Роль факторов патологического ангиогенеза в патогенезе ретинопатии недоношенных. Клинико- экспериментальное исследование.

    Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

    Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Катаргина Людмила Анатольевна

    

Общая характеристика работы

    Актуальность проблемы

    Ретинопатия недоношенных (РН) остается одной из ведущих причин слепоты в детском возрасте, несмотря на разработку и активное применение современных стандартов диагностики и лечения данной патологии. Частота развития РН в группе риска по данным разных авторов составляет 11,96-47%. (Садовникова Н.А., Бржеский В.В., 2017, Сайдашева Э.И., 2014, ParkS.H., 2016, Holmstrom 2017, HolmM. 2017, ZhuX. 2017). Во многом проблема РН решена путем внедрения в широкую практику профилактических осмотров пациентов группы риска и проведения лазеркоагуляции (ЛК) аваскулярных зон сетчаткив пороговой стадии заболевания. В зависимости от локализации и степени активности заболевания, эффективность ЛК составляет 65-98% (Нероев В.В., Катаргина Л.А., Коголева Л.В., 2013, 2015). РН I зоны и задняя агрессивная форма РН (ЗАРН), характерные для глубоконедоношенных детей, часто резистентны к традиционной ЛК, что является одним из актуальных вопросов в проблеме РН на сегодняшний день.

     Многие офтальмологи рассматривают анти-VEGF терапию как метод выбора при РН I зоны и ЗАРН (StahlA., 2019, SankarM., 2018, LiZ., 2018, Mintz-HittnerH., 2011). Однако блокирование только лишь VEGF не может полностью подавить патологический ангиогенез, так какв процессе задействованы и другие факторы, о чем свидетельствуют рецидивы РН в отдаленном периоде.

    Кроме того, актуальной проблемой является оптимизация профилактических осмотров. Организация скрининга детей группы риска - очень затратное и трудоемкое мероприятие, при том, что не более 10% пациентов достигают стадии заболевания, требующей лечения. В связи с этим крайне актуальным является поиск прогностических факторов течения заболевания, что позволит оптимизировать тактику наблюдения.

    Регуляция ангиогенеза осуществляется сложной системой взаимодействующих факторовроста, компонентов нейроэндокринной системы и цитокинов. Их изучение представляет собой перспективное направление исследований, учитывая сложный плейотропный характер их свойств и зачастую противоречивость имеющихся на сегодняшний день данных. В частности, активно изучается роль нарушений иммунного статуса недоношенных детей в этиопатогенезе РН (Катаргина Л.А., Слепова О.С., Осипова Н.А., 2015, Катаргина Л.А., Белова М.В., 2011, 2012; Балашова Л.М., 2018; Скрипец П.П., 2003; 2010; Silveira R., 2011, Kurtul B.E., 2015). Сравнительно недавно стала изучаться роль моноаминов в регуляции ангиогенеза. Работы, посвященные изучению их участия в развитии вазопролиферативных заболеваний сетчатки, немногочисленны и в основном касаются изучения роли адренорецепторов и норадреналина (Ristori, 2011, Makhoul, 2013).

    Таким образом, актуальным является дальнейшее изучение патогенеза РН с поиском новых и совершенствованием имеющихся методов своевременной диагностики и лечения заболевания.

    Цель исследования: изучение роли моноаминов и комплекса цитокинов в патологической вазопролиферации при РН в эксперименте и клинике.

    Задачи исследования:

    1. Изучить частоту развития и тяжесть ретинопатии недоношенных при современных условиях выхаживания и уточнить основные факторы риска развития заболевания у глубоко недоношенных детей.

    2. Исследовать концентрацию биогенных аминов в сыворотке крови и сетчатке новорожденных крысят в норме и при развитии экспериментальной ретинопатии недоношенных (ЭРН).

    3. Исследовать концентрацию биогенных аминов в плазме крови недоношенных детей группы риска развития РН и оценить их возможную роль в патогенезе РН.

    4. Оценить взаимосвязь показателей концентрации цитокинов и ростовых факторов в плазме крови недоношенных детей с развитием и особенностями течения РН.

    5. Проанализировать роль биогенных аминов и ростовых факторов в патогенезе РН с целью разработки новых патогенетически обоснованных путей влияния на ее развитие и течение.

     Научная новизна

    1. На большом клиническом материале (678 недоношенных детей) выявлено, что при современных условиях выхаживания частота развития ретинопатии недоношенных составляет 28,5% среди детей группы риска, достигая 77% у глубоконедоношенных детей. Частота пороговых стадий составила 7,2% среди всех детей группы риска. Впервые установлено, что в группе глубоко недоношенных детей с массой тела при рождении до 1000 г не всегда присутствует четкая связь развития РН с изученными клиническими факторам риска, что может свидетельствовать о некоторых патогенетических особенностях РН в разных группах.

    2. Впервые на модели ЭРН на крысятах выявлено снижение предшественника дофамина L-ДОФА в сетчатке и крови крысят и максимальное падение его концентрации на пике неоваскуляризации. При ЭРН уровень ретинального норадреналина значительно повышается, достигая максимальных значений при появлении начальной патологической вазопролиферации, что свидетельствует о важной роли L-ДОФА и норадреналина в ангиогенезе.

    3. Впервые проведен анализ содержания моноаминов (дофамин, норадреналин, серотонин) в плазме крови детей группы риска по развитию РН. В группе детей с РН с постконцептуальным возрастом (ПКВ) до 35 нед. в плазме выявлен более низкий уровень серотонина по сравнению с детьми без РН, а такжетенденция к повышению содержания норадреналина по мере прогрессирования РН.

    4. Впервые изучен развернутый системный цитокиновый статус (47 показателей различного биологического действия) недоношенных детей группы риска развития РН и проведен сравнительный динамический анализ исследуемых показателей в клинических группах в зависимости от развития и течения заболевания. Установлено, что до манифестации заболевания (на этапе выявления аваскулярных зон на глазном дне) определяется более высокий уровень MCP1 и более низкий уровень TGFβ1 в крови у детей с развившейся впоследствии РН, что позволяет рассматривать данные показатели как новые факторы риска развития РН. Обнаружено повышенное содержание VEGF-A, TGFβ2, PDGF-BB в начальных стадиях РН у детей с развившейся впоследствии пороговой РН, что также может служить прогностическим признаком неблагоприятного течения заболевания.

    Теоретическая и практическая значимость

    1. Подтверждено, что основными факторами риска развития РН по-прежнему остаются низкие гестационный возраст и масса тела при рождении, длительная ИВЛ. У детей с более высокой массой тела при рождении (более 1000 г) частота развития тяжелых форм РН коррелирует с наличием некротизирующего энтероколита (НЭК) и внутрижелудочковых кровоизлияний (ВЖК). У детей с ЭНМТ частота развития РН не имеет четкой зависимости от клинических факторов риска, что свидетельствует об особенностях течения заболевания в этой группе.

    2. Доказано, что патологическая вазопролиферация при ЭРН сопровождается снижением концентрации L-ДОФА в крови и сетчатке, что говорит о важной роли L-ДОФА в регуляции ангиогенеза и ставит вопрос о разработке новых подходов к терапии РН.

    3. В качестве прогностических критериев развития РН до манифестации заболевания могут быть использованы повышение уровня MCP1 (>95 пг/мл) и снижение TGFβ1 (< 18000 пг/мл) в плазме крови. На этапе I-II стадий РН в качестве предикторов дальнейшего неблагоприятного течения заболевания могут служить повышенный уровень VEGF-A (>108 пг/мл), TGFβ2 (>100 пг/мл), PDGF-BB (>1800 пг/мл), нарастание уровня норадреналина, а также более низкий уровень серотонина (<17,0 пг/мл) в крови.

    Методология и методы исследования

    Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне проспективного открытого сравнительного нерандомизированного исследования с использованием экспериментальных, клинических, инструментальных и статистических методов.

    Положения, выносимые на защиту

    1. Частота развития РН при современных условиях выхаживания составляет 28,5% среди всех детей группы риска, достигая 77% у детей с ЭНМТ. Прогрессирование РН до пороговых стадий происходит у 7,2% из всех детей группы риска и у 32% глубоконедоношенных детей. У детей с массой тела при рождении более 1000 г развитие и тяжесть РН коррелируют с длительностью ИВЛ, НЭК и ВЖК. У глубоко недоношенных детей частота развития РН в большей степени зависит от наличия БЛД, тогда как на тяжесть РН оказывают влияние длительность ИВЛ и наличие БЛД, что может объясняться патогенетическими особенностями ретинопатии при ранних сроках гестации.

    2. Впервые в эксперименте установлено, что норадреналин, дофамин и его предшественник L-ДОФА на местном уровне принимают участие в регуляции патологического ангиогенеза при ЭРН. Развитие неоваскуляризации при ЭРН сопровождается снижением системного уровня L-ДОФА.

    3. Впервые установлено, что у детей с РН на сроке 32-35 нед ПКВ отмечается более низкий уровень серотонина (<17,0 пг/мл) в плазме, а при прогрессировании заболевания отмечается тенденция к нарастанию уровня норадреналина, что говорит об участии данных катехоламинов в регуляции течения РН на системном уровне и может быть использовано для диагностических целей.

    4. Высокая концентрация MCP1 и низкая концентрация TGFβ1 в крови у детей позволяют выявить группу высокого риска развития РН до появления первых признаков заболевания, что может быть использовано для дифференцированной тактики наблюдения. Повышенное содержание TGFβ2, VEGF-A, PDGF-BB на этапе начальных стадий РН служит признаком неблагоприятного течения заболевания.

    Степень достоверности и апробация результатов работы

     Степень достоверности полученных результатов исследований определяется достаточным и репрезентативным объемом выборок исследований, работа выполнена с использованием современных методов обследования. Методы статистической обработки результатов адекватны поставленным задачам. Положения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, аргументированы и являются результатом многоуровневого анализа.

    Основные положения работы доложены и обсуждены на научно-практической конференции с международным участием: ”XI Российский общенациональный офтальмологический форум”, Москва, 2018 г.

    Публикации

    По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 4 - в печатных изданиях, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованный ВАК РФ.

    Внедрение в практику

    Результаты исследования внедрены в клиническую практику отдела патологии глаз у детей и детского консультативно-поликлинического отделений ФГБУ ”НМИЦ ГБ им. Гельмгольца” Минздрава России.

    Структура и объем диссертации

    Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Содержит 14 таблиц, 40 рисунков. Список литературы включает 238 источников, в том числе 34 отечественных и 204 зарубежных авторов.

    

Содержание работы

    Материалы и методы исследования

    Работа выполнена на базе отдела патологии глаз у детей (руководитель – профессор, д.м.н. Л.А. Катаргина) ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России (директор – академик РАН, профессор, д.м.н. В.В. Нероев), совместно с отделом иммунологии и вирусологии (начальник отдела, к.б.н. Н.В. Балацкая), научно-экспериментальным центром (руководитель – к.б.н. А.И. Щипанова), отделением патологической анатомии и гистологии глаза (руководитель – профессор И.П. Хорошилова-Маслова), отделом патофизиологии и биохимии (руководитель – профессор Н.Б. Чеснокова). Часть биохимических исследований были выполнены на базе лаборатории нервных и нейроэндокринных регуляций (руководитель - академик РАН, д.б.н., профессор М.В. Угрюмов) ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН (директор д.б.н. чл.-корр. РАН А.В. Васильев).

    Обследование недоношенных детей проводилось на базе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных (заведующая – к.м.н. А.С. Петрова) и отделения патологии новорожденных и недоношенных детей (заведующая – С.А. Трусова) ГБУЗ МО «Московский областной перинатальный центр» (главный врач – профессор, д.м.н. О.Ф. Серова), который соответствует всем современным требованиям по оснащению и выхаживанию недоношенных детей.

    Клиническая часть.Проведен анализ частоты развития и структуры РН у 678 детей группы риска, находившихся на лечении в Московском Областном перинатальном центре в 2017-2018 гг.

    Офтальмологическое обследование проводилось согласно принятому в России протоколу скрининга РН (Федеральные клинические рекомендации, 2015). Офтальмоскопическое обследование и лечение детей осуществлялось совместно с врачом-офтальмологом О.А. Шеверной.

     Для исследования цитокинового статуса было обследовано 44 недоношенных ребенка.У 14 детей иммунологические показатели были исследованы в динамике до развития и на фоне РН (от 2 до 4 раз). Всего исследовано 73 образца венозной крови. В 0,5 мл каждого из образцов методом мультиплексного анализа на проточном цитометре было исследовано содержание 45 цитокинов. Содержание TGFβ1 и TGFβ2в плазмебыло определенометодом ИФА. Иммунологическое исследование плазмы крови проводилось совместно со старшим научным сотрудником отдела иммунологии и вирусологии И.Г. Куликовой и лаборантом Н.С. Славинской под руководством начальника отдела, к.б.н. Н.В. Балацкой.

    Определение содержания моноаминов (дофамина, норадреналина и серотонина) было проведено 36 недоношенным детям (39 образцов плазмы) методом ИФА. Биохимические исследования выполнены совместно со старшим научным сотрудником отдела патофизиологии и биохимии к.м.н. Т.А. Павленко под руководством начальника отдела д.б.н. профессора Н.Б. Чесноковой. Забор образцов венозной крови осуществлялся у всех детей одновременно с плановым динамическим контролем биохимических показателей.

    Экспериментальная часть.Исследование выполнено на 59 крысятах породы Вистар на модели ЭРН (Катаргина Л.А., Хорошилова-Маслова И.П., Осипова Н.А., 2017г.). В опытную группу вошел 21 крысенок, у которых была воспроизведена ЭРН, в контрольную группу– 20 крысят, содержащихся в обычных условиях. Соблюдение условий эксперимента осуществлялись совместно с сотрудником научно-экспериментального центра старшим лаборантом Б.В. Витер под руководством к.б.н. А.И. Щипановой.

    Крысят выводили из эксперимента на 7-е (n=10), 14-е (n=10), 21-е (n=11) и 30-е (n=10) сутки. Всем крысятам в указанные сроки проводили бинокулярную энуклеацию и забор крови. В образцах сетчатки глаз и в крови определяли содержание норадреналина, дофамина и предшественника дофамина L-3,4 дигидроксифенилаланина (L-ДОФА). Выбор сроков энуклеации основывался на данных о нормальном ангиогенезе сетчатки крысят и о фазах развития ретинопатии в эксперименте. Энуклеация и забор образцов стекловидного тела проводились совместно с к.м.н. Н.А. Осиповой, биохимические исследования - совместно с научными сотрудниками лаборатории нервных и нейроэндокринных регуляций ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН к.б.н. Ю.О. Никишиной и к.б.н. А.Р. Муртазиной под руководством академика РАН, д.б.н., профессора М.В. Угрюмова.

    36 глазных яблок на 7-е, 14-е, 21-е и 30-е сутки подвергали гистологическому исследованию, которое проводилось совместно с сотрудником отделения патологической анатомии и гистологии глаза врачом-патологоанотомом А.М. Майбогиным под руководством профессора И.П. Хорошиловой-Масловой. Статистическая обработка результатов проводилась в программе IBM SPSS Statistics (версия 22) и с использованием статистического пакета Microsoft Excel. Статистическая обработка выполнена автором самостоятельно.

    Результаты исследований Анализ частоты и факторов риска развития РН при современных условиях выхаживания

    Анализ частоты и тяжести РН был проведен у 678 детей группы риска (табл. 1).

    РН была диагностирована у 193 из 678 детей группы риска (28,5%), в группе маловесных детей она достигала 75,5-87,5%. Частота пороговых форм РН увеличивается со снижением массы тела при рождении, достигая 32% среди всех детей с массой тела при рождении менее 1000 г.

    Для оценки влияния послеродовых факторов риска на развитие РН мы провели анализ длительности ИВЛ, наличия бронхо-легочной дисплазии (БЛД), некротизирующего энтероколита (НЭК), внутрижелудочковых кровоизлияний (ВЖК), частоты переливаний эритроцитарной массы, обеднённой лейкоцитами и тромбоцитами (ЭМОЛТ) и частоты развития артериальной гипотонии, потребовавшей применения допамина, на характер течения РН (табл.2-7).

    Выявлена связь частоты и тяжести РН с продолжительностью ИВЛ у детей с весом при рожденииот 1000 до 1500 г (табл. 2). В группе детей с весом до 999 г продолжительность ИВЛ была выше у детей с индуцированным регрессом по сравнению с детьми без РН и по сравнению с детьми с самопроизвольным регрессом РН (р<0,01), тогда как разницы между детьми без РН и с самопроизвольным регрессом РН выявлено небыло.

    В весовой категории 1000-1499 г частота встречаемости БЛД (таб. 3) в группе детей с самопроизвольным регрессомвыше, чем в группе детей без РН (р<0,01) и чем в группе детей с индуцированным регрессом (р=0,098), однако не было выявлено достоверных различий между группами детей без РН и с индуцированным регрессом РН. Среди детей с ЭНМТ БЛД выявлялась чаще у детей с самопроизвольным и индуцированным регрессом РН по сравнению с детьми без РН.

    У детей с весом при рождении более 1500 г частота НЭК (табл. 4) и ВЖК (табл. 5) была выше у детей с РН. В весовой категории от 1000 до 1499 г было выявлено влияние НЭК и ВЖК на возникновение только тяжелых форм РН. У детей с меньшим весом достоверных различий по частоте НЭК и ВЖК выявлено не было.

    В группе детей с весом при рождении 1000-1499 г частота переливаний ЭМОЛТ была выше у детей с РН, как с самопроизвольным, так и с индуцированным регрессом (р<0,1), но не различалась между двумя подгруппами.У детей с ЭНМТ переливания ЭМОЛТ выполнялись чаще в случаях индуцированного регресса РН по сравнению с детьми без РН (р<0,1). Различий между другими группами выявлено не было.

    Для оценки возможного влияния на развитие РН допамина, который назначается в первые сутки жизни при выраженной артериальной гипотонии, проанализирована частота его применения у 132 детей с гестационным возрастом до 30 нед. (табл.7).

    В группе детей с развившейся впоследствии пороговой РН допамин применялся в 2 раза чаще, чем в группе без РН, но достоверных различий при данном числе наблюдений не выявлено, необходимо продолжение исследований.

    Таким образом, частота развития РН при современных условиях выхаживания составляет 28,5% среди всех детей группы риска и 77,1% у детей с ЭНМТ. Прогрессирование РН до пороговых стадий происходит у 7,2% детей группы риска и 32% детей с ЭНМТ. Анализ соматической отягощенности подтвердил, что наиболее значимыми факторами риска развития РН являются низкие гестационный возраст и масса тела при рождении. Длительность ИВЛ коррелирует с развитием и тяжестью РН у детей с массой тела при рождении до 1499 г. Среди детей с массой тела при рождении более 1000 г РН чаще развивается при наличии НЭК и ВЖК.

    Среди детей с ЭНМТ частота и тяжесть РН по нашим данным в меньшей степени зависят от степени выраженности соматической патологии и определяются в первую очередь глубокой незрелостью структур глаза глубоко недоношенных детей, что предполагает наличие патогенетических особенностей РН у детей с ранним сроком гестации.

    Экспериментальная часть Определение уровня катехоламинов в сетчатке крысят при экспериментальной ретинопатии недоношенных

     На 7-е сутки (табл.8), когда гистологически выявляются аваскулярные зоны и отсутствуют признаки патологической вазопролиферации, не было выявлено различий по содержанию катехоламинов в сетчатке крысят двух групп. Дофамин на данном сроке не определялся, так как на этом сроке отсутствуют дофаминсинтезирующие амакриновые клетки (ДАК), и синтез дофамина в сетчатке не происходит (Zhang, 2013).

    На 14-е сутки при ЭРН гистологически появляются признаки начинающейся пролиферации клеток эндтотелия ретинальных сосудов. Содержание L-ДОФА и норадреналина в сетчатке опытной группы на этом сроке повышалось по сравнению с контролем. Выявлено нарастание содержание норадреналина по сравнению с 7-ми сутками. Это говорит о стимулирующей роли норадреналина в ходе завершения нормальной васкуляризации сетчатки. Повышение норадреналина в группе с ЭРН также говорит в пользу его проангиогенных свойств.

    На данном сроке в сетчатке начинает синтезироваться и определяться дофамин, что подтверждается данными литературы о появлении единичных ДАК в этом возрасте в сетчатке крысят в норме (Zhang, 2013). На 21-е сутки, что гистологически соответствует пику неоваскуляризации, уровень L-ДОФА был достоверно ниже в сетчатке крыс с ЭРН. Уровень дофамина в группах не различался, что может говорить о его активном синтезе и высоком расходовании L-ДОФА. Возможно, что именно создающийся к данному сроку дефицит L-ДОФА и является причиной развития патологической неоваскуляризации.

    На 30-е сутки, когда гистологически отмечается начало регресса ЭРН, содержание L-DOPA также снижено по сравнению с группой контроля, однако наблюдается нарастание его концентрации относительно 21-х суток. Нарастание уровня L-DOPA и дофамина на этом сроке может свидетельствовать в пользу их участия в регрессе ЭРН и подтверждает их антиангиогенные свойства.

    Таким образом, полученные данные свидетельствуют об участии дофамина, L-ДОФА и норадреналина в регуляции ангиогенеза при РН и ставят вопрос об изучении их влияния на системном уровне.

    Определение уровня катехоламинов в плазме крысят при экспериментальной ретинопатии недоношенных.

    Учитывая приведенные выше данные об участии моноаминов в патологическом ангиогенезе при ЭРН, а также в связи с тем, что для анализа клинических корреляций необходимо исследование доступных материалов, мы провели анализ содержания моноаминов в плазме крови (Таб.9).

    На 14-е сутки было выявлено достоверное снижение уровня L-ДОФА в опытной группе. Содержание норадреналина и дофамина не различалось между группами. Снижение L-ДОФА в системном кровотоке позволяет рассматривать его как потенциальный предиктор развития тяжелых форм РН на стадии ранних клинических изменений у недоношенных детей. В плазме крови на 21-е сутки уровень L-ДОФА повышался по сравнению с 14-ми сутками и был достоверно ниже в плазме крысят с ЭРН. Появилась тенденция к снижению уровня дофамина у крысят с ЭРН. Это позволяет предположить наличие влияния сниженных концентраций L-ДОФА и дофамина на определяющийся на этом сроке гистологически пик неоваскуляризации.

    На 30-е сутки не было выявлено достоверных различий в содержаниимоноаминов. Регресс ЭРН сопровождался нормализацией их системного уровня и достижением контрольных значений.

    Выявленные системные изменения уровня катехоламинов говорят о вовлечении центральных регуляторных механизмов в патогенез РН, что должно учитываться при поиске новых методов диагностики и лечения этого заболевания. Снижение уровня L-ДОФА в плазме на 14 сут ЭРН (что соответствует начальным стадиям РН) делает перспективным изучение содержания катехоламинов в плазме у недоношенных детей для прогнозирования характера течения РН в клинике.

    Определение уровня катехоламинов в плазме крови недоношенных детей

    Учитывая выявленную роль катехоламинов в патогенезе экспериментальной РН, нами проведено исследование уровней катехоламинов в плазме недоношенных детей.

    Было изучено 39 проб (у 36 детей). Дети были разделены на 2 группы: без РН и с РН. В каждой группе анализ содержания катехоламинов (дофамин, норадреналин, серотонин) проводился на сроках 32-35 нед. и 36-39 нед. ПКВ, что клинически соответствуют срокам манифестации и пика прогрессирования РН. Дофамин определялся в 44,4% проб, серотонин и норадреналин в 100% проб. Достоверных различий по содержанию дофамина у детей разных групп выявлено не было. Уровень серотонина был достоверно снижен у детей с РН по сравнению с детьми без РН на сроке 32-35 нед. ПКВ (рис. 1), что говорит о его антиангиогенных свойствах и согласуется с данными литературы о подавлении серотонином синтеза VEGF (CerezoA.B., 2017). Кроме того, серотонин является предшественником мелатонина, который благодаря своим антиангиогенным и антиоксидантным свойствам способен ингибировать патологический ангиогенез при ЭРН (Катаргина Л.А., Осипова Н.А., 2016, XuY., 2018).

    Уровень норадреналина не различался между группами детей с и без РН, однако выявлена тенденция к повышению его концентрации(p=0,06) в группе детей с РН на сроке 36-39 нед. ПКВ (т.е. при прогрессировании заболевания) (рис. 2), что вместе с данными, полученными в эксперименте, подтверждает проангиогенные свойства норадреналина.

    Таким образом, неблагоприятным фактором развития РН может служить низкое содержание серотонина (<17,0 пг/мл) на сроке 32-35 нед. ПКВ.Также у детей с начальными стадиями РН нарастание концентрации норадреналина при динамическом наблюдении может служить маркером прогрессирования заболевания. Полученные данные подтверждают роль биогенных аминов в ангиогенезе и могут служить основой для разработки новых методов диагностики и терапии РН.

    Анализ цитокинового статуса у детей с различным течением РН

    Ранее в работе Н.А. Осиповой (2016г.) было показано, что высокая концентрации VEGF-А и низкое значение концентрации TGF-β в сыворотке крови недоношенных детей с развившейся в динамике пороговой стадией РН позволяют еще до появления офтальмоскопических признаков заболевания выделить группу детей с высоким риском неблагоприятного течения заболевания. Мы провели дополнительное исследование цитокинового статуса для подтверждения этих результатов на большем количестве наблюдений и с целью поиска новых факторов риска развития тяжелых форм РН.

    Ретроспективно дети были разделены на 3 группы: 12 детей без РН, 15с самопроизвольным регрессом, 17 - с индуцированным.Обследование детей проводилось на сроке от 32 до 41 нед. ПКВ на разных этапах течения РН. Из 47 цитокинов у всех детей определялись 19: IL-2, IL-18, IL-7, Eotaxin, GRO-α, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1β, IL-1RA, LIF, BDNF, VEGFA, GROα, HGF, PDGFBB, SCF, SDF1α, TGFβ 1.

     Мы проанализировали количественное содержание наиболее часто определяемых цитокинову детей с различным течением РН. Результаты представлены в таблице 10.

    До манифестации заболевания мы выявили более низкий уровень MCP1 и более высокий уровень TGFβ1 у детей без РН. Данные поTGFβ1 совпадают с результатами работы Н.А. Осиповой и могут служить прогностическими признаками развития РН в дальнейшем.Кроме того, уровень VEGF-A, TGFβ2, PDGFBB был повышен у детей с неблагоприятным течением РН по сравнению с детьми с самопроизвольным регрессом.

    Достоверных различий по содержанию IL-8, IL-18, IL-2, IL-1β, IL-1RA, VEGF-A, HGF , LIF, IL-7, Eotaxin, GRO-α, BDNF, RANTES, SDF-1α, MIP-1β, SCF, PDGF-BB, PlGF, IP-10 выявлено не было.

    Таким образом, высокая концентрация MCP1 (>95 пг/мл) и низкая концентрация TGFβ1 (<18000 пг/мл) в крови у недоношенного ребенка позволяют выявить группу высокого риска развития РН до появления первых признаков заболевания. Повышенное содержание VEGF-A, PDGFBB, TGFβ2 на начальных стадиях РН служит признаком неблагоприятного течения заболевания. Полученные данные расширяют представления о патогенезе РН и открывают перспективы для разработки новых методов диагностики и лечения данного заболевания.

    

Выводы

    1. Частота развития РН при современных условиях выхаживания составляет 28,5% среди всех детей группы риска, достигая 77,1 % среди детей с ЭНМТ, частота развития пороговых стадий составила 7,2% среди всех детей группы риска и 32% среди детей с ЭНМТ. Установлено, что в разных весовых категориях частота развития и тяжесть РН зависят от наличия различной соматической патологии. У детей с массой тела при рождении (более 1000 г) частота развития тяжелых форм РН коррелирует с наличием НЭК и ВЖК. У детей с ЭНМТ частота развития РН зависит от наличия БЛД, а на тяжесть РН у детей в этой весовой категории оказывают влияние длительность ИВЛ и наличие БЛД.

    2. Установлена важная роль моноаминов в патогенезе РН, показана динамика изменений их уровней в сетчатке и плазме крысят с ЭРН на разных стадиях заболевания. Выявленное снижение системного уровня L-ДОФА на начальных стадиях ЭРН делает перспективным исследование возможности его использования для выявления детей с высоким риском развития РН.

    3. Анализ содержания моноаминов в плазме недоношенных детей выявил снижение уровня серотонина у детей с РН на начальных стадиях заболевания, что говорит о его антиангиогенных свойствах. Нарастание содержания норадреналина по мере прогрессирования заболевания подтверждает полученные в эксперименте данные о проангиогенных свойствах норадреналина.

    4. Обобщение результатов эксперимента и клиники показало наличие возможных проангиогенных свойств у норадреналина, а также участие в антиангиогенных процессах серотонина и L-ДОФА. Выявленные изменения позволяют использовать биогенные амины в качестве маркеров прогрессирования РН и делают перспективным возможность их изучения в качестве терапевтических мишеней.

    5. Анализ содержания цитокинов и факторов роста в плазме недоношенных детей показал, что повышение MCP1 (>95 пг/мл) и снижение TGFβ1 (<18000 пг/мл) на этапе до развития РН, а также высокий уровень VEGF-A (>108 пг/мл), TGFβ2 (>100 пг/мл), PDGF-BB (>1800 пг/мл) при манифестации РН можно рассматривать как новые факторы риска развития и тяжелого течения РН.

    

Практические рекомендации

    1. При выявлении НЭК и ВЖК у недоношенных детей с массой тела при рождении более 1000 г следует отнести данного ребенка в группу высокого риска развития пороговой формы РН и планировать его дальнейшее ведение таким образом, чтобы обеспечить возможность незамедлительного лечения.

    2. Следует определять содержание MCP1, TGFβ1, VEGF-A, TGFβ2, PDGF-BB, серотонина и норадреналина в плазме крови недоношенных детей группы риска развития РН. В случае выявления содержания MCP1 более 95 пг/мл или TGFβ1 менее 18000 пг/мл следует отнести данного ребенка в группу высокого риска развития РН.При определении содержания в плазме VEGF-A >108 пг/мл, TGFβ2 >100 пг/мл, PDGF-BB >1800 пг/мл, серотонина <17,0 пг/мл или при нарастании уровня норадреналина следует учитывать высокий риск прогрессирования РН и планировать проведение ЛК сетчатки.

    

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

    1. КатаргинаЛ. А., Панова А.Ю. [и др.]Частота и характер течения ретинопатии недоношенных при современных условиях выхаживания по данным Московского областного перинатального центра /Российский офтальмологический журнал. – 2020. – Т. 13. – №. 3. – С. 15-20

    2. Катаргина Л.А., Осипова Н.А., Панова А.Ю., и др. Роль катехоламинов в развитии патологической неоваскуляризации сетчатки на экспериментальной модели ретинопатии недоношенных у крыс / Доклады Академии наук. - 2019. - Т. 489. - №3. - C. 313-317. doi: 10.31857/S0869-56524893313-317

    3. Катаргина Л.А., Осипова Н.А., Панова А.Ю., Бондаренко Н.С., Никишина Ю.О., Муртазина А.Р., Угрюмов М.В. Изучение патогенетического значения катехоламинов в развитии ретинопатии недоношенных на экспериментальной модели заболевания. Российский офтальмологический журнал. 2019;12(4):64-69. https:/doi.org/10.21516/2072-0076-2019-12-4-64-69

    4. Катаргина Л.А., Хорошилова-Маслова И.П., Бондаренко Н.С., Никишина Ю.О., Муртазина А.Р., Майбогин А.М., Осипова Н.А., Панова А.Ю., Судовская Т.В., Угрюмов М.В. Ангиогенные свойства катехоламинов в аспекте патогенеза ретинопатии недоношенных. Российский офтальмологический журнал. 2018;11(4):49-54. https:/doi.org/10.21516/2072-0076-2018-11-4-49-54

    5. Катаргина Л.А., Денисова Е.В., Осипова Н.А., Панова А.Ю. Роль моноаминов в регуляции ангиогенеза и перспективы их применения при ретинопатии недоношенных. Российская педиатрическая офтальмология. 2018; 13(2): DOI:http:/dx.doi.org/10.18821/1993-1859-2018-13-2

    6. Роль дофамина в патологическом ангиогенезе при ретинопатии недоношенных. / Катаргина Л.А., Панова А.Ю. [и др.] / Российский общенациональный офтальмологический форум: сб. науч.- практ. конф. с междунар. участием. – Москва, 2018. - Т. 2. - С. 501-503.

    

Список сокращений

    БЛД – бронхо-легочная дисплазия

    ВЖК – внутрижелудочковое кровоизлияние

    ЗАРН – задняя агрессивная форма ретинопатии недоношенных

    ИВЛ – искусственная вентиляция легких

    НЭК – некротизирующий энтероколит

    ПКВ – постконцептуальный возраст

    РН – ретинопатия недоношенных

    ЭМОЛТ – эритроцитная масса, обеднённая лейкоцитами и тромбоцитами

    ЭРН – экспериментальная ретинопатия недоношенных

    HGF (Hepatocytegrowthfactor) – гепатоцитарный фактор роста

    IFN (Interferon) – интерферон

    IGF (Insulin-likeGrowthFactor) – инсулиноподобный фактор роста

    IL (Interleukin) – интерлейкин

    L-ДОФА - Дигидроксифенилаланин

    LIF – (LeukemiaInhibitoryFactor) - Лейкемия-ингибирующий фактор

    MCP1 – (MonocyteChemoattractantProtein 1) - Моноцитарный хемотаксический белок 1

    TGF-β (TransformingGrowthFactor-β) - трансформирующий фактор роста-β

    TNF (TumorNecrosisFactor) – фактор некроза опухоли

    VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) - факторростаэндотелиясосудов