Nicholls S.M., 2006); обсуждается роль инфекций, прежде всего вирусов простого герпеса (Каспаров А.А., 1994; Слепова О.С. с соавт. 2008; Stavidis E.et al.,2012), гепатита В и С (Кушнир В.Н., 2001.; Борзенок С.А., 2008). Вопрос о степени участия инфекций и иммунопатологических реакций непосредственно в возникновении персистирующих эрозий (ПЭР) и язв кератотрансплантата практически не изучался.
Цель работы: изучение причин развития персистирующих эрозий и язв трансплантата после сквозной кератопластики «высокого риска» по поводу поствоспалительных поражений роговицы и послеожоговых бельм; повышение эффективности лечения.
Задачи: 1. Ретроспективный анализ встречаемости и возможных причин осложнений (ПЭР) в раннем и отдаленном п/о периоде у больных, перенесших КПВР, оценка влияния этих осложнений на исход хирургического лечения.
2. Изучение клинических особенностей течения п/о периода у больных с ПЭР и язвами кератотрансплантата в условиях различных схем консер-вативного лечения.
3. Изучение нарушений тканеспецифического аутоиммунитета и цито-кинового статуса у больных, перенесших КПВР, определение их роли в раз-витии ПЭР.
4. Изучение роли инфекционных факторов (вирусы группы герпеса, носительство HBs-Ag) в развитии ПЭР и язв кератотрансплантата.
5. Разработка алгоритма клинико-иммунологического мониторинга и оптимизация хирургического и консервативного лечения, направленного на профилактику осложнений и улучшение исходов КПВР.
Научная новизна. Впервые введено понятие и представлена клиническая характеристика «персистирующих эрозий трансплантата роговицы» (ПЭР), с учетом сроков отсутствия эпителизации после КПВР, времени возникновения эрозий и наличия рецидивов. Доказано, что развитие ПЭР, особенно в от-даленном п/о периоде, достоверно снижает качество отдаленных результатов хирургического лечения (p?0,05).
В условиях различных схем консервативного лечения проведен скрининг клинических и иммунологических показателей (тканеспецифический аутоим-мунитет, цитокины) перед КПВР и в динамике п/о периода, направленный на выяснение причин и патогенеза ранних и отдаленных осложнений.
Впервые на основе комплексного исследования серологических маркеров инфекции и ДНК возбудителей (в крови, роговице реципиента и донора) выявлена этиопатогенетическая роль вирусов группы герпеса в развитии осложнений при КПВР.
Установлено, что в возникновении ранних ПЭР участвуют как аутоиммунные, так и инфекционные факторы, а при отдаленных ПЭР доминируют инфекционные.
Впервые проведено параллельное исследование в слезной жидкости (мультиплексный анализ) и в сыворотке крови целого ряда цитокинов и факторов роста, которые могут влиять на течение воспалительного и репаративного процесса и развитие осложнений после КПВР (согласно теоретическим представлениям и единичным литературным данным). Получены данные, свидетельствующие об отягощающей роли нарушений цитокинового статуса: системной гиперпродукции провоспалительных цитокинов (способствующей усилению аутоиммунных реакций) и, особенно, локальной и системной «цитокиновой ареактивности» (предпосылка активизации инфекционного фактора).
Определены критерии и схема клинико-иммунологического монито-ринга, направленного на прогнозирование ПЭР при КПВР.
Научно обоснованы показания к комплексному применению при КПВР иммуносупрессивной и противовирусной терапии.
Показана актуальность дальнейших исследований по разработке новых подходов к местной терапии, обеспечивающей купирование воспалительных реакций без подавления защитных факторов (осторожный выбор противоспалительных средств, в частности — дозы кортикостероидов и дли-тельности их применения, использование препаратов интерферона или другой заместительной цитокинотерапии).
Практическая значимость. Разработан комплекс диагностических, прогностических, профилактических и лечебных (хирургических, тера-певтических) мероприятий, позволивший оптимизировать течение п/о периода и результаты КПВР.
Разработан алгоритм клинико-иммунологического мониторинга боль-ных, перенесших КПВР, и представлены критерии риска возникновения ПЭР и язв роговицы с учетом сроков после операции.
Определена тактика предоперационной подготовки и разработаны схемы п/о терапии, учитывающие роль инфекционных и аутоиммунных факторов, а также особенности нарушений цитокинового статуса.
Разработаны: способ определения показаний к иммуносупрессивной терапии после сквозной кератопластики; способ прогнозирования болезни трансплантата после сквозной кератопластики (получены патенты на изобретения).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. При КП «высокого риска» в раннем (25,2% случаев) или отдаленном (9.3%) п/о периоде возникают ПЭР, повышающие частоту мутного приживления трансплантата на 43,4%. Определены клинические факторы, способствующие появлению данного осложнения; разработаны хирургические и терапев-тические подходы к профилактике.
2. Наряду с клиническими факторами важную роль в возникновении ПЭР играют нарушения иммунитета и инфекции. Разработаны критерии риска и алгоритм клинико-иммунологического мониторинга, направленные на прогно-зирование осложнений, с учетом срока, прошедшего после операции; опреде-лена адекватная тактика консервативного лечения.
3. Оптимизация хирургических методов и патогенетически ориентированный подход к п/о терапии (применение иммуносупрессивных и противовирусных препаратов под лабораторным контролем) позволяют предотвратить возникновение ПЭР и улучшить отдаленные результаты КПВР.
Апробация работы. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на 20 (10 отечественных и 10 зарубежных) научно-практических конференциях, в том числе: «Пролиферативный синдром в офтальмологии», «Российский общенациональный офтальмологический форум» 2011, 2012, 2013 гг.; на конференции молодых ученых «Эндокринные и неэндокринные аутоиммунные заболевания: интеграция и междисциплинарный подход" и «Актуальные проблемы офтальмологии», Москва, 2012; VI Евро-Азиатской конференции, Екатеринбург, 2012; « Ерошевские чтения», Самара, 2012; «Восток-Запад», Уфа, 2012, 2013; «Современные технологии диагностики и лечения при поражениях органа зрения» Санкт-Петербург, 2013; «Филатовские чтения», Одесса, Украина, 2012, 2013; Всемирном конгрессе по травме, Джайпур, Индия, 2012; WCPOS, Милан, Италия, 2012; 2nd EuCornea Congress Vienna Вена, Австрия, 2011; 3rd EuCornea Congress, 2nd World Congress of Paediatric Ophthalmology and Strabismus, Милан, Италия, 2012; ESCRS Winter Meeting, Варшава, Польша 2013; ESCRS, Амстердам, Нидерланды, 2013.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 печатные работы, в том числе 6 в центральной печати, рекомендуемой ВАК. Получены два патента на изобретения.
Внедрение. Результаты исследования внедрены в практику работы отдела травматологии, реконструктивной хирургии и глазного протезирования ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России (рук. — проф. Гундорова Р.А.)
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 180 страницах машинописного текста; иллюстрирована 20 таблицами, 70 рисунками и фотографиями. Список литературы включает 295 источников, из них 85 отечественных и 210 иностранных. Диссертация состоит из введения, четырех глав, включая обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.
Материалы и методы исследования.
Работа выполнена в отделе травматологии, реконструктивной хирургии и глазного протезирования (руководитель — профессор Гундорова Р.А.).
Под нашим наблюдением находились 79 пациентов (107 глаз/случаев) с бельмами III-IV категории, язвами роговицы различной этиологии, поступившие для плановой и экстренной КП. По тяжести клинического состояния глаза все пациенты были отне-сены к категории КПВР.
Рис.1. Зависимость характера течения послеоперационного периода от скорости эпителизации трасплантата.
Рис.2. Зависимость отдаленных результатов кератопластики от скорости эпителизации трансплантата.
Планируемая операция стала 1-й пересадкой роговицы в 58 случаях (54,2%), 2-й — в 33 (30,8%), 3-й — в 12 (11,2%), 4-й — на 4 глазах (3,7%), т.е. поч-ти в половине случаев (всего 49; 45,8%) проводилась реКП. В 21 из 49 случаев (42,8%) операцию проводили в сроки до года после предыдущей пересадки в связи с угрозой или свершившейся перфорацией трансплантата. Всем боль-ным была проведена сквозная КП, в том числе: субтотальная– 85 глаз (79,4%), тотальная–17 (15,9%) , частичная — 5 (4,7%). У 13 пациентов (12,2%) исполь-зовали роговицу, консервированную методом лиофилизации на силикагеле, в 94 случаях (87,8%) — методом В.П. Филатова («нативная»). Эпителий с «натив-ного» трансплантата, как правило, не удаляли (77 случаев; 72%).
Офтальмологическое обследование больных включало традиционные методы: визометрия, определение светопроекции; тонометрия; биомикро-скопия, планиметрия (флуоресцеиновая проба); эхографические и электро-физиологические исследования.
Методы лечения. Все пациенты после операции получали общепринятое медикаментозное лечение (антибактериальная, противовоспалительная терапия местно и системно, стимуляторы регенерации). В течение длительного срока (до 1 года) проводили местную иммуносупрессию (инъекции, затем инстил-ляции дексаметазона). 27 пациентов на фоне традиционной терапии принимали иммуносупрессивный препарат циклоспорин А (ЦСА) в дозе 3 мг/кг веса в сутки. Длительность курса и динамику снижения дозировки препарата корригировали на основании результатов клинического и иммунологического мониторинга, предложенного Макаровым П.В., Слеповой О.С., Балаян Т.Г. (2008).
В 22 случаях при лабораторных признаках активации герпетической инфекции или риске таковой (прием ЦСА, офтальмогерпес или экстраокуляр-ный герпес в анамнезе) назначали противовирусную терапию (ПВТ) (мазь «Зовиракс», таблетки «Ацикловир», 1000 мг в сутки; «Валтрекс», 1000 мг в сутки). Объем и длительность ПВТ зависели от результатов лабораторных исследований.
В качестве хируругических методов профилактики и лечения эрозий и изъязвлений кератотрансплантата мы применяли трансплантацию амнио-тической мембраны (ТАМ) с фиксацией непрерывным швом или мягкой кон-тактной линзой (МКЛ). Использовали пластифицированную амниотическую мембрану «Флексамер» (г. Самара) или обработанную по J. Kim и S. Tseng (1997) и лиофилизированную и консервированную на силикагеле в условиях Глазного Банка МНИИ ГБ им. Гельмгольца. В некоторых случаях длительного сохранения глубоких дефектов роговицы проводили трансплантацию алло-генных культивированных фибробластов (ТАФ), полученных в Институте биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН. При прогнозировании развития ПЭР, отрицательной динамике деструктивного процесса, лагофтальме, завороте, трихиазе, ксерозе, проводили временную (на 3-6 недель) или кровавую срединную или латерально-медиальную (на 6-12 и более месяцев) блефарорафию.
Иммунологические исследования проводились на базе лаборатории иммунологии и вирусологии (рук. лаборатории — д.б.н., проф. Слепова О.С.).
Тест-пробами служили: роговица реципиента и донора, слезная жид-кость (СЖ), лейкоциты и сыворотка (СК ) крови реципиента.
Сроки обследования определялись с учетом закономерностей развития иммунного ответа на хирургическую травму: перед операцией, на 8,14, 21, 28-ой дни после КП (± 1 день), затем 1 раз в месяц в ходе клинико-иммуно-логического мониторинга.
Клеточный иммунный ответ на антигены роговицы исследовали с помощью реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ). В качестве антигенного препарата использовали водно-солевые экстракты роговицы.
Цитокины исследовали в СК с помощью ИФА («Вектор-Бест») и в СЖ оперированного и парного глаз (40 случаев) ? с помощью мультиплексного анализа (на проточном цитометре в программе BD FACSDiva). Определяли концентрацию 15 цитокинов одновременно: IL1?, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 17, 18; TNF?, ?; VEGF-А, IFN?, IFN?. Контроль — пробы СЖ (10) и СК (30) от практи-чески здоровых людей.
Диагностика герпес-вирусных инфекций (ВПГ 1 и 2 типа, ЦМВ, ВЭБ, ВГЧ 6 и 7 типа) включала ПЦР-исследование донорского материала (46 роговиц), роговиц (74 образца) и крови (42 пробы) реципиента (совместно с лабора-торией молекулярной диагностики Института молекулярной генетики РАН; зав. лаб. — к.м.н. Демкин В.В.) и серологические тесты (ИФА, «Вектор-Бест»», «Биосервис») с определением маркеров хронической (IgG–антитела (ат) к структурным антигенам) и активной инфекции (IgM–ат и IgG-ат к ранним неструктурным вирусным антигенам) в динамике п/о периода (от 2 до 12 раз).
Анализ зависимости исходов КП от иммунологических показателей проводился ретроспективно. Сроки наблюдения большинства пациентов составили от 7 месяцев до 3 лет и более (90 случаев, 84,1%).
Статистическая обработка полученных данных проведена по программе «Биостат-1999»; использовали критерии ??, Фишера, Стьюдента.
Результаты собственных исследований.
Для оценки скорости закрытия эпителиального дефекта после КП и роли данного фактора в развитии осложнений нами были введены следующие тер-мины: «первично персистирующая эрозия трансплантата роговицы» (ППЭР) (эпителиальный дефект, сохранявшийся более 10 дней после опера-ции, вплоть до 1 мес.); «длительно первично персистирующая эрозия тран-сплантата роговицы» (ДППЭР) (эрозия, сохранявшаяся дольше 1 месяца пос-ле операции); «персистирующая эрозия трансплантата роговицы» (ПЭР) (эрозия, возникшая спустя время после завершения эпителизации в сроки до 10 дней после КП), в том числе ПЭР «ранние» и ПЭР «отдаленные» (возникшие до 6 мес. или после 6 мес., соответственно); «рецидив персисти-рующей эрозии роговичного трансплантата» (РПЭР) (повторно возник-шая ПЭР).
Рис.3. Сроки завершения эпителизации трансплантата и частота развития осложнений в раннем и отдаленном п/о периоде (%).
Рис.4. Влияние иммуносупрессии ЦСА на развитие ПЭР и исходы КПВР.
Частота развития осложнений в раннем и отдаленном п/о периоде также напря-мую зависела от скорости эпителизации и достигала максимума в первые 6 месяцев у пациентов с ППЭР (рис.3).
Исследования показали, что острота патологического процесса роговицы является фактором риска развития осложнений и неудач КП. Экстренная КП по поводу язвы, перфорации сопровождалась более частым возникновением ППЭР (46,3%) и РПЭР (20,4%) по сравнению с плановыми операциями — 30,2% и 9,4% соответственно (табл.2). В частности, при выполнении КП на фоне ожоговой болезни, системных заболеваний частота рецидивов ПЭР достигала 100%. После КП по поводу инфекционного деструктивного процесса эрозии впоследствии возникли в 51% (в 24 случаях из 47).
В то же время этиология бельма существенно не влияла на п/о период и исходы КП: своевременное завершение эпителизации и отсутствие ПЭР в дальнейшем, как при воспалительной этиологии бельма, так и при ожоговой, наблюдали с примерно одинаковой частотой — 58,9% и 55,2% случаев соответ-ственно (табл. 3).
Рис.5. Частота выявления (%) положительной РТМЛ на антигены роговицы перед КП и в динамике п/о наблюдения больных при разных сроках возникно¬вения ПЭР.
Рис. 6. Соотношение уровней цитокинов в слезной жидкости оперированного и парного глаз при наличии и отсутствии ПЭР.
Общепринятым является мнение, что каждая последующая КП является менее благоприятной. Однако в наших исследованиях мы не нашли этому под-тверждения: частота удачной трансплантации после 1-й пересадки составила 60,3%, после 2-й — 33,3%, после 3-й — 66,7%, после 4-й — 75%. Мы полагаем, что это явилось следствием проведения строго индивидуальной предопе-рационной, интраоперационной и п/о лечебной тактики при повторной КП.
Большой диаметр трансплантата (более 9 мм) и консервация его мето-дом лиофилизирования также является фактором риска нарушения эпители-зации. В этих случаях КП всегда сопровождалась ППЭР, ДППЭР, РПЭР в течение всего срока наблюдения (до 2-х лет).
Анализ результатов применения ЦСА показал, что эта схема иммуно-супрессии, значительно улучшая отдаленные результаты КПВР, может быть и фактором риска развития ПЭР: прием препарата (в стандартной дозе) увели-чивал частоту случаев ППЭР и РПЭР. Учитывая использованные нами лабораторные исследования, мы полагаем, что это может быть связано с активацией вирусной инфекции организма и отсутствием ПВТ (рис. 4).
Таким образом, нами выявлены клинические факторы риска развития эрозий роговицы и их рецидивов при КПВР. При наличии этих факторов мы предлагаем проведение хирургических методов профилактики. С этой целью использовали аутоконъюнктивальную пластику в завершении КП (7 случаев).
Для профилактики и лечения ППЭР и РПЭР у 36 пациентов мы использо-вали ТАМ. В случае выявления клинических факторов риска перед КП (язва, перфорация роговицы или трансплантата на фоне системных заболеваний, синдрома «сухого глаза», ЛКН, рецидивирующего герпетического кератита) ТАМ носила профилактический характер и ею завершали операцию (7 случа-ев). Эффективность — 100%. С лечебной целью ТАМ проводили при уже раз-вившейся эрозии или ее рецидиве, в том числе у 9 пациентов в раннем п/о пе-риоде, у 26 больных — в отдаленном периоде. Эффективнось в этих случаях не превышала 50-60%. Особенностью применения ТАМ была фиксация транс-плантата кисетным швом 10-0 к лимбальной зоне, дополнительная фиксация с помощью МКЛ («Pure vision», «Focus»), временная блефарорафия, смена транс-плантата через 5-7 дней. Эффективность операции в целом составила 86%.
В особо тяжелых случаях при отсутствии донорского материала мы использовали клеточные технологии — ТАФ (6 случаев). В 4-х случаях был дос-тигнут органосохранный эффект, что позволило провести повторную КП при более благоприятных условиях.
При отсутствии эффекта от ТАМ мы проводили кровавую блефарорафию (24 случая), чаще всего в завершении операции (14 случаев). В случаях един-ственного перспективного глаза при тех же условиях КП завершали форми-рованием латерально-медиального постоянного анкилоблефарона (5 случаев), что позволило нам избежать п/о осложнений и сохранить прозрачность транс-плантата. В 22 из 24 случаев мы добились эпителизации трансплантата.
По нашему мнению, основными способами профилактики и лечения эрозий трансплантата являются хирургические. Однако даже при активной хирургической тактике нам не удалось избежать случаев нарушения репарации кератотрансплантата, в том числе возникавших при отсутствии определенных нами клинических факторов риска. Данное обстоятельство послужило обосно-ванием для дальнейших клинико-иммунологических исследований с целью выявления других возможных причин развития ПЭР и их рецидивов.
Результаты иммунологических исследований.
Рис. 7. Частота обнаружения ДНК вирусов группы герпеса (ПЦР) в образцах удаленной ткани реципиентов при разной природе поражения роговицы.
Рис. 8. Частота выявления ПЦР-позитивных тест-проб при наличии и отсутствии П в раннем и отдаленном п/о периоде.
Полученные данные позволяют говорить об этиопатогенетической роли аутоиммунного компонента в случаях раннего развития ПЭР и подтверждают необходимость применения иммуносупрессивных средств.
Вместе с тем, ретроспективный анализ показал, что подавление с помощью ЦСА нежелательных аутоиммунных реакций далеко не всегда обеспечивало благоприятное течение п/о периода и хороший исход КП .
Роль нарушений цитокинового статуса. Известно, что развитию аутосенсибилизации способствует усиление системной продукции ряда цитокинов (прежде всего– IL2, IFN? ,TNF?). В зависимости от содержания их в СК после КП, наши пациенты были разделены ретроспективно на умеренно-, гипер- и ареак-тивных (ориентируясь на данные Балаян Т.Г., 2008). Анализ показал, что у гиперреактивных больных осложнения наблюдались значительно чаще (67%), чем у умереннореактивных (29%; р=0,047). Это явилось дополнительным показанием для назначения ЦСА. Известно, что главной точкой приложения ЦСА является IL2 и, опо-средованно, подавление аутоиммунных реакций, развитию которых способствует его гиперсекреция. Наиболее часто неблагоприятное течение п/о периода (85%; р=0,04) наблюдалось при «цитокиновой ареактивности». Последняя могла быть одним из проявлений вторичного иммунодефицита, характерного для «ожоговых» больных и тяжелого офтальмогерпеса, и/или следствием активной иммуносупрессии без противовирусного прикрытия.
Возникновению ПЭР способствовали и локальные нарушения цитокино-вого статуса, о чем свидетельствовали результаты мультиплексного анализа СЖ.
Установлено, что развитие ПЭР ассоциировалось с явным дисбалансом между повышением в СЖ уровней «патогенных» цитокинов (таких как провоспалительные IL6,IL8 и ангиогенный VEGF), и дефицитом «защитных», обычно присутствующих в нормальной слезе, в частности интерферонов (IFN?, IFN?) и антивоспалительных IL4, IL10. Характерно, что пониженное содержание последних в СЖ глаз с ПЭР отмечалось не только при сравнении с контролем, но и с неоперированным глазом. В группе больных без ПЭР уровни цитокинов в СЖ оперированного глаза были лишь незначительно ниже, чем в парном глазу (в большинстве случаев), а по некоторым цитокинам заметно превышали последний (рис.6).
Причиной нарушений локального цитокинового статуса могут быть как тяжесть поражения тканей глаза, продуцирующих цитокины (эпителий, слезная железа и др.), так и неадекватность стандартной схемы консервативного лечения, не учитывающей индивидуальные характеристики местного иммунного ответа на КП.
Роль инфекционных факторов. Серодиагностика показала, что у всех больных выявлялись IgG-ат, свидетельствующие об инфицированности несколькими вирусами герпеса (ВПГ 1и/или 2; ЦМВ — 97,1 %; ВЭБ — 96,9%; ВГЧ6 — 83,8%), что соответствует их широкому распространению в популяции взрослых лю-дей. Маркеры острой или реактивации хронической инфекции чаще всего обнаруживались на фоне активной системной иммуносупрессии (применение ЦСА без прикрытия ПВТ — 62,5 %, при использовании ПВТ — 50,0 %), у пациентов не применявших ЦСА и ПВТ — вдвое реже — в 31,2% (р=0,013).
Выявлена связь между возникновением ПЭР спустя 6 мес. и более после КП и длительной (суб)клинической активацией инфекции. Соответствующие маркеры (IgG-ат к ранним вирусным антигенам) выявлялись при «отдаленных» ПЭР примерно вдвое чаще, чем в отсутствии ПЭР или при «ранних» ПЭР. Наибольшее значение имели ВПГ1 ( 67,6%, в сравнении с 34-38%; р = 0,039 ) и ЦМВ (44,1% , в сравнении с 14-20%; р=0,033). Следует, однако, подчеркнуть, что IgM-ат («классические» маркеры острой инфекции) чаще всего обнару-живались при наиболее раннем возникновении дефектов трансплантата (ППЭР), особенно к ЦМВ.
Рис. 9. Анатомические исходы (А) и острота зрения (Б) после КПВР в зависимости от применения ПВТ в сочетании с иммуносупрессией ЦСА и без нее.
Таблица 1. Распределение случаев по этиологии, остроте патологического процесса и степени помутнения роговицы.
Данные по изучению роли этого вируса при заболеваниях глаз единич-ны (Qavi H.B. et al.,1996; OkunoT. et al., 2011), а в аспекте КП отсутствуют.
Необходимо подчеркнуть, что ПЦР-положительными оказались не только фрагменты собственной роговицы реципиента (15 из 52; 25,4%) , но и 7 из 22 (31,8%) трансплантатов, удаленных при реКП, что можно объяснить изна-чальным присутствием в них ДНК вирусов герпеса. Это согласуется с результа-тами исследования донорского материала: 28,8 % ПЦР — позитивных образцов. Вместе с тем, нельзя исключить вероятность эндогенного инфицирования пере-саженной донорской роговицы, особенно в условиях обострения хронических инфекций на фоне иммуносупрессивной терапии. Такой «двойной» риск обсуждается и другими исследователями (Stavidis E. et al., 2012).
Анализ зависимости осложнений КП от результатов ПЦР-диагностики показал, что у больных с «ранними» ПЭР чаще, чем у остальных, выявлялись вирусные ДНК в роговице реципиента (на 15 %) и донора (на 20%). Связи с присутствием ДНК вирусов герпеса в крови выявлено не было (рис.8).
Параллельное ПЦР-исследование роговиц реципиента и донора (46 слу-чаев) показало, что при наличии вирусных ДНК в обоих образцах ПЭР разви-лись во всех случаях (4 из 4), если только у донора — незначительно реже (4 из 6), а только у реципиента — заметно реже (4 из 9). Последнее мы объясняем удалением инфицированной ткани при КП. Если оба образца оказались ПЦР-негативными, осложнения наблюдались в 9 из 27 случаев (33,3%). Вероятно, их развитию способствовали другие факторы (клинические и/или этиопато-генетические, возможно — неисследованные нами вирусы, аутоиммуннные реакции, и т.д.).
Ретроспективный анализ зависимости исходов КП от результатов ПЦР в целом показал, что при наличии ДНК вирусов герпеса в крови неблаго-приятный исход имел место в 35,8%, при обнаружении их в роговице реципиен-та и/или донора — значительно чаще (в 65,4% ; ?2= 13,06; р=0,001).
Таким образом, обобщение результатов клинико-иммунологического мониторинга свидетельствует о том, что возникновение ПЭР в первые недели после операции (до 1-1,5 месяцев) ассоциируется с пред- и п/о на-пряженностью аутоиммунитета и/или обострением на фоне приема ЦСА герпесвирусной инфекции (ГВИ), преимущественно ЦМВ (реже ВЭБ или другой). Развитие ПЭР спустя 1,5 — 2 месяца и позже сопряжено с присутствием ДНК вирусов герпеса в роговице (особенно — в трансплантате ) и длительной (суб)кли-нической активацией инфекции на уровне всего организма; в ряде случаев — с последующим присоединением аутоиммунного компонента, на фоне нарушений цитокинового статуса (местного и систем-ного).
Эти данные послужили базой для применения предложенной нами схемы патогенетически ориентированной терапии (иммуносупрессия + ПВТ). Пока-занием к назначению ЦСА явились: положительная РТМЛ (на антигены рого-вицы) до и/или после КП; гиперреактивность (по уровню цитокинов в СК). Показаниями к проведению ПВТ служили: иммуносупрессия ЦСА — на весь срок иммуносупрессии; герпетическая офтальмо и/или экстраокулярная инфекция в анамнезе (перед КП — и в п/о периоде в течение 1 месяца: прием валтрекса (ацикловир) по 1000 мг в сутки) (профилактическая схема); выявление серологических маркеров активности ГВИ было показанием к лечебной схеме ПВТ (валтрекс (ацикловир) по 1000 мг в сутки + местно мазь зовиракс 2 раза в день). Контролем продолжительности ПВТ и её эффективности служили лабораторные показатели (ПЦР, ИФА, ежемесячно).
Оценка эффективности разработанной схемы терапии показала, что иммуносупрессия ЦСА с одновременной ПВТ способствовали уменьшению частоты развития ПЭР как в раннем, так и в отдаленном п/о периоде. Это положительно отразилось на анатомических и функциональных результатах лечения: частота прозрачного и полупрозрачного приживления трансплантата повысилась на 19%, случаев язв трансплантата не было; острота зрения более 0,02 в отдаленном периоде возросла на 15% (рис. 9, А и Б).
Табл.2. Характер течения послеоперационного периода при различной остроте патологического процесса в роговицеТаблица 1. Распределение случаев по этиологии, остроте патологического процесса и степени помутнения роговицы.
Табл.3. Характер течения послеоперационного периода при различной этиологии поражения роговицы до керотопластики.
Выводы:
1. ПЭР, возникающие у больных, перенесших КПВР, значительно (в целом на 43,4%) повышают частоту неблагоприятных исходов хирургического лечения. При развитии данного осложнения в раннем п/о периоде (до 6 мес. после операции) мутное приживление кератотрансплантата отмечается реже (63%, в равнении с 80% при отдаленных).
2. Клиническими факторами, способствующими возникновению ПЭР после КПВР, являются: острота патологического процесса в роговице до операции; удаление эпителия с роговицы донора перед пересадкой ее реципиенту; отсутствие эпителизации более 10 дней; применение ЦСА без ПВТ.
3. Риск развития ПЭР повышается: в 3-4 раза — при проведении КП на фоне «положительной» РТМЛ и поддержании напряженности аутоиммунитета в п/о периоде; в 2-3 раза — при продолжительном повышении уровня большинства цитокинов (гиперреактивность); в 3 раза — при полном их отсутствии в сыворотке после КП (ареактивность ); при местном (СЖ) дисбалансе провос-палительных (повышение уровня IL8,6) и защитных (дефицит IFN?, IL4,10) цитокинов.
4. Установлена этиопатогенетическая роль вирусов группы герпеса в развитии ПЭР после КПВР. Определены критерии риска: наличие ДНК вирусов груп-пы герпеса в роговице реципиента (44,4%) или донора (38,5 %), и, особенно, в обеих тканях (100%), в сравнении с 30,5 % и 23,8%, соответственно, при отсутствии осложнений; острая или длительная активация хронической ГВИ, подтвержденная результатами серологических исследований в динамике.
5. Разработанная тактика хирургического и консервативного лечения, основанная на комплексном применении иммуносупрессивной и ПВТ в усло-виях клинико-иммунологического мониторинга, позволила оптимизировать характер течения раннего и отдаленного п/о периода и улучшить (на 19%) отдаленные результаты и исходы КПВР.
Практические рекомендации:
1. При наличии факторов риска развития ПЭР при КПВР необходимо проведение профилактических хирургических мероприятий — ТАМ, ТАФ, аутотенонопластики, временной или кровавой блефарорафии.
2. Выявление гиперреактивных и ареактивных (по уровню цитокинов в сыворотке крови) пациентов необходимо для назначения адекватной иммуносупрессивной терапии или полной ее отмены (соответственно).
3. Назначение ЦСА требует обязательного прикрытия противовирусными препаратами (местно и системно) в течение всего срока выявления серологи-ческих маркеров активности ГВИ.
4. Наличие ДНК вирусов группы герпеса в роговице реципиента является показанием для назначения ПВТ.
5. Предоперационная подготовка донорского материала должна включать расширенную ПЦР-диагностику на вирусы группы герпеса и обязательную его выбраковку при положительных тестах.
6. Значительное уменьшение содержания «защитных» цитокинов (интерферонов, антивоспалительных) в СЖ оперированного глаза, по сравнению с парным глазом, требует осторожности в применении иммуносупрессивных средств и снижения их объема.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1.Макаров П.В., Гундорова Р.А., Кугушева А.Э., Данилова Д.Ю. «Аутолимбальная трансплантация у детей с бельмами ожоговой этиологии». //IV Российский общенациональный офтальмологический форум 2011. Сборник научных работ, Том 1, стр.138-139.
2.Миронкова Е.А., Садохина Т.С., Демкин В.В., Слепова О.С., Макаров П.В., Кугушева А.Э. «Актуальность параллельного ПЦР-исследования и серодиагностики герпесвирусных инфекций у больных с тяжелой патологией роговицы». //там же, Том 2, стр.330-334.
3. Гундорова Р.А., Макаров П.В., Кугушева А.Э. «Пролиферативный синдром при ожоговой болезни глаз». // VII международная научно-практическая конференция «Пролиферативный синдром в офтальмологии», Москва, 29-30 ноября 2012 г. Сборник научных трудов.. Стр. 37-39.
4.Быков В.П., Гундорова Р.А., Слепова О.С., Кугушева А.Э., Макаров П.В., Данилова Д.Ю. «Реконструктивная кератопластика как способ лечения посттравматической субатрофии глазного яблока после комбинированной сочетанной минно-взрывной травмы».//VI Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии. Материалы конференции. Екатеринбург, 2012, стр. 280-282.
5.Кугушева А.Э., Селиверстова К.Е., Макаров П.В., Данилова Д.Ю. «Острый кератоконус: лечение как подготовка к сквозной кератопластике». //там же, стр. 89-90.
6.Кугушева А.Э., Гундорова Р.А., Макаров П.В., Данилова Д.Ю. Отдаленные результаты аутолимбальной трансплантации у детей с бельмами ожоговой этиологии.// «Восток-Запад». Материалы конференции, Уфа, 7–8 2012, стр.388.
7.Кугушева А.Э., Слепрва О.С., Демкин В.В., Макаров П.В., Миронкова Е.А., Садохина Т.С. «О влиянии герпесвирусных инфекций на результаты приживления роговичного трансплантата при кератопластике высокого риска».// VII Всероссийская научная конференция молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии», 19 июня 2012 года, ФГБУ «МНТК»Микрохирургия глаза»им.акад.С.Н.Федорова, стр.116-117.
8.Данилова Д.Ю., Гундорова Р.А., Кугушева А.Э., Макаров П.В. «Лечение ожоговых бельм с конъюнктивизацией роговицы у детей с односторонним поражением»//Труды Всероссийской конференции, посвященной 110-летию со дня рождения Т.И. Ерошевского, г. Cамара, стр.428-429.
9.Слепова О.С., Миронкова Е.,А., Макаров П.В., Кугушева А.Э. «Инфицированность роговиц донора и/или реципиента вирусами группы герпеса как возможная причина развития болезни трансплантата при сквозной кератопластике»//там же, стр.272-274.
10.Гундорова Р.А., Макаров П.В., Слепова О.С., Кугушева А.Э. «Развитие персистирующих и рецидивирующих эрозий роговицы после сквозной кератопластики высокого риска»//V Российский общенациональный офтальмологический форум, Москва 2012, том 1, стр.160-161.
11.Миронкова Е.А, Макаров П.В., Слепова О.С., Гундорова Р.А., Кугушева А.Э., Демкин В.В., Садохина Т.С. «Инфицированность донорского материала вирусами группы герпеса как возможная причина неблагоприятных исходов сквозной кератопластики»// там же, том 2, стр.762-766.
12.Макаров П.В., Слепова О.С., Кугушева А.Э., Миронкова Е.А «Причины неудач при кератопластике высокого риска и роль иммунологического мониторинга в оптимизации результатов лечения».//Материалы научно-практической конференции офтальмологов с международным участием «Филатовские чтения », 23-24 мая 2013года, Одесса, Украина. Стр.34-35.
13.Макаров П.В., Степанов А.В., Гундорова Р.А., Соловьева А.В., Кугушева А.Э.«Комплексное лечение постожоговой глаукомы».// Сборник научных трудов научно-практической конференцмм по офтальмохирургии с международным участием «Восток-Запад 2013», 6-7 июня, г.Уфа, Башкортостан, Стр.414-415.
14.Быков В.П., Макаров П.В., Чекалова М.В., Кугушева А.Э. «Травмы глаза пиротехническими средствами».//Медицина катастроф, 2011, №3(75), стр.23-25.
15.Гундорова Р.А., Ченцова Е.В., Макаров П.В., Кугушева А.Э., Ракова А.В. «Опыт пересадки обезвоженной роговицы». // Вестник офтальмологии, 2011, №4, Стр.59-62.
16.Соловьева А.В., Гундорова Р.А., Степанов А.В.,Макаров П.В., Кугушева А.Э. «Некоторые приемы купирования гипертензии при вторичной глаукоме после тяжелой ожоговой травмы глаза». //Офтальмология, 2012, том 9, номер 3, стр. 41-45.
17.Миронкова Е.А., Демкин В.В., Слепова О.С., Садохина Т.С., Макаров П.В., Кугушева А.Э. «Диагностика и роль ВГЧ-6 инфекции при кератопластике высокого риска» // Российский офтальмологический журнал, 2012, №3, г., стр. 30-34.
18.Миронкова Е.А., Макаров П.В., Слепова О.С., Гундорова Р.А., Кугушева А.Э., Демкин В.В., Садохина Т.С. «Инфицированность донорского материала вирусами группы герпеса как возможная причина развития болезни трансплантата при сквозной кератопластике».//Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2012, №4, стр. 48-52.
19.Гундорова Р.А., Макаров П.В., Терских В.В., Васильев А.В., Ходжабекян Г.В., Иванов А.А., Федоров Д.Н., Шинин В.В., Кугушева А.Э. «Разработка технологии лечения дефектов роговицы методом трансплантации культивированных аллогенных фибробластов в коллагеновом геле (эксп. исследование)».// Российский офтальмологический журнал, 2013,.-Т.6, №1, с.64-68.
20.Слепова О.С., Кугушева А.Э., Миронкова Е.А., Быков В.П., Макаров П.В. "Роль иммунологического мониторинга в оптимизации результатов кератопластики высокого риска" // Материалы Юбилейной конференции "Современные технологии диагностики и лечения при поражениях органа зрения",12-13сентября2013года,г.Санкт-Петербург,стр.122-123.
21. Кугушева А.Э., Гундорова Р.А., Слепова О.С., Макаров П.В., Миронкова Е.А. "Неудачи сквозной кератопластики высокого риска: клинико-иммунологические факторы риска и возможности их нейтрализации".//VI Российиский общенациональный офтальмологический форум, сборник научных трудов научно-практической конференции с международным участием, Москва, 1-3 октября 2013 года, том 1, стр. 146 — 149.
22. Куликова И.Г., Слепова О.С., Макаров П.В., Ковалева Л.А., Кугушева А.Э. "Дисбаланс субпопуляционного состава лимфоцитов крови как фактор риска органоспецифической сенсибилизации при воспалительной и посттравматической патологии глаз".//там же, том2, стр.641 — 645.
Патенты по теме диссертации:
1.«Способ определения показаний к иммуносупрессивной терапии после сквозной кератопластики». Слепова О.С., Макаров П.В., Кугушева А.Э., Миронкова Е.А. (№ 2471195 от 27.12.12, Бюл. № 36); 2. «Способ прогнозирования болезни трансплантата после сквозной кератопластики». Слепова О.С., Демкин В.В., Макаров П.В., Кугушева А.Э., Миронкова Е.А. , Садохина Т.С. (№ 2472160 от 10.01.13, Бюл. № 1).
Список сокращений:
ат — антитело
ВГЧ 6,7 — вирус герпеса человека 6,7 типа
ВПГ 1,2– вирус простого герпеса 1,2 типа
ВЭБ — вирус Эпштейнa-Барр
ГВИ — герпесвирусная инфекция
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
ДППЭР — длительно персистирующая эрозия роговицы
КП — (сквозная) кератопластика
КПВР — (сквозная) кератопластика «высокого риска»
МКЛ — мягкая контактная линза
ОГ — оперированный глаз
ПГ — парный глаз
ПВТ — противовирусная терапия
п/о — послеоперационный
ППЭР — первично персистирующая эрозия роговицы
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ПЭР — персистирующая эрозия роговицы
РОТ — реакция отторжения трансплантата
РПЭР — рецидив персистирующей эрозии роговицы
РТМЛ — реакция торможения миграции лейкоцитов
СЖ — слезная жидкость
СК — сыворотка крови
ТАМ — трансплантация амниотической мембраны
ТАФ — трансплантация аллогенных фибробластов
ЦМВ — цитомегаловирус
ЦСА — циклоспорин А
IL — интерлейкины
IFN- интерфероны
TNF —факторы некроза опухоли
VEGF — фактор роста эндотелия сосудов
