Онлайн доклады

Онлайн доклады

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

XIX Конгресс Российского глаукомного общества  «19+ Друзей Президента»

XIX Конгресс Российского глаукомного общества «19+ Друзей Президента»

Пироговский офтальмологический форум

Пироговский офтальмологический форум

Кератиты, язвы роговицы

Вебинар

Кератиты, язвы роговицы

Актуальные вопросы офтальмологии

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Сателлитный симпозиум

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Все видео...
Год
2021

Значение бионеорганических и сероорганических компонентов в ретенции при первичной открытоугольной глаукоме (клинико-экспериментальное исследование)


Органзации: В оригинале: ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»
    Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

    Научный руководитель: доктор медицинских наук Петров Сергей Юрьевич

    

Общая характеристика работы



    Актуальность темы и степень ее разработанности

    
Рисунок 1 Модели процессов, происходящих в дренажной зоне: а) Схема нормы: ток ВГЖ сохранен, редокс-градиент незначителен, функции трабекулярной ткани сохранны (врезка 1); б) Схема компенсации: ток ВГЖ несколько нарушен, редокс-градиент незначительно увеличен, в процессе транспортировки пигмента по току ВГЖ происходит его агрегация в сероорганические депозиты и аутокальцификация с формированием единичных кальцификатов, функции трабекулярной ткани сохранны (врезка 2); в) Схема декомпенсации: ток ВГЖ нарушен, редокс-градиент увеличен, в процессе транспортировки пигмента по току ВГЖ происходит его агрегация в значимые по занимаемой площади сероорганические депозиты, функции трабекулярной ткани нарушены (врезка 3), возможна биоминерализация трабекулы (врезка 4): кальцификация (врезка 4.1) и силицитизация (врезка 4.2)
Рисунок 1 Модели процессов, происходящих в дренажной зоне: а) Схема нормы: ток ВГЖ сохранен, редокс-градиент незначителен, функции трабекулярной ткани сохранны (врезка 1); б) Схема компенсации: ток ВГЖ несколько нарушен, редокс-градиент незначительно увеличен, в процессе транспортировки пигмента по току ВГЖ происходит его агрегация в сероорганические депозиты и аутокальцификация с формированием единичных кальцификатов, функции трабекулярной ткани сохранны (врезка 2); в) Схема декомпенсации: ток ВГЖ нарушен, редокс-градиент увеличен, в процессе транспортировки пигмента по току ВГЖ происходит его агрегация в значимые по занимаемой площади сероорганические депозиты, функции трабекулярной ткани нарушены (врезка 3), возможна биоминерализация трабекулы (врезка 4): кальцификация (врезка 4.1) и силицитизация (врезка 4.2)
Основным патогенетическим звеном ПОУГ считается ретенция ВГЖ [Петров С.Ю., 2015]. При этом наблюдается деструкция трабекулы и накопление в ней патологического материала, что в свою очередь может коррелировать и с тяжестью повреждения зрительного нерва [Gottanka J., 1997].

    К патологическому материалу трабекулы при ПОУГ относятся такие вещества, как ПЭМ и пигмент [Sampaolesi R., 1977], а при электронной микроскопии определяют электронно-плотные депозиты [Sihota R., 2012]. Пигмент в трабекуле по своему составу может являться простым органическим веществом на основе полимера меланина (серосодержащего феомеланина или эумеланина без серы в составе) или же представлять собой более сложные внутримеланоцитарные структуры, расположенные внеклеточно вследствие деструкции меланоцитов радужки [Lahola-Chomiak A.A., 2018]. Электронно-плотный материал состоит из ассоциированного с мукополисахаридами белка [Bhattacharya S.K., 2005]. ПЭМ представляет собой фибриллярный амилоидоподобный гликозилированный белковый комплекс [Challa P., 2018].

    Точное структурно-химическое строение перечисленных органических веществ окончательно не определено. Это связано с довольно сложной аналитической задачей доступа к их определенным молекулярным последовательностям, который необходимо осуществить таким образом, чтобы в процессе пробоподготовки не нарушить структуру анализируемых веществ.

    Различные патологические состояния в организме человека также сопряжены с патологической аккумуляцией в тканях бионеорганических веществ – биоминерализацией [Dorozhkin S.V., 2011]. Однако доля бионеорганического компонента в патогенезе глаукомы не определена, что связано с требующейся для большинства методов анализа пробоподготовкой, влекущей за собой химические изменения и потерю значительной части информации о веществе.

    Следует отметить, что исследование элементного состава на ЭДС можно проводить для тканей в максимально нативном их состоянии без проведения агрессивной пробоподготовки. Полученные при этом данные о распределении и соотношении химических элементов в ткани могут дать представление, как о доле бионеорганического вещества, так и об ориентировочном строении органических веществ. Несмотря на то, что знания об элементном составе трабекулы и субстанций, затрудняющих отток ВГЖ, могут потенциально привести к новым подходам к ориентированной на снижение ретенции терапии ПОУГ, на текущий момент сведения об элементной химии трабекулы практически отсутствуют.

    Цель работы

    Оценить роль бионеорганических и сероорганических компонентов в ретенции при первичной открытоугольной глаукоме.

    Задачи работы

    1. Изучить на ЭДС в СЭМ элементный состав интраоперационно полученного материала (тканей трабекулярного аппарата, склеры, ВГЖ) при различных стадиях (II-й и III-й) и формах (ПЭГ и простая ПОУГ) нестабилизированной ПОУГ; выявить различия в накоплении химических элементов при различных стадиях и формах нестабилизированной ПОУГ.

    2. С помощью общего элементного анализа оценить связь между ВГД при нестабилизированной ПОУГ и различными формами (бионеорганической и органической) нахождения химических веществ в тканях дренажной зоны.

    3. Изучить пространственное распределение серосодержащего пигмента и химических веществ в различных формах (бионеорганической и органической) на наружной части трабекулы с помощью микрокартирования на ЭДС.

    4. На основе данных о пространственном распределении химических элементов наружной части трабекулы разработать метод структурно–функциональной оценки нативного образца трабекулярной ткани

    5. В эксперименте изучить химические процессы, потенцируемые серосодержащими веществами выщелоченного пигмента радужки.

    Научная новизна работы

    Впервые на основании комплексного подхода, основанного на анализе общего элементного состава и пространственного распределения химических элементов в нативной ткани, получены данные о поведении и форме нахождения структурообразующих элементов и неорганических ионов переднего отрезка глаза у пациентов с нестабилизированной ПОУГ.

    Разработан способ количественной оценки морфо-функционального состояния ткани дренажной зоны на основе данных о пространственном распределении химических элементов с использованием методов пространственной статистики.

    При изучении нативного материала ткани дренажной зоны глаза выявлена и определена доля минерального компонента в создании ретенции ВГЖ на уровне наружных отделов трабекулы в отдельных случаях ПОУГ.

    Экспериментально было доказано, что выведенные из разрушающихся меланоцитов радужки гранулы пигмента способны самостоятельно агрегироваться, а также инициировать минерализацию.

    Теоретическая и практическая значимость работы

    Определено направление разработки патогенетически ориентированной медикаментозной терапии, направленной на элиминацию ретенции ВГЖ на уровне трабекулярной ткани при ПОУГ, при которой следует принимать во внимание выявленный характер патологического материала дренажной зоны: сероорганические вещества, склеивающие пигментные гранулы, и минеральные депозиты, облитерирующие ткань наружной части трабекулы.

    Методология и методы диссертационного исследования

    Методологической основой работы является применение комплекса методов научного познания. Работа выполнена в дизайне обсервационного описательного и экспериментального исследований с использованием клинических, инструментальных, аналитических и статистических методов.

    Положения, выносимые на защиту

    1. В трабекулярной ткани при ПОУГ происходит аккумуляция сероорганических соединений, ассоциированных с агрегатами пигментных гранул. Существует прямая связь между уровнем ВГД при нестабилизированной ПОУГ и общим содержанием серы в ткани трабекулы.

    2. Существует связь между различной формой нахождения фосфора в ткани трабекулы при нестабилизированной ПОУГ и уровнем ВГД. Для фосфора установлено преобладание органического компонента над минеральным при увеличении ВГД у пациентов с нестабилизированной ПОУГ.

    3. Паттерн пространственного распределения серы и фосфора в трабекулярной ткани меняется в зависимости от уровня ВГД у пациентов при нестабилизированной ПОУГ. Количественно показано, что сходная пространственная организация серы и фосфора характерна для относительно низких показателей ВГД при нестабилизированной ПОУГ.

    4. Впервые описаны случаи «минеральной открытоугольной глаукомы», при которых силикатный или фосфатный минеральный компонент преобладает среди прочих отложений на наружной поверхности трабекулярной ткани.

    Степень достоверности и апробация результатов

    Основные положения диссертации доложены на XXV Международном офтальмологическом конгрессе Белые ночи-2019, на XII Съезде Общероссийской общественной организации «Общество офтальмологов России», на заседании проблемной комиссии ФГБНУ «НИИГБ».

    Личный вклад автора в проведенное исследование

    Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в проведении всех исследований, подготовке публикаций и докладов по теме диссертационной работы. Химический анализ на электронном микроскопе, статистическая обработка полученных данных и интерпретация результатов осуществлены лично автором.

    Внедрение результатов работы

    Результаты работы внедрены в научно-исследовательскую практику Института Регенеративной Медицины ФГАО ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России и используются для поиска и разработки новых фармакологических агентов, направленных на процессы, протекающие при офтальмопатологии.

    Публикации.

    По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 6 – в журналах, входящих в перечень рецензируемых журналов и изданий, рекомендованных ВАК.

    Структура и объем диссертационной работы.

    Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и указателя литературы. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 6 таблицами. Библиографический указатель содержит 174 источника (28 отечественных и 146 зарубежных).

    

Содержание работы



    Материал и методы

     В рамках клинического исследования был проанализирован элементный состав 125 образцов от 124 пациентов, которые были разделены на группы в зависимости от поставленных в работе задач. Общая характеристика групп, а также методов химического анализа и статистической обработки для каждой из групп представлена в Таблице 1. Образцы эксплантировали у пациентов с нестабилизированной ПОУГ при проведении антиглаукомных операций: СТЭ и НГСЭ. Всем пациентам до хирургического вмешательства было проведено стандартное офтальмологическое обследование, включавшее визометрию, биомикроскопию, гониоскопию, офтальмоскопию и периметрию. Статическая периметрия была проведена на анализаторе поля зрения Humphrey Field Analyzer II 750i (Zeiss, Германия). Стадия глаукомы была оценена по классификации Нестерова А.П. Измерение роговично-компенсированного ВГД было выполнено на приборе Reichert 7CR (Reichert, США).

    Уровень ВГД измеряли за 2-4 часа до проведения оперативного вмешательства. Критериями включения являлись: признаки глаукомной оптической нейропатии II-й и III-й стадий по данным офтальмоскопии и статической периметрии, открытый УПК, отсутствие стабилизации глаукомного процесса по данным статической периметрии, максимально возможная гипотензивная терапия, включающая препараты группы ингибиторов карбоангидразы, b-блокаторов, аналогов простагландинов, a-адреномиметиков. Критериями исключения из исследования являлись: наличие прочих видов оптиконейропатии и причин повышения офтальмотонуса.

    В рамках экспериментального исследования был изучен химический состав пигментных гранул радужки 5 пар кадаверных глаз, полученных из лаборатории консервации тканей (глазной банк) ФГБНУ «НИИГБ» после забора роговично-склеральных дисков для консервации. Время после смерти донора не превышало 24 часов. Возраст доноров варьировал в диапазоне 55-75 лет, причиной смерти являлась сердечно-сосудистая патология. До начала подготовки лабораторных образцов проводилась серологическая диагностика на инфицированность ВИЧ I/II, гепатитами В и С, сифилисом. Образцы были отобраны из «чистого» донорского материала от серонегативных трупов.

    Для получения материала в стерильных условиях бокса из пары кадаверных глаз вырезали диски радужки. После промывки в фосфатном буферном растворе (PBS) (pH 7,4) каждый из дисков помещали в пробирку с 8 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) без двухвалентных ионов. Дезагрегировали образец встряхиванием на вортекс-миксере (10 минут) и затем содержимое двух пробирок пропускали через нейлоновый фильтр (Cell Strainer) с диаметром пор 40 мкм («СПЛ ЛайфСайенс Ко., ЛтД», Республика Корея) для удаления клеточных элементов и больших агрегатов. Очищенную суспензию меланосомальных гранул разделяли на 2 субстанции (опыт и контроль), а затем центрифугировали на скорости 2000 об/мин в течение 10 мин (центрифуга Еlmi; ELMILtd., Латвия). Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали.

    Учитывая то, что часть ВГЖ является ультрафильтратом плазмы крови, добавление бычьей сыворотки к гранулам пигмента позволяет смоделировать нативную среду, окружающую их в передней камере. Компоненты, входящий в состав сыворотки, способны улавливать кислород, что дополнительно моделирует относительно гипоксические условия передней камеры. Поэтому опытные образцы ресуспендировали в среде D-MEM с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, HyClone), контрольные образцы ресуспендировали в D-MEM без сыворотки. Содержимое затем рассеивали в культуральные чашки Петри диаметром 35 мм и инкубировали во влажной атмосфере при температуре 37° C и 5% СО2 в течение 24 часов. После окончания срока инкубации чашки промывали дистиллированной водой (на дне чашки при этом визуально фиксировали окрашенный осадок) и подвергали сушке на воздухе в течение 1 часа.

    Химический анализ

    Пробоподготовка исключала классическую экспозицию образца в агрессивных химических веществах. Образцы исследуемых тканей размещали на поверхность химически чистой углеродной ленты. ВГЖ раскапывали на поверхности углеродной ленты и подвергали эвапоризации с получением сухого остатка. Образцы помещали в камеру СЭМ EVO LS 10 (Zeiss, Германия) с ЭДС Oxford X-Max-50 (Oxford, Великобритания). Поверхность всех эксплантатов визуализировали в СЭМ с помощью детектора BSE в режиме низкого вакуума (EP, 70 Па) при ускоряющем напряжении 21,5 кВ и токе на образце 20-60 пА.

    Общий химический микроанализ проводился при помощи ЭДС для выборочных химических элементов: C, N, O, Al, Ca, Cl, K, Mg, Na, P, Si, S. Элементы, весовая доля которых по результатам анализа оказывалась ниже границы предела обнаружения в ЭДС (< 0,1 вес.%), исключали из обработки. Для сухого вещества ВГЖ из анализа также был исключен углерод, учитывая его превалирующую долю в подложке из углеродной ленты. Итоговые данные приводили к 100% весу по каждому образцу.

    Для получения информации о пространственном распределении химических элементов проводилось химическое микрокартирование поверхности каждого образца при помощи ЭДС с использованием выдержки – 3000 с, разрешения – 512×384 пикс. Была получена двухмерная карта распределения химических элементов, представляющая собой совокупность данных о химическом составе поверхностного и подповерхностного слоев.

    Неоднородная поверхность анализируемых фрагментов ткани, невозможность рассчитать весовую долю водорода, обусловленная самой методикой ЭДС-анализа, а также отсутствие эталонов для биологических образцов, позволяли характеризовать метрологический класс выполненного анализа как «качественный», и лишь в отдельных случаях , как «полуколичественный».

    Статистическая обработка результатов

    Статистическую обработку осуществляли, используя программы Excel 2019 (Microsoft), STATISTICA 12.6 (StatSoft), GeoDa 1.14. Учитывая близость регистрируемых значений химических элементов к пределу обнаружения детектором и качественный метрологический класс химического анализа, распределения каждого оцениваемого параметра по умолчанию не были отнесены к нормальному закону, даже в случае прохождения теста на нормальность распределения. Исходя из этого, использовались следующие статистические тесты: при сравнении двух групп – тесты Манна-Уитни, при анализе корреляции – критерий Спирмена. Средние данные приводили в виде медианы (Ме), дополненной интерквартильным размахом в круглых скобках (Q25;Q75), а для сравнения малых выборок (< 5 единиц) – в виде медианы, дополненной минимальным и максимальным значениями выборки в квадратных скобках [Minimum; Махimum].

    Критерием исключения выбросов из статистического анализа являлось смещение среднего значения всей выборочной совокупности единичным измерением более чем на 5%. В качестве критериев оценки статистически значимых различий была определена вероятность ошибки р < 0,05.

    При изучении различий в распределениях Ca и Cl (между группами ПЭГ и простой ПОУГ), а также Si в трабекуле (между группами со II стадией и III стадией) некоторые величины описательной статистики оказывались на границе или ниже границы предела обнаружения в ЭДС. Тем не менее, значения принимались в обработку, хотя стоит отметить, что полученные с их использованием закономерности необходимо проверить более чувствительными методами химического анализа.

     Пространственные вычисления проводились в реальной прямоугольной декартовой системе координат плоскости, соответствующей карте распределения относительных концентраций химических элементов. Расстояние между точками захвата качественных данных о химическом составе поверхности составило 126,9 нм. В качестве показателя интенсивности (С) использовали получаемое путем вычитания сигнала фона количество импульсов характеристического излучения от соответствующего элемента в каждой точке карты (режим TrueMap, программная оболочка Aztec, Oxford Instruments inc., Великобритания). Для определения степени группировки в пространстве определённого элемента исходные данные микрокартирования преобразовывались в формат х, y, С, где x и y – координаты по соответствующим осям в условной прямоугольной системе координат, С – интенсивность излучения в каждой точке анализируемого пространства (количество импульсов от изучаемого элемента). По каждому образцу формировалась матрица пространственных весов. Степень группировки элемента в пространстве, рассчитывалась с помощью аппарата пространственной статистики путем вычисления глобального индекса Морана (Moran’s I) по формуле:

    где n – количество точек, в которых проводились измерения;

    Ci – интенсивность сигнала в i-й точке анализируемого пространства (количество импульсов от изучаемого элемента);

    Cj – интенсивность сигнала в j-й точке анализируемого пространства (количество импульсов от изучаемого элемента);

    Č– выборочное среднее значение интенсивности сигнала от изучаемого элемента по всем точкам;

    wij – расстояние между i-й и -й точкой в условных единицах.

    При этом все оцениваемые с помощью Moran’s I показатели по умолчанию также не были отнесены к нормальному закону, что связано с ограничением базового распределения индекса (-1;1).

    

Результаты собственных исследований



    Различия в накоплении химических элементов при различных стадиях и формах нестабилизированной ПОУГ

    С помощью ЭДС было выявлено, что распределение некоторых химических элементов в сухом веществе ВГЖ и трабекуле меняется в зависимости от стадии ПОУГ и наличия ПЭМ в передней камере (Таблица 2). При анализе склеры между указанными группами статистически значимых различий в распределении исследуемых элементов выявлено не было. При детальном изучении распределения Na в трабекуле было замечено, что его и весовая, и молярная доли превышали соответствующие доли Сl во всех проанализированных образцах. Исходя из этого, было дополнительно вычислено количество Na, не входящего в состав NaCl (неосмогенный Na, или Nanon-osm), по формуле:Nanon-osm = ((С(Na) ÷ Аr(Na))-(C(Сl) ÷ Аr(CI))),где C(Е) – процентное весовое содержание химического элемента Е; Аr(Е) – относительная атомная масса химического элемента Е.

    Распределения рассчитанного по указанной формуле Nanon-osm также статистически значимо различались в группах пациентов с ПЭГ и ПОУГ без ПЭМ. (Таблица 2).

    Связь между формой нахождения химических веществ в ткани дренажной зоны и ВГД

    Для изучения доли минерального компонента в тканях глаза в рамках первой части клинического исследования был проведен анализ весовой доли P, который накапливается в биологической ткани как в минеральной (неорганической) кальциево-фосфатной фазе, так и в составе фосфорсодержащих органических молекул. Исходя из стехиометрического соотношения, согласно которому во всех минеральных кальциево-фосфатных фазах весовая доля Ca превышает долю P, исследуемые ткани склеры и трабекулы ретроспективно были поделены на 2 группы. В первую группу вошли кальцифицированные образцы (Ca:P > 1): 29 из 40 образцов склеры, а также 50 из 89 образцов трабекулы. Общая доля кальцифицированных образцов склеры и трабекулы от всех проанализированных составила 61%. Во вторую группу были определены неминерализованные образцы с доминирующей весовой долей фосфора (Ca:P ≤ 1). К образцам, в основном содержащим фосфор в составе органических соединений, относились 11 образцов склеры из 40, 39 образцов трабекулы из 89.

    Общая доля образцов, содержащих в качестве доминирующей фазы неминеральный фосфор, составила 39% от всех проанализированных.

    Корреляционный анализ выявил, что весовая доля S статистически значимо (p = 0,003, R = 0,31) повышается в трабекуле при увеличении ВГД. С возрастанием ВГД также статистически (p = 0,01, R = 0,27) значимо связано сопутствующее накопление P и статистически значимо (p = 0,03, R = 0,23) связано сопутствующее накопление Ca. При этом по мере увеличения уровня офтальмотонуса весовая доля P начинает преобладать над весовой долей Ca, то есть фосфор в неминеральных соединениях становится доминирующим по отношению к фосфору кальцификатов.

    Пространственное распределение химических элементов в ткани наружной части трабекулы

    В ткани трабекулы, полученной в рамках второй части клинического исследования, в 22 образцах из 30 по данным визуализации в BSE между пластинами трабекулярной ткани систематически обнаруживались значительные агрегаты пигментных гранул. При этом по данным химического микрокартирования, в совпадающей с пигментными агрегатами позиции обнаруживалась значимая по площади аккумуляция высокосернистых веществ, располагающихся между клетками трабекулы. На клетки трабекулы в свою очередь указывали локальные максимумы концентрации P, соответствующие позиции их ядер. Нередко между клетками трабекулы также визуализировались рассеянные кальцификаты, на которые указывают локальные скопления Ca, соответствующие электронно-плотным участкам, обнаруживаемым на детекторе BSE. В образце с отсутствием пигментных гранул на поверхности трабекулы (врождённая глаукома, сочетанная с аниридией) скоплений серосодержащих веществ не наблюдалось. Отсутствие локальных максимумов концентрации S у пациента с аниридией дополнительно указывает на связь S с выщелачиваемым из ткани радужки пигментом. При подготовке к визуализации в СЭМ образцов ткани трабекулы, при которой использовалась щадящая методика по отношению к минеральному веществу, в 7 образцах из 30 была выявлена облитерация ткани трабекулы минеральными депозитами (Таблица 3). Извлекаемое минеральное вещество представляло собой микроскопические блоки однородной рассыпчатой массы светло-бежевого цвета. На основании соответствия данных химического состава материала, извлекаемого из трабекулярной ткани, с данными последующего микрокартирования трабекулы был сделан вывод о субтотальной минерализации дренажной зоны: силицитизации и кальцификации.

    В 3 образцах с выраженной минерализацией на ЭДС обнаружено увеличение доли Si. Микрокартирование поверхности трабекулярной ткани, освобожденной от сплошной массы кремнистого минерального вещества, выявило очаги совместной импрегнации трабекулярных пластин гранулами пигмента и аморфным кремнеземом. Отмечалась пространственная связь между участками с повышенным содержанием кремния и областями у трабекулярных пластин, через которые в норме осуществляется пассивная фильтрация влаги.

    Отчетливой пространственной связи между импрегнирующими ткань остаточными микросферами фосфата кальция и областями у трабекулярных пластин, через которые в норме осуществляется пассивная фильтрация влаги, установлено не было.

    С позиции гидродинамики, и сероорганические, и минеральные вещества могут вызывать ретенцию, которая определяется занимаемой ими площадью в сечении фильтрующих зон. Поэтому все проанализированные случаи были разделены на группы:

    1. Глаукома с накоплением сероорганических веществ (22 случая из 30);

    2. «Минеральная глаукома» с силицитизацией трабекулы (3 случая из 30);

    3. «Минеральная глаукома» с кальцификацией трабекулы (4 случая из 30).

    Структурно–функциональная оценка трабекулярной ткани на основе данных о распределении химических элементов на ее поверхности

     ####embedimageright(102434,102435,102436,102437)#### Предварительный визуальный анализ изображений поверхности ткани образцов выявил, что распределения S и P в образце могут иметь некоторое сходство, либо отличаться в сторону как большей, так и меньшей рассеянности.

    Для количественного описания вариантов распределения химических элементов при различных функциональных состояниях были вычислены параметры кластеризации соответствующих элементов. Для разделения пациентов на две группы использовалась медиана ВГД (Таблица 4).

    При вычислении индекса Морана для S (IS) были получены результаты, иллюстрирующие умеренную объективную сгруппированность S для обеих групп пациентов. При этом распределение значений IS в двух группах практически не отличалось по медиане (Таблица 4).

    Зоны локальной концентрации фосфора – известный маркер клеток на тканевом уровне. При направленности клеточной активности на утилизацию серосодержащего патологического материала (эффективный процесс), клетки группируются сходно с паттерном целевой мишени – сероорганическими веществами. Процессы декомпенсации, напротив, характеризуются пространственным разобщением клеток, использующих фосфор, и серосодержащих веществ. Поэтому на основе глобального индекса Морана, характеризующего кластеризацию S (IS) и P (IP) на поверхности блока анализируемой ткани, в каждом случае было оценено значение IS/IP с функциональной точки зрения. При эффективном процессе параметры кластеризации маркера метаболически активных клеток (P) и мишени этой активности (S) должны сближаться, а соотношение IS/IP должно стремиться к единице. Уменьшение значения IS/IP, в свою очередь, отражает неэффективность клеточного метаболизма – потерю целевой метаболической активности.

    Исходя из изложенного, дополнительно был рассчитан индекс потери целевой метаболической активности (IL) по формуле:

    IL = |1-(IS/IP)|, (3)

    где IS – глобальный индекс Морана для распределения интенсивности сигнала S;

    IP - глобальный индекс Морана для распределения интенсивности сигнала P.

    Визуальный анализ изображений подтвердил рост индекса IL при увеличении визуально наблюдаемой диспропорциональности в распределении S и P на поверхности анализируемой ткани. При соотнесении клинических показателей с полученным индексом было выявлено, что значение IL отличалось в группах пациентов, разделенных в зависимости от уровня ВГД (Таблица 4).

    Экспериментальное изучение химических процессов в дренажной зоне, потенцируемых выщелоченным пигментом радужки

    В образцах изолированного пигмента, повергшегося экспозиции FBS (модель относительно гипоксических условий передней камеры), на изображениях, полученных с помощью детектора BSE пигментные гранулы оказывались окружены яркой оболочкой. Учитывая специфику получения изображений в BSE (наибольшей яркостью обладает элемент с наибольший атомном весом), можно было говорить о том, что в состав оболочки входит элемент с большим атомным весом, чем тот, из которого состояли сами гранулы. Позиции гранул с визуализируемой на детекторе BSE яркой оболочкой соответствовали локальные максимумы концентрации P и Ca. При этом весовая доля Ca по данным ЭДС детектора, на анализируемой площади распределялась в диапазоне 0,01 вес.%-0,06 вес.% (медиана = 0,04 вес.%), то есть систематически обнаруживалась кальцификация пигментных гранул.

    В контрольных образцах, не подвергшихся экспозиции FBS, обнаруживались серосодержащие пигментные гранулы без признаков кальциево-фосфатной минерализации. Было отмечено, что при этом пигментные гранулы оказываются связаны сероорганическим веществом, образующим пленки на поверхности чашки Петри. Этот результат согласуется с данными клинико-морфологического исследования, при проведении которого на поверхности трабекулярной ткани между клетками выявлялись пигментные агрегаты, склеенные между собой сероорганическим веществом. При этом, по данным химического анализа в СЭМ, весовая доля Ca в контрольном образце на площади его поверхности в 3000 мкм2, находилась в диапазоне 0-0,01 вес. %, то есть систематически оказывались на границе или ниже предела обнаружения в ЭДС.

    В результате анализа точечных спектров с опытных образцов обнаружено, что n(P)/n(Ca) ≈ 0,96, что может соответствовать двум формам нахождения фосфата кальция в биологических системах: ДКФД и АФК. Таким образом, in vitro был получен эффект автономной кальцификации гранул пигмента, возникающий в определенных условиях, что согласуется с выявленным фактом кальцификации трабекулярной ткани in vivo.

    Построение бионеорганической и сероорганической моделей возникновения ретенции ВГЖ при ПОУГ

    Исходя из клинических и экспериментальных исследований, предложены следующие модели, описывающие процессы, происходящие в дренажной зоне при глаукоме (Рисунок 1). При нормальном значении градиента редокс-потенциала в передней камере и сохранной гидродинамике (Рисунок 1а) незначительное количество дебриса, попадающего в УПК, успешно утилизируется (Рисунок 1а, врезка 1). В случае компенсации при некотором снижении тока ВГЖ и относительно небольшом увеличении редокс-потенциала возникают условия для агрегации дебриса с формированием серосодержащих депозитов, а также – для кальцификации единичных пигментных гранул (Рисунок 1б). Однако при относительно сохранной функции трабекулярной ткани существенной ретенции ВГЖ не происходит (Рисунок 1б, врезка 2). При декомпенсации и существенной потере функции трабекулярной ткани в условиях значительного увеличения редокс-градиента создаются условия для существенной аккумуляции серосодержащих пигментных депозитов (Рисунок 1в, врезка 3).

    Также в этом случае могут создаваться условия для биоминералиции ткани трабекулы (Рисунок 1в, врезка 4). В случае патологической инициации фермент-зависимые процессов, происходящие на поверхности гранул пигмента, может происходить кальцификация трабекулы (Рисунок 1в, врезка 4.1). При условии создания зоны постоянного и длительно существующего градиента pH возможна силицитизация ткани (Рисунок 1в, врезка 4.2).

    

Выводы



    1. Впервые на репрезентативном материале (124 пациента, 125 глаз) проведено комплексное исследование общего химического состава ВГЖ, ткани трабекулы и склеры, а также изучение пространственного распределения химических элементов на наружной части трабекулы при нестабилизированной ПОУГ, что позволило выявить связи между клиническими показателями (стадия, форма, уровень ВГД) и химическим составом ткани.

    2. При анализе изображений поверхности наружной части трабекулярной ткани выявлено, что при нестабилизированной ПОУГ в качестве основного патологического материала дренажной зоны выступают пигментные гранулы в виде агрегатов, склеенных сероорганическим связующим веществом.

    3. Выявлена статистически значимая (p = 0,003) прямая связь между уровнем ВГД при нестабилизированной ПОУГ и общим содержанием S в ткани трабекулы. Также статистически значимая прямая связь с уровнем ВГД обнаружена для P (p = 0,01) и Ca (p = 0,03) трабекулы.

    4. Выделены две формы нахождения фосфора в тканях трабекулы при нестабилизированной ПОУГ: минеральная и органическая. Доминирующая кальцификация обнаружена в 61% образцах, преобладание фосфора в составе органических соединений – в 39%.

    5. Выявлена связь между различной формой нахождения P в трабекуле при ПОУГ и уровнем ВГД, по мере возрастания которого возникает преобладание органического фосфора над минеральным.

    6. На основе вычисления глобального индекса Морана (I) получены результаты, количественно характеризующую различающуюся сгруппированность серы (IS) и фосфора (IP) в ткани наружной части трабекулы пациентов с нестабилизированной ПОУГ. Количественно показано, что различающаяся пространственная организация ядер метаболически активных клеток и сернистого патологического материала при нестабилизированной ПОУГ характерна для относительно высоких показателей ВГД.

    7. При сравнительном анализе тканей пациентов с нестабилизированной ПОУГ выявлены статистически значимые различия в распределениях N и Cl сухого вещества ВГЖ, а также Na трабекулы между группами ПЭГ и простой ПОУГ.

    8. Патологические изменения в ткани дренажной зоны глаза, происходящие при нестабилизированной ПОУГ, в определенных случаях проявляются выраженной минерализацией (кальцификацией и силицитизацией) наружной части трабекулы. На достаточной клинической группе охарактеризована доля случаев, при которых минеральная облитерация может играть самостоятельную роль в ретенции на уровне трабекулярной ткани: в 3 из 30 случаях обнаруживается минеральная силицитизация в 4 из 30 – субтотальная кальцификация.

    9. На экспериментальном материале при моделировании условий нахождения пигмента в передней камере, обнаружен эффект автономной кальцификации гранул. Механизм, потенциально способный инициировать минерализацию трабекулы, заключается в осаждении в дренажной зоне функционально сохранных гранул, на поверхности которых образуется оболочка из фосфата кальция.

    

Практические рекомендации



    1. При разработке веществ, направленных на элиминацию ретенции на уровне трабекулярной ткани при ПОУГ, следует принимать во внимание выявленный характер патологического материала дренажной зоны: сероорганические вещества, склеивающие пигментные гранулы, и минеральные депозиты, облитерирующие ткань наружной части трабекулы.

    Патогенетически ориентированная медикаментозная терапии ПОУГ должна разрабатываться с учетом выявленных нарушений в поведении метаболически активных клеток трабекулы, происходящих в отсутствие стабилизации ПОУГ.

    2. Разработанный метод оценки структурно-функционального статуса трабекулы на основе кластерного анализа может быть рекомендован при обработке качественной, количественной и полуколичественной информации, распределение которой в биологическом объекте можно оценить современными методами оптической и электронной микроскопии.

    

Список работ, опубликованных по теме диссертации



    1. Аветисов С.Э., Петров С.Ю., Кравчик М.В. Электронная микроскопия трабекулярного аппарата человека в норме и при глаукоме / Национальный журнал глаукома. – 2018. – Vol. 17 – N 2. – P. 84-89.

    2. Кравчик М.В., Новиков И.А., Борисенко Т.Е., Суббот А.М., Петров С.Ю. Кластерный анализ данных химического микрокартирования трабекулярной ткани при первичной открытоугольной глаукоме / Аналитика. – 2020. – Vol. 10 – N 3 – P. 214-222

    3. Кравчик М.В., Новиков И.А., Суббот А.М., Петров С.Ю., Пахомова Н.А. Подопригора В.С. Сравнительный химический анализ ВГЖ и тканей дренажной зоны глаза при первичной открытоугольной глаукоме / Национальный журнал глаукома. – 2020. – Vol. 19 – N 3. – P. 3-11

    4. Кравчик М.В., Новиков И.А., Петров С.Ю., Антонов А.А., Суббот А.М., Борисенко Т.Е. Количественная характеристика морфофункционального статуса биологической ткани на основе пространственного кластерного анализа / Современные технологии в офтальмологии. – 2020. – Vol. 35 – N 4– P. 118

    5. Кравчик М.В., Новиков И.А., Суббот А.М., Петров С.Ю., Антонов А.А., Пахомова Н.А. Накопление серы и фосфора в дренажной зоне глаза при первичной открытоугольной глаукоме / Вестник офтальмологии. – 2020. – Vol. 136 – N 6. – P. 5-14

    6. Кравчик М.В. Суббот А.М. Новиков И.А., Антонов А.А., Петров С.Ю. Аветисов С.Э., Biomineralization of Trabecular Meshwork in Open-Angle Glaucoma / Doklady Biochemistry and Biophysics. – 2020. – Vol. 495. – P. 307–310

    7. Kravchik, M.V., Novikov, I.A., Petrov, S.Y., Avetisov, S.E. Bioinorganic chemistry of open-angle glaucoma: a review / Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. – 2020. –P. 126652.

    

Список сокращений



    BSE обратно рассеянные электроны

    D-MEM модифицированная по Дульбекко питательная среда Игла

    FBS фетальная бычья сыворотка

    HBSS солевой раствор Хэнкса

    PBS натрий-фосфатный буфер

    АФК аморфный фосфат кальция

    ВГД внутриглазное давление

    ВГЖ внутриглазная жидкость

    ДКФД дигидрат дикальциевого фосфата

    НГСЭ непроникающая глубокая склерэктомия

    ПОУГ первичная открытоугольная глаукома

    ПЭГ псевдоэксфолиативная глаукома

    ПЭМ псевдоэксфолиативный материал

    СЭМ сканирующий электронный микроскоп

    УПК угол передней камеры

    ЭДС энергодисперсионный спектрометр, энергодисперсионная спектрометрия

OAI-PMH ID: oai:eyepress.ru:avtoreferat569

Город: Москва
Дата добавления: 17.09.2021 9:01:19, Дата изменения: 17.09.2021 10:42:37



Johnson & Johnson
Alcon
Bausch + Lomb
Reper
NorthStar
ЭТП
Rayner
Senju
Гельтек
santen
Акрихин
Ziemer
Eyetec
МАМО
Tradomed
Nanoptika
R-optics
Фокус
sentiss
nidek