Онлайн доклады

Онлайн доклады

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

XIX Конгресс Российского глаукомного общества  «19+ Друзей Президента»

XIX Конгресс Российского глаукомного общества «19+ Друзей Президента»

Пироговский офтальмологический форум

Пироговский офтальмологический форум

Кератиты, язвы роговицы

Вебинар

Кератиты, язвы роговицы

Актуальные вопросы офтальмологии

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Сателлитный симпозиум

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Все видео...
Год
2021

Клинико-иммунологические аспекты развития атрофической и влажной форм возрастной макулярной дегенерации; механизмы, ассоциирующиеся с атрофией ретинального пигментного эпителия (клинико-экспериментальное исследование)


Органзации: В оригинале: ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней им. Гельмгольца»
    Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

    Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, академик РАН – Нероев Владимир Владимирович

    

Общая характеристика работы



    Актуальность работы

    Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является основной причиной тяжелой и необратимой потери центрального зрения в развитых странах и оказывает огромное влияние на физическое и психическое здоровье взрослого населения (Wong W.L., 2014; Lim L.S., 2012; Klein R., 1992). Распространенность данной патологии значительно возрастает после 50 лет в каждом десятилетии и поражает до 18% населения старше 85 лет (Metrangolo C., 2021; Daien V., 2020). Заболевание характеризуется поражением сетчатки в макулярной зоне с повреждением как отдельных структур комплекса фоторецептор/ретинальный пигментный эпителий (РПЭ)/мембрана Бруха/хориокапилляр, так и с нарушением интегральной взаимосвязи между указанными компонентами (Bhutto I., 2012). Особо важную и многофункциональную роль в данном комплексе выполняет РПЭ (Kay P., 2013; Strauss O., 2005). Географическая атрофия (ГА) с захватом фовеа (сухая форма) и хориоидальная неоваскуляризация (ХНВ) (влажная форма) связаны с существенными, прогрессирующими нарушениями зрения и являются проявлениями поздней стадии ВМД (Ferris F.L., 2013; Lim L.S., 2012). При ведении пациентов были описаны случаи трансформации одной формы поздней стадии ВМД в другую (Kaszubski P., 2016; Gemenetzi M., 2016; Bhisitkul R.B., 2015; Saade C., 2014), указывающие на то, что оба клинических фенотипа не являются взаимоисключающими и могут присутствовать в одном глазу. Активно обсуждается проблема «макулярной атрофии» (МА), которая может возникать в исходе регресса ХНВ или же на фоне антиангиогенной терапии влажной формы ВМД (Horani M., 2020; Koizumi H., 2020; Horani M., 2019; Плюхова А.А., 2018; Sadda S.R., 2018; Gemenetzi M., 2016; Bhisitkul R.B., 2015). Углубленное изучение и сравнительная оценка различных видов атрофии имеет научный и практический интерес. Мультимодальная визуализация с применением различных инструментальных методов предоставляет детальную информацию о состоянии структур заднего отдела глаза и является полезным инструментом для диагностики и мониторинга данной патологии, включая атрофическую форму ВМД (Metrangolo C., 2021; Corvi F., 2021; Sadda S.R., 2018; de Carlo T.E., 2015; Coscas G., 2009; Spaide R.F., 2008; Bindewald A., 2005; Holz F.G., 2007). Поиск качественных и количественных морфологических признаков, полученных с помощью современных методов исследования, и их последующий консенсусный анализ представляет ценность для персонализированного прогноза прогрессирования заболевания и разработки новых стратегий лечения.

     Несмотря на то, что этиология ВМД до сих пор неизвестна, ее патогенез связывают с участием иммунологических механизмов (Ten Berge J.C., 2019; Абдулаева Э.А., 2018; Kersten E., 2017; Kauppinen A., 2016; Мухамедьянова А.Ш., 2014; Jonas J.B., 2012; Patel M., 2008). Исследования цитокинов как важнейшего звена иммунорегуляции проводились на разных стадиях заболевания, однако данные публикаций достаточно противоречивы и посвящены ограниченному спектру иммуномедиаторов, что указывает на необходимость дальнейших исследований на широкой панели цитокинов (Pugazhendhi A., 2021; Krogh N.M., 2020; Ten Berge J.C., 2019; Pongsachareonnont P., 2018; Sakamoto S., 2018; Liu F., 2016; Rezar-Dreindl S., 2016; Слепова О.С., 2015; Falk M.K., 2014; Roh M.I., 2009). Особенности локальной и системной продукции медиаторов различного биологического действия при ГА и МА на фоне антиангиогенной терапии остаются малоизученными, их роль в механизмах формирования основных фенотипов поздней ВМД до настоящего времени не определена (Слепова О.С., 2015; Jonas J.B., 2012). По данным литературы, широкие вариации показателей локального цитокинового статуса (вазорегуляторных и трофических факторов роста) относительно нормы (от гипо- до гиперпродукции) на поздних стадиях заболевания оказывают влияние на функциональные результаты лечения антиангиогенными препаратами (Нероев В.В., 2012–2013).

    Изучение локальных механизмов непосредственно в тканях глаза с выявлением закономерностей формирования интраокулярных профилей медиаторов на поздних стадиях ВМД, в особенности, атрофической формы, сложен для решения в клинике и практически не обсуждается в литературе. Неоценимую помощь в данном направлении может оказать исследование локальных иммунологических механизмов, ассоциирующихся с указанной офтальмопатологией в эксперименте на животных моделях, для дальнейших исследований регуляторных процессов, приводящих к атрофии РПЭ.

    Таким образом, ВМД, в особенности, атрофическая форма, остается серьёзной проблемой, стоящей перед системой здравоохранения и обуславливает актуальность изучения патогенетических, клинико-морфометрических и иммунологических особенностей развития и прогрессирования данной патологии. Активно ведется поиск клинико-инструментальных признаков, которые представляют ценность для персонализированного прогноза прогрессирования заболевания. Несмотря на большую выборку диагностических методов исследования в клинической практике, отмечается ценность лабораторных методов с целью прояснения молекулярных механизмов патогенеза ВМД, который до сих пор не до конца изучен. Более глубокое понимание, лежащих в основе патологических механизмов, в последующем позволит предотвратить прогрессирование и разработать новые стратегии лечения дегенеративных заболеваний сетчатки.

    Цель исследования

    Определение клинико-иммунологических особенностей атрофической и влажной форм ВМД; изучение закономерностей локальной экспрессии основных медиаторов воспаления и вазорегуляции, ассоциирующихся с атрофией ретинального пигментного эпителия в эксперименте.

    Задачи исследования

    1. Дать сравнительную оценку клинико-морфометрических признаков ВМД, ассоциированных с географической и макулярной атрофией.

    2. Провести качественный и количественный анализ аутофлюоресценции глазного дна при атрофических формах ВМД, позволяющий оценить распространенность и степень поражения ретинального пигментного эпителия.

    3. Установить особенности системной и локальной продукции цитокинов различного биологического действия при атрофической и влажной формах ВМД.

    4. На основании комплексного анализа клинико-морфометрических и лабораторных данных выделить ключевые иммуномедиаторы, связанные с патологическими изменениями при различных вариантах поздней ВМД: географическая атрофия и нелеченная влажная форма.

    5. Изучить закономерности локальной экспрессии генов основных воспалительных, трофических и вазопролиферативных факторов при атрофии ретинального пигментного эпителия в эксперименте.

    6. Провести возможные параллели между показателями локальной продукции ключевых медиаторов при атрофической форме ВМД в клинике и тканевой экспрессии генов, их кодирующих в эксперименте.

    Научная новизна исследования

    1. Проведен комплексный сравнительный анализ клинико-морфологических особенностей при поздних формах ВМД, сопровождающих географическую и макулярную атрофию. Дана качественная и количественная оценка результатов исследования аутофлюоресценции (АФ) глазного дна при атрофических формах ВМД, позволяющая оценить степень вовлеченности и поражения структур заднего отдела глаза, в частности, РПЭ.

    2. Определены прямые умеренные взаимосвязи между площадью атрофического фокуса и локальной продукцией IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MCP-1/CCL2, SDF-1α/CXCL12, RANTES/CCL5, свидетельствующие о важном вкладе системы хемокинов в патогенез атрофической формы ВМД.

    3. Установлены обратные зависимости между высотой отслойки пигментного эпителия и содержанием IL-15 и LIF в слезной жидкости у пациентов с нелеченной ХНВ, позволяющие сделать вывод о нарушении регуляции локальных нейротрофических механизмов, формирующихся при данной патологии.

    4. Впервые на основании скрининга широкой панели цитокинов определены значимые системные и локальные сдвиги в звеньях про-/противовоспалительных медиаторов, хемоаттрактантных белков, регуляторов гемопоэза и комплекса факторов роста с вазопролиферативной активностью, ассоциирующиеся с определенным клиническим фенотипом ВМД. Выявлено, что географическая атрофия, макулярная атрофия и нелеченная влажная форма ВМД связаны с нарушениями преимущественно в локальном цитокиновом статусе. При этом в основе географической и макулярной атрофии на фоне антиангиогенной терапии лежат разные иммунологические механизмы.

    5. Впервые обнаружены достоверные изменения продукции медиаторов с ангиогенной активностью относительно нормы однонаправленного (HGF, EGF) и разнонаправленного (IL-18, IL-1RA, VEGF-A) характера на локальном и системном уровнях в группе с нелеченной влажной формой ВМД, которые свидетельствуют о многофакторной регуляции глазного ангиогенеза и указывают на необходимость углубленных исследований их участия в механизмах развития заболевания.

    6. Впервые изучены закономерности локальной экспрессии генов медиаторов иммунного ответа, трофических и вазорегулирующих факторов роста, а также белка плотных контактов ZO-1 в тканевом комплексе «сетчатка/РПЭ/хориоидея» в норме и при моделировании атрофии РПЭ в эксперименте. Выделены типы ответов со стороны тканевого комплекса, ассоциированных с моделируемой офтальмопатологией, что объясняет широкие вариации ряда иммунологических показателей на локальном уровне у пациентов с атрофической формой ВМД.

    7. Выделены однонаправленные сдвиги от нормы локальной продукции МСР-1/CCL2 в клинике и экспрессии гена, его кодирующего, в тканевом комплексе при субретинальном введении бевацизумаба относительно нормы в эксперименте, свидетельствующие об общей патогенетической основе местного поражения.

     Практическая значимость

    1. Показано, что оптическая когерентная томография (ОКТ) и оптическая когерентная томография в режиме ангиографии (ОКТ–А) являются ценными методами для определения особенностей микроизменений в нейросенсорной сетчатке, РПЭ и хориоидее при атрофических формах ВМД.

    2. Качественный и количественный анализ исследования на АФ глазного дна при атрофических формах ВМД позволяет выделить различные паттерны атрофии, влияющие на прогноз заболевания.

    3. Выявлены корреляции между морфометрическими параметрами и содержанием цитокинов в слезной жидкости в группах с географической атрофией и нелеченной ХНВ, нуждающиеся в последующей валидации в качестве биологических маркеров.

    4. Выявленные общие закономерности сдвига МСР-1/CCL2 на локальном уровне в клинике и при моделировании атрофии РПЭ субретинальным введением бевацизумаба в эксперименте позволяют использовать данную модель для детального изучения патогенеза и отработки новых терапевтических стратегий лечения заболевания.

    Методология и методы исследования

    Методологической основой диссертационной работы стало последовательное применение методов научного познания. Выполнение работы проводили с использованием комплекса клинических, инструментальных, иммунологических, молекулярно-биологических, аналитических и статистических методов исследования.

    Основные положения, выносимые на защиту

    1. На основании комплексного обследования, включающего ОКТ, ОКТ-А и АФ глазного дна, выделены и проанализированы характерные изменения в нейросенсорной сетчатке, РПЭ и хориоидее, которые могут быть диагностическими детерминантами распространения атрофического поражения при различных формах ВМД.

    2. На основании скрининга широкой панели цитокинов определены достоверные системные и локальные сдвиги в звеньях про-/противовоспалительных медиаторов (IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-15, IL-18, LIF), хемоаттрактантных белков (IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, SDF-1α/CXCL12, MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, RANTES/CCL5, Eotaxin/CCL11), регуляторов гемопоэза (IL-7) и комплекса факторов роста с вазопролиферативной активностью (EGF, HGF, PDGF-BB, VEGF-А), связанные с определенным клиническим фенотипом ВМД и указывающие на их вклад в патогенез заболевания.

    3. На основании обширного корреляционного анализа установлены взаимосвязи между клинико-морфометрическими параметрами и показателями локальной продукции хемоаттрактантных белков (IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MCP-1/CCL2, SDF-1α/CXCL12 и RANTES/CCL5) при географической атрофии и медиаторов, обладающих трофическими свойствами (IL-15 и LIF) при нелеченной ХНВ.

    4. Установлены закономерности тканевой экспрессии генов цитокинов иммунного ответа IL-1β, IL-18, МСР-1/CCL2, трофических и вазорегулирующих факторов VEGF-A, PEDF, а также белка плотных контактов ZO-1 в тканевом комплексе в норме и при моделировании атрофии РПЭ в эксперименте на кроликах.

    5. Однонаправленные изменения локальной продукции МСР-1/CCL2 в клинике и экспрессии гена, его кодирующего, в тканевом комплексе при субретинальном введении бевацизумаба относительно нормы в эксперименте свидетельствуют об общей патогенетической основе местного поражения при атрофии РПЭ, что позволяет использовать данную модель для детального изучения патогенеза и отработки новых терапевтических стратегий лечения заболевания.

    Внедрение результатов исследования в практику

    Результаты настоящего исследования внедрены в клиническую практику отдела патологии сетчатки и зрительного нерва, отдела иммунологии и вирусологии, а также взрослого консультативно-поликлинического отделения ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России. Материалы диссертации включены в программы лекций для клинических ординаторов, на курсах повышения квалификации специалистов, сертификационных циклах последипломного образования для врачей-офтальмологов, проводимых на базе ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России. Полученные экспериментальные данные используются для изучения дегенеративных процессов в сетчатке.

    Степень достоверности

    Необходимый и репрезентативный объём проанализированных данных, количество обследованных пациентов, результаты исследований на основе современных методов диагностики, применение корректных методов статистической обработки определяют степень достоверности результатов проведенных исследований. Основные положения диссертационной работы и результаты клинических и экспериментальных исследований доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: XII и XIII Российском общенациональном офтальмологическом форуме (Москва, 2019, 2020); III Всероссийской конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Естественнонаучные основы медико-биологических знаний» (Рязань, 2021); VII Российском конгрессе лабораторной медицины (Москва, 2021).

    Апробация диссертационной работы состоялась 15 июля 2021 года на объединенной научной конференции отделений ФГБУ «НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России.

    Публикации

     По материалам диссертации написано 15 печатных работ, из них опубликовано 6 в журналах, рекомендуемых ВАК (5 статей также включены в международную базу Scopus). Получено 6 патентов РФ на изобретение: № 2709247 от 17.12.2019 г.; № 2727000 от 17.07.2020 г.; № 2731062 от 28.08.2020 г.; № 2745323 от 23.03.2021г.; № 2750940 от 06.07.2021г; № 2758662 от 01.11.2021г. Поданы заявки на изобретение: № 2021105859 от 09.03.2021г.; № 2021111413 от 22.04.2021г.; № 2021124325 от 17.08.2021г.

    Структура и объем диссертации

    Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, в которых представлены обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы. Работа иллюстрирована 89 рисунками и 12 таблицами. Библиографический указатель содержит 271 источник (49 отечественных и 222 зарубежных).

    

Содержание работы



    Диссертационная работа включает в себя две части: экспериментальную и клиническую. Работа была проведена на базе отдела патологии сетчатки и зрительного нерва (руководитель отдела – д.м.н., проф., академик РАН В.В. Нероев), иммунологии и вирусологии (руководитель – к.б.н. Н.В. Балацкая), взрослого консультативно-поликлинического отделения (начальник отдела - к.м.н. Н.В. Пак) и научно-экспериментального центра (руководитель – к.б.н. А.И. Щипанова) ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России в период с 2018 по 2021 гг.

    Материалы и методы

    Общая характеристика клинических и экспериментальных групп

    Настоящая работа основана на обследовании и анализе результатов 70 пациентов с 3 и 4 стадией ВМД по классификации AREDS, которые были разделены на 3 группы: первая группа включала 24 человек (35 глаз) с друзо-ассоциированной ГА (первичной атрофией, образованной за счет резорбции друз или аваскулярных отслоек пигментного эпителия (ОПЭ)) без признаков ХНВ – из них 4 мужчин и 20 женщин, в возрасте от 48 до 83 (в среднем 71,7±2,51) лет, со средней максимально корригированной остротой зрения (МКОЗ) 0,4±0,05; вторая группа включала 22 человек (23 глаза) c МА (вторичной атрофией, развившейся на фоне лечения ингибиторами ангиогенеза влажной формы ВМД) – из них 4 мужчин и 18 женщин, в возрасте от 50 до 84 (в среднем 70,8±2,2) лет, со средней МКОЗ 0,3±0,05, которые получили инъекции ингибиторов ангиогенеза в диапазоне от 1 до 15 (в среднем 6±0,83) на протяжении 6 лет с момента первого укола; третья группа включала 24 человек (27 глаз) c влажной формой ВМД, ранее не получавших антиангиогенную терапию – из них 7 мужчин и 17 женщин, в возрасте от 50 до 82 (в среднем 69,7±1,6) лет, со средней МКОЗ 0,4±0,05. Данная группа была разделена на 4 подгруппы в зависимости от типа ХНВ: первая подгруппа – со скрытом типом ХНВ (9 глаз); вторая подгруппа – с классическим типом ХНВ (2 глаза); третья подгруппа – со смешанным типом ХНВ (12 глаз); четвертая подгруппа – с ретинальной ангиоматозной пролиферацией (4 глаза). В группу контроля вошли 25 человек (35 глаз) без зрительной патологии, сопоставимых по возрасту и полу.

    Комплексное обследование пациентов клинических групп включало: сбор анамнеза; стандартное офтальмологическое обследование (визометрию, авторефрактометрию, офтальмотонометрию, биомикроскопию переднего и заднего отделов глаза), выполненное автором самостоятельно; фоторегистрацию глазного дна, осуществлявшуюся с помощью широкопольной конфокальной фундус-камеры EIDON «СenterVue» (Италия); ОКТ, проведенной с помощью ретиноангиотомографа Spectralis HRA+OCT «Heidelberg Engeneering» (Германия) с оценкой витреоретинального, ретинохориоидального, хориосклерального интерфейсов (исследование выполняли в следующих режимах: инфракрасное отражательное изображение (IR), синее лазерное флюоресцентное изображение BluePeak (BAF) с использованием программного обеспечения RegionFinder версии 2,4, многоцветное изображение (MultiColor), улучшенная глубина изображения – Enhanced Depth Imagine (EDI–ОКТ) и ангиография). Специализированные методы исследования проведены совместно с к.м.н. Н.В. Нероевой и к.м.н. М.В. Рябиной.

    С целью оценки локальных иммунологических показателей исследовали слезную жидкость (СЖ) из глаз с атрофическими и влажными формами ВМД. Системные иммунологические сдвиги оценивали по результатам тестирования сыворотки крови (СК). Забор СК и СЖ проводили до каких-либо манипуляций. СЖ (без стимуляции) отбирали стерильной градуированной пипеткой из нижнего конъюнктивального свода в объеме 25-50 мкл в микропробирки «Eppendorf». Кровь забирали из локтевой вены в стерильные вакуумные пробирки без активатора свертывания. СК получали, используя стандартные методики. До проведения исследования собранный биоматериал хранили при температуре -70°С. Методом мультиплексного анализа на платформе хMAP (прибор MAGPIX, «Luminex Corporation», США) в программе Luminexx PONENT 3.1, наборов Procarta Plex («eBioscience», Австрия) в пробах определяли концентрации 45 цитокинов: IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, IFN-α, IFNγ, IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, SDF-1α/CXCL12, MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, RANTES/CCL5, Eotaxin/CCL11, TNFα, TNF-β, GM-CSF, VEGF-A, VEGF-D, FGF-2, EGF, PDGF-BB, HGF, SCF, GRO-α, NGF-β, BDNF, LIF, PIGF-1. Исследования проводили согласно инструкциям производителя (Millipore, Берлингтон, Массачусетс, США) с учетом минимальной границ чувствительности метода в отделе иммунологии и вирусологии совместно со с.н.с. отдела иммунологии и вирусологии И.Г. Куликовой и н.с. А.С. Андрюшиным под руководством начальника отдела (к.б.н. Н.В. Балацкая).

    В экспериментальное исследование были включены 41 кролик породы новозеландских альбиносов в возрасте 2,5-3,0 мес. и весом 2,0-2,5 кг. Группу контроля составили соматически здоровые кролики (6 глаз) без зрительной патологии. Остальные 35 кроликов были разделены на две группы в зависимости от способа моделирования, разработанных на базе отдела патологии сетчатки и зрительного нерва ФГБУ «НМИЦ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России (патент № 2709247 от 17.12.2019 г.; патент № 2727000 от 17.07.2020 г.): в первой группе кроликам (17 глаз) в субретинальное пространство под сетчатку на расстоянии 1-1,5 мм книзу от диска зрительного нерва с формированием пузырька однократно вводили 0,01 мл 0,9 % физиологического раствора хлорида натрия (ФР), а во второй группе (18 глаз) - раствор бевацизумаба в аналогичном объеме. Для оценки структур заднего отдела глаза и верификации атрофических изменений всем кроликам до и после оперативного вмешательства, соответственно 1, 4, 8, 12 и 24 неделям, была проведена ОКТ, включая режимы Multicolor и АФ. Работа выполнена совместно с к.м.н. Н.В. Нероевой, к.м.н. М.В. Рябиной и к.м.н. П.А. Илюхиным.

    В указанные выше сроки наблюдений животные были выведены из эксперимента под наркозом, в последующем автором самостоятельно выполнена энуклеация глаз. Из выделенных глаз кроликов опытных и контрольной групп согласно стандартным протоколам, выделяли тканевой комплекс (ТК) «сетчатка/РПЭ/хориоидея», который в дальнейшем служил материалом для молекулярно-биологического исследования (полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией в реальном времени). Данная манипуляция проведена совместно с сотрудником отдела патологической анатомии и гистологии глаза врачом патологоанотомом А.М. Майбогиным. Полученный биоматериал помещали в криопробирки и хранили при температуре -70°C до проведения исследований. Выделяли мРНК сорбентно-колоночным методом с последующим синтезом кДНК. Амплификацию, полученных фрагментов кДНК в ходе ПЦР с обратной транскрипцией, проводили отдельно для каждого из исследуемых и референсного генов по разработанным протоколам в отделе иммунологии и вирусологии совместно с врачом-вирусологом Е.В. Светловой под руководством начальника отдела (к.б.н. Н.В. Балацкая) (патент № 2731062 от 28.08.2020 г.; патент № 2745323 от 23.03.2021г.; патент № 2750940 от 06.07.2021г.). На индуцированных моделях атрофии РПЭ, созданных путем субретинального введения ФР и бевацизумаба кроликам, проведена оценка экспрессии генов цитокинов IL-1β, IL-18, MCP-1/CCL2, VEGF-A, PEDF и ZO-1 в ТК «сетчатка/РПЭ/хориоидея». Поскольку при проведении морфометрии глазного дна и определении уровней экспрессии генов в ТК животных моделей не было обнаружено различий между изучаемыми показателями в контрольных точках, соответствовавших 4, 8, 12 и 24 неделям сформированной атрофии РПЭ, то анализ результатов в каждой из опытных групп, включая сравнение между ними, проведен за весь период наблюдения от 4 до 24 недель.

    Статистическая обработка результатов исследования

    Математическая и статистическая обработка полученных данных выполнена автором самостоятельно с использованием стандартных пакетов прикладных программ MS Excel и Biostat v5. Определяли среднюю арифметическую (М), стандартную ошибку среднего арифметического (m), стандартное отклонение (σ), медиану (Me), минимальные и максимальные значения (min-max), значения верхнего и нижнего процентилей. Оценку на нормальность распределения количественных показателей выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Статистическая обработка результатов проведенного исследования представлена в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего арифметического (М±m) для нормального распределения значений, а для значений, не подчиняющихся нормальному распределению, в виде Me [25;75], где Me - медиана, 25% - первый, 75% - третий процентили или Me с указанием (min-max). Качественные переменные представлены как в абсолютных (абс.), так и относительных (%) значениях. При сравнении количественных величин близких к нормальному использован t-критерий Стьюдента, а для данных, не подчиняющихся нормальному распределению - U-критерий Манна-Уитни. Анализ качественных признаков в таблицах сопряженности проведен с применением точного критерия Фишера. Для выявления статистически значимых различий при сравнении более двух групп был применен непараметрический критерий Краскела-Уоллиса. Для оценки связи между двумя показателями, распределение которых отличается от нормального, использован коэффициент ранговой корреляции rxy Спирмена. Исходя из полученного значения rxy, определяли тесноту связи по шкале Чеддока и ее направление (прямая или обратная). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принят равным p<0,05.

    

Результаты собственных исследований (клиническая часть)



    Клинико-морфометрическая характеристика и сравнительная оценка атрофических форм ВМД

    Мультимодальная визуализация с применением различных инструментальных методов обследования играет ключевую роль в диагностике и мониторинге ВМД, в частности, атрофических форм. В нашей работе на основании данных офтальмоскопии и ОКТ пациентов с ГА и МА проведена оценка основных клинико–морфологических признаков заболевания, частота их встречаемости с последующим сравнительным анализом между исследуемыми группами (табл. 1). В ходе анализа были выявлены достоверные различия в частоте встречаемости, анализируемых признаков, в той или иной группе. Так, при оценке степени атрофии РПЭ обнаружено, что полная атрофия пигментного эпителия и наружных слоев сетчатки (cRORA) с захватом фовеа была достоверно выше в первой группе с ГА (p<0,05). Во второй группе с МА значимо преобладала неполная атрофия пигментного эпителия и наружных слоев сетчатки (iRORA) без захвата фовеа. Сравнительный анализ ОКТ-критериев между первой и второй группами показал, что тубуляцию фоторецепторов достоверно чаще встречали в первой группе в 10 (28,6%) глазах с ГА (р<0,05), в то время как в группе с МА данный признак определяли только в 1 (4,3%) глазу. У обследованных пациентов с ГА в 3 (8,3%) глазах диагностированы интраретинальные полости дегенеративного характера.

     В отличие от пациентов первой группы с ГА, у пациентов с МА в 12 (52,2%) глазах определяли неоваскулярную ОПЭ, субретинальный фиброз в 3 (13%) глазах, субретинальную жидкость с отслойкой нейроэпителия в 2 (8,7%) глазах и интраретинальную жидкость в 8 (34,7%) глазах. В 1 (4,3%) глазу диагностировали прехориоидальную щель. На момент обследования пациентов во второй группе с МА, ранее получавших антиангиогенную терапию, в 11 (47,8%) глазах не обнаружено признаков активности ХНВ. Наряду с определением качественных признаков у пациентов с ГА и МА, нами также проведена сравнительная оценка количественных данных между исследуемыми группами и с группой контроля. В ходе количественной оценки площадь атрофии в первой группе ГА составляла в среднем 5,6±4 mm2, а в группе с МА – 2,1±1,6 mm2. При сравнительном анализе между исследуемыми группами было обнаружено, что данный параметр статистически выше в первой группе с ГА (р<0,05).

    При проведении морфометрического анализа наблюдали достоверно значимое уменьшение субфовеальной толщины хориоидеи и средней толщины сетчатки в макулярной зоне в исследуемых группах с ГА и МА по сравнению с группой контроля (p<0,05) (табл. 2). При этом в ходе сравнительного анализа субфовеальной толщины хориоидеи при различных типах нелеченной ХНВ (нХНВ) в третьей группе нами впервые было обнаружено статистически значимое различие: снижение субфовеальной толщины хориоидеи наблюдали во всех подгруппах относительно контроля, за исключением первой подгруппы со скрытым типом ХНВ (р<0,05) (табл. 3). Отличия в субфовеальной толщине хориоидеи между тремя основными исследуемыми группами были статистически недостоверными в исследуемой выборке.

    Особенности паттернов аутофлюоресценции при атрофических формах ВМД

    В ходе анализа особенностей АФ в зоне соединения на границе между атрофическими изменениями и нормальной сетчаткой у пациентов с ГА и МА было зафиксировано отсутствие гиперфлюоресцентного ободка в одних случаях и его наличие - в других (рис. 1). В зависимости от наличия, конфигурации и распространенности АФ вокруг зоны атрофии выделены паттерны (Bindewald A., 2005):

    - фокальный паттерн диагностировали как одиночные или множественные фокусы усиленной АФ по краю атрофического очага;

    - окаймляющий паттерн визуализировали как полосу, окружающую всю атрофическую зону;

    - неоднородный паттерн определяли в виде пятнистых неоднородных зон увеличенной, но менее интенсивной АФ, выходящих за пределы атрофического фокуса;

    - при диффузном паттерне отмечали повышенную АФ, которая не ограничивалась краем атрофического фокуса и могла распространяться по всему заднему полюсу.

    При оценке частоты встречаемости типов паттернов в первой (с ГА) и второй (с МА) группах и их последующего сравнительного анализа, отмечено, что у пациентов с ГА в 10 (28,6%) глазах обнаружен диффузный паттерн, в 8 (22,9%) глазах - фокальный тип и в 5 глазах (14,3%) гиперфлюресцентный ободок отсутствовал. Кроме того, у пациентов с ГА выявлены неоднородный и окаймляющий типы паттернов, в отличие от пациентов с МА (р<0,05). У пациентов с МА в 4 (17,4%) глазах диагностировали фокальный тип, в 6 (26,1%) глазах гиперфлюоресцентный ободок отсутствовал, в 13 (56,5%) глазах определяли диффузный тип паттерна, при этом частота встречаемости данного паттерна была достоверно выше во второй группе (р<0,05). Углубленный анализ с выделением типа паттерна при проведении АФ глазного дна полезна для выявления диагностических детерминантов распространения атрофического поражения.

    Оптическая когерентная томография в режиме ангиографии в диагностике атрофических форм ВМД

    Пациентам первой группы OКT-A проводили с прицельной оценкой границ атрофического фокуса для исключения/подтверждения наличия ХНВ. Вследствие атрофии РПЭ в исследуемых глазах с ГА на уровне аваскулярного слоя визуализировали компланарные структуры, принадлежащие хориоидальному слою, которые смещались кпереди и имитировали ХНВ. У всех пациентов во второй группе на сканах ОКТ-А соответственно зонам атрофии РПЭ на уровне аваскулярного слоя также визуализировали хориоидальные сосуды, которые артефактически реплицировались, принимая сходную картину с ХНВ. В 12 (52,2%) глазах с МА, наряду с атрофическими изменениями, диагностировали ХНВ в проекции аваскулярного слоя. При визуализации сосудистой сети было зафиксировано, что зона атрофии в 10 (43,5%) глазах вплотную примыкала к ХНВ (p<0,05).

    Изучение особенностей локальной и системной продукции цитокинов различного биологического действия при атрофической и влажной формах ВМД

    Нами был проведен многоступенчатый анализ сдвигов исследуемых цитокинов на локальном и системном уровнях и определена частота их встречаемости в тест-пробах всех групп со сравнительной оценкой относительно контроля.

    В СК пациентов контрольной группы из 45 исследуемых цитокинов выявлены 32, среди которых в 68-100% проб обнаружили хемокины и вазорегуляторные, трофические факторы IP-10/CXCL10, SDF-1α/CXCL12, MCP-1/CCL2, MIP-1β/CCL4, RANTES/CCL5, Eotaxin/CCL11, VEGF-A, EGF, PDGF-BB, HGF, SCF, BDNF, LIF, PIGF-1. Остальные медиаторы определены в небольшом количестве проб, в ряде случаев их концентрации находились ниже предела минимальной чувствительности тест-системы, что делало невозможным проведение статистического анализа. В СЖ контрольной группы из линейки исследуемых цитокинов определены 22 цитокина, среди которых в подавляющем числе тест-проб (88,6-100%) обнаруживали IL-7, Gro-α, IP-10/CXCL10, MCP-1/CCL2, MIP-1β/CCL4, Eotaxin/CCL11, VEGF-A, EGF, PDGF-BB, HGF. Более чем у половины здоровых доноров в СЖ выявляли IL-1β (54,3%), IL-1RA (68,6%), IL-8/CXCL8 (57,1%), LIF (65,7%), PIGF-1 (60%). В ходе исследования в первой группе (с ГА) выявлены достоверные изменения концентраций 8 цитокинов по сравнению с контролем: так в СК пациентов с ГА было достоверно снижено содержание IL-18 и IL-2, в то время как показатели IP-10/CXCL10, SDF-1α/CXCL12, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, Eotaxin/CCL11, VEGF-A значимо превышали относительно контроля (p<0,05) (табл. 4). Анализ локальной продукции цитокинов в данной группе показал статистически значимые изменения концентраций по сравнению с таковыми в контроле: повышение содержания IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-7, IL-8/CXCL8, IL-15, IL-18, SDF-1α/CXCL12, MCP-1/CCL2, MIP-1β/CCL4, RANTES/CCL5, VEGF-A, EGF, HGF, а также снижения уровня PDGF-BB (p<0,05) (табл. 5). В СК пациентов с МА отмечено достоверное снижение содержания сывороточных IL-2, SDF-1α/CXCL12, RANTES/CCL5 и PDGF-BB по сравнению с нормой при статистически значимом повышении уровня IL-RA (p<0,05) (табл. 4). В СЖ пациентов второй группы зафиксированы достоверные разнонаправленные изменения локальной продукции 11 из исследуемых цитокинов по сравнению с контролем: повышение содержания в СЖ IL-2, IL-15, IL-18, IL-8/CXCL8, MIP-1β/CCL4, SDF-1α/CXCL12, VEGF-A, HGF, EGF и снижение уровней Eotaxin/CCL11 и PDGF-BB (p<0,05) (табл. 5).

    В группе с нелеченной влажной формой ВМД статистически значимые сдвиги от нормы отмечены для 5 сывороточных цитокинов (IL-RA, RANTES/CCL5, EGF, PDGF-BB и HGF): обнаружен достоверный подъем уровней IL-RA, EGF и HGF при снижении концентраций RANTES/CCL5 и PDGF-BB по сравнению с контролем (p<0,05) (табл. 4). В СЖ пациентов третьей группы выявлены статистически значимые изменения продукции 12 цитокинов относительно нормы: увеличение локальных уровней IL-1β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-8/CXCL8, MIP-1β/CCL4, VEGF-A, HGF и EGF, при снижении концентраций Eotaxin/CCL11, PDGF-BB и LIF (p<0,05) (табл. 5).

    При сравнительном анализе широкой панели цитокинов на системном уровне были зафиксированы статистически значимые сдвиги 6 хемоаттрактантных медиаторов, которые различали первую и вторую группы: так при ГА обнаружили существенное усиление системной продукции IP-10/CXCL10 (p=0,01), SDF-1α/CXCL12 (p=0,0001), MIP-1α/CCL3 (p=0,007), MIP-1β/CCL4 (p=0,04), RANTES/CCL5 (p=0,003) и Eotaxin/CCL11 (p=0,004), по сравнению с группой МА. Также выявлены достоверные изменения концентраций 4 хемокинов, которые явились отличительной особенностью первой группы при сравнении с третьей, а именно: увеличением содержания IP-10/CXCL10 (p=0,04), SDF-1α/CXCL12 (p=0,0002), RANTES/CCL5 (p=0,009) и Eotaxin/CCL11 (p=0,006) в СК пациентов с ГА. Значимые сдвиги на системном уровне HGF (p=0,02) и LIF (p=0,01) с их усиленной продукцией были зафиксированы в третьей группе с нелеченной влажной формой ВМД относительно второй группы с МА (табл. 4).

    Сравнительный анализ локальной продукции цитокинов в группах показал достоверное увеличение содержания IL-1RA (р=0,02), IL-7 (р=0,02), IL-8/CXCL8 (р=0,03), Eotaxin/CCL11 (р=0,01) и EGF (р=0,02) в СЖ больных с ГА по сравнению с таковыми у больных с нХНВ. Кроме того, достоверные изменения в содержании 4 медиаторов в СЖ отличали первую и вторую группы: так при МА обнаружено существенное ослабление локальной продукции IL-2 (р=0,02), IL-1RA (р=0,01), RANTES/CCL5 (р=0,001) и Eotaxin/CCL11 (р=0,001) по сравнению с ГА. При этом достоверное повышение концентрации Gro-α (р=0,03), относительно таковой во второй группе, было определено в СЖ пациентов с нелеченной влажной формой ВМД (табл. 5).

    В ходе анализа полученных данных установлено, что ГА, МА и нелеченная влажная форма ВМД ассоциируются с иммунологическими нарушениями преимущественно на локальном уровне. При исследовании значимых отклонений цитокинов в СК и СЖ относительно нормы выявлено, что в 63,1% случаев сдвиги в группе с МА были схожи с изменениями в группе с нелеченной влажной формой ВМД и примерно в 21 % случаев – с ГА, что указывает на разные иммунологические механизмы ГА и МА. В ходе работы также выполнен корреляционный анализ между показателями изучаемых цитокинов в исследуемых группах. При оценке, полученных данных, отмечается большее количество корреляционных связей на локальном уровне, что представляет собой интерес и указывает на необходимость дальнейших исследований с целью выяснения точного механизма их взаимодействия и лучшего понимания патогенеза заболевания.

    На основании обширного корреляционного анализа между клиническими параметрами и иммунологическими сдвигами в первой группе с ГА установлена прямая умеренная взаимосвязь между площадью атрофического фокуса и уровнями локальной продукции IL-8 (r=0,48, p=0,01), IP-10 (r=0,39, p=0,03), MCP-1 (r=0,4, p=0,02), SDF-1α (r=0,45, p=0,01) и RANTES (r=0,49, p=0,01) (рис. 2). Обратная умеренная связь между высотой ОПЭ и продукцией следующих цитокинов была обнаружена в третьей группе: IL-15 (r=-0,46, p=0,04) и LIF (r=-0,49, p=0,02), что указывает на нарушение регуляции локальных нейротрофических механизмов, формирующихся при нХНВ (рис. 3). Таким образом, впервые выявленные корреляционные взаимосвязи свидетельствуют о необходимости целенаправленных исследований данных цитокинов, которые в дальнейшем могут способствовать не только определению их диагностической значимости в качестве биомаркеров, но и предоставить возможности в разработке новых способов лечебного воздействия.

    Значимые изменения продукции ряда медиаторов с ангиогенной активностью однонаправленного (HGF, EGF) и разнонаправленного (IL-18, IL-1RA, VEGF-A) характера на локальном и системном уровнях в группе с нелеченной влажной формой ВМД относительно нормы, свидетельствуют о многофакторной регуляции глазного ангиогенеза и указывают на необходимость углубленных исследований их участия в развитии и прогрессировании заболевания. Знания о посредниках во внутриглазных неоваскулярных процессах имеют важное значение для разработки новых стратегий лечения.

    Результаты собственных исследований (экспериментальная часть)

    В рамках экспериментального исследования, на индуцированных моделях атрофии РПЭ, созданных путем субретинального введения ФР и бевацизумаба кроликам, проведена оценка экспрессии генов цитокинов IL-1β, IL-18, MCP-1/CCL2, VEGF-A, PEDF и ZO-1 в ТК «сетчатка/РПЭ/хориоидея».

     Установлено, что гены всех изучаемых факторов экспрессировались в ТК кроликов контрольной группы. При общем анализе данных обнаружено, что локальная экспрессия цитокинов иммунного ответа при двух разных способах моделирования атрофии варьировала в достаточно широком диапазоне, выходя за пределы установленного диапазона нормальных значений вплоть до гиперответа (табл. 6). В ходе исследования зафиксировано значимое повышение экспрессии МСР-1/CCL2 и ZO-1 относительно контроля (p<0,05). Стоит также отметить, что воспалительный ответ был наиболее выражен во второй группе, в которой было обнаружено статистически значимое повышение уровней мРНК IL-18, MCP-1/CCL2 и VEGF-A в ТК по сравнению с первой опытной группой (p<0,05) (табл. 6).

    Обнаруженные в ходе сопоставления данных однонаправленные сдвиги МСР-1/CCL2 при ГА в клинике (табл. 5) и экспрессии гена, его кодирующего в ТК при субретинальном введении бевацизумаба относительно контроля в эксперименте (табл. 6), указывают на его вклад в патогенез атрофической формы ВМД.

    В связи с тем, что локальный тканевой ответ при сформированной атрофии РПЭ в обеих опытных группах ассоциировался с разнонаправленными изменениями экспрессии изучаемых цитокинов в широком диапазоне (табл. 6), в ходе исследования был предпринят сравнительный анализ частоты случаев выявления их сдвигов от нормы (табл. 7).

    Корреляционный анализ полученных данных позволил выявить высокие положительные ассоциации экспрессии IL-18 и VEGF-A (r=0,81) в группе здоровых животных без поражения глаз (р<0,05). При экспериментальной атрофии РПЭ обнаружены иные зависимости изучаемых показателей. Общей особенностью обеих опытных групп (при моделировании атрофии РПЭ двумя разными способами) явилась высокая прямая корреляционная взаимосвязь между IL-18 и PEDF (коэффициенты составили 0,863 для первой группы и 0,993 – для второй) (р<0,05). Кроме того, при атрофии РПЭ, индуцированной субретинальным введением ФР, обнаружена прямая зависимость между MCP-1/CCL2 и ZO-1 (r=0,82) (р<0,05), во второй группе были определены множественные положительные ассоциации между исследуемыми цитокинами, самые высокие из которых между: MCP-1/CCL2 и PEDF (r=0,68), PEDF и IL-18 (r=0,99), PEDF и ZO-1 (r=0,96), ZO-1 и IL-18 (r=0,79), ZO-1 и IL-1β (r=0,75), PEDF и IL-1β (r=0,99) (р<0,05).

    

Выводы



    1. Сравнительный анализ клинико-морфологических признаков поздней ВМД выявил различия их характера и распространенности в группах, ассоциированных с географической и макулярной атрофией. Обнаружено, что в глазах с макулярной атрофией достоверно чаще встречали атрофические фокусы без захвата фовеа с неполной атрофией пигментного эпителия и наружных слоев сетчатки (iRORA), а в группе с географической атрофией, напротив, атрофические фокусы с захватом фовеа с полной атрофией пигментного эпителия и наружных слоев сетчатки (cRORA). Также зафиксировано, что тубуляцию фоторецепторов достоверно чаще встречали в глазах с географической атрофией (р<0,05).

    2. Установлено достоверное уменьшение субфовеальной толщины хориоидеи в исследуемых группах с географической атрофией, макулярной атрофией и нелеченной влажной формой ВМД по сравнению с контролем (р<0,05). В группе с нелеченной влажной формой ВМД наблюдали значимое уменьшение субфовеальной толщины хориоидеи во всех исследуемых подгруппах по сравнению с контролем, за исключением первой подгруппы со скрытым типом ХНВ (р<0,05).

    3. Качественная/количественная оценка АФ глазного дна и сравнительный анализ частоты встречаемости различных паттернов в группах с географической и макулярной атрофией показали, что у пациентов первой группы с географической атрофией были выявлены все пять паттернов, ранее описанных в литературе, включая неоднородный и окаймляющий, в отличие от пациентов второй группы с макулярной атрофией (р<0,05). У пациентов второй группы диагностировали только три паттерна, при этом частота диффузного типа паттерна в данной группе была достоверно выше по сравнению с первой группой (р<0,05).

    4. Установлено, что географическая атрофия, макулярная атрофия и нелеченная влажная форма ВМД ассоциируются с иммунологическими нарушениями преимущественно на локальном уровне. При исследовании значимых отклонений цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости относительно нормы выявлено, что в 63,1% случаев сдвиги в группе с макулярной атрофией были схожи с изменениями в группе с нелеченной влажной формой ВМД и примерно в 21% случаев – с географической атрофией, что указывает на разные иммунологические механизмы географической и макулярной атрофии. 5. Установлено, что географическая атрофия ассоциируется с достоверным усилением системной продукции хемоаттрактантных белков (IP-10/CXCL10, SDF-1α/CXCL12, MCP-1/CCL2, MIP-1β/CCL4, RANTES/CCL5, Eotaxin/CCL11) и VEGF-A (р<0,05). Среди значимых локальных сдвигов 14 цитокинов отмечено повышение уровней, мало изученных при поздней ВМД IL-1RA, IL-7, IL-15, SDF-1α/CXCL12 и RANTES/CCL5, выявляемых в слезной жидкости пациентов с географической атрофией (в 40-90 % случаев) достоверно чаще, чем в группе контроля. Определены прямые корреляции между площадью атрофического фокуса и локальной секрецией IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MCP-1/CCL2, SDF-1α/CXCL12 и RANTES/CCL5, свидетельствующие о важном вкладе системы хемокинов в патогенез географической атрофии. 6. Значимые изменения продукции ряда медиаторов с ангиогенной активностью однонаправленного (HGF, EGF) и разнонаправленного (IL-18, IL-1RA, VEGF-A) характера на локальном и системном уровнях в группе с нелеченной влажной формой ВМД относительно нормы, свидетельствуют о многофакторной регуляции глазного ангиогенеза и указывают на необходимость углубленных исследований их участия в развитии и прогрессировании заболевания. Достоверное снижение местной продукции LIF, обнаруженные корреляционные взаимосвязи между его содержанием в слезной жидкости и высотой отслойки пигментного эпителия (р<0,05), позволяют сделать вывод о нарушении регуляции локальных нейротрофических механизмов, формирующихся при данной форме ВМД. 7. Определены уровни мРНК цитокинов иммунного ответа (IL-1β, IL-18, МСР-1/CCL2), трофических и вазорегулирующих факторов (VEGF-A, PEDF), а также белка плотных контактов ZO-1 в тканевом комплексе «сетчатка/РПЭ/хориоидея» в норме и при экспериментальном моделировании атрофии РПЭ на кроликах. Установлено, что поражение глаз в эксперименте, ассоциируется с разнонаправленными сдвигами экспрессии мРНК изучаемых факторов (за исключением ZO-1) в широком диапазоне относительно нормы, определяющими три типа ответных реакций со стороны тканевого комплекса: отсутствие ответа/гипореактивность; нормореактивность; повышение ответа/гиперреактивность. 8. Однонаправленные изменения, характеризующиеся достоверным усилением локальной продукции МСР-1/CCL2 при географической атрофии в клинике и повышением экспрессии гена, его кодирующего, в тканевом комплексе при субретинальном введении бевацизумаба относительно нормы (р<0,05) в эксперименте, свидетельствуют об общей патогенетической основе местного поражения при атрофии РПЭ, что позволяет нам использовать данную модель для детального изучения патогенеза и отработки новых терапевтических стратегий лечения заболевания.

    

Практические рекомендации



    1. Проведение ОКТ и АФ глазного дна целесообразно включать в комплексное обследование пациентов с географической и макулярной атрофией, так как они позволяют полноценно оценить распространенность атрофических изменений, прогнозировать прогрессирование и функциональные результаты заболевания.

    2. Скрининг широкой панели цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости пациентов с поздней ВМД, сравнительный и корреляционный анализ позволили выделить ключевые факторы, ассоциированные с патогенезом, потенциальные молекулярные маркеры географической атрофии: IL-8, IP-10, MCP-1/CCL2, SDF-1α, RANTES, целенаправленная оценка клинической информативности которых будет способствовать интеграции приемов лабораторной диагностики в комплекс специализированных методов обследования при данном заболевании.

    3. Обнаруженные однонаправленные данные указывают на общую патогенетическую основу локального поражения РПЭ, характеризующиеся усилением локальной продукции МСР-1/CCL2 при географической атрофии в клинике и в эксперименте (повышение экспрессии гена в тканевом комплексе при субретинальном введении бевацизумаба). Данную экспериментальную модель можно использовать в дальнейших исследованиях для углубленного понимания патогенетической структуры и механизмов формирования атрофических изменений, а также для выявления новых терапевтических подходов к лечению.

    

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации



    1. Атрофия ретинального пигментного эпителия в эксперименте на кроликах / В. В. Нероев, Н. В. Нероева, Л. А. Катаргина, М. В. Рябина, П. А Илюхин, А. Г. Кармокова, О. А. Лосанова, А. М. Майбогин // XIII Российский общенациональный офтальмологический форум: сб. науч.-практ. конф. с междунар. участием / под ред. В. В. Нероева. – Москва, 2020. – Т. 2. – С. 481-484.

    2. Моделирование атрофии ретинального пигментного эпителия / Н. В. Нероева, В. В. Нероев, П. А. Илюхин, А. Г. Кармокова, О. А. Лосанова, М. В. Рябина, А. М. Майбогин // Российский офтальмологический журнал. – 2020. – Т. 13, № 4. – С. 58-63.

    3. Особенности локальной экспрессии мРНК, IL-1β, IL-18, CCL2/MCP-1 при моделировании атрофии пигментного эпителия и дегенерации сетчатки в эксперименте на кроликах / В. В. Нероев, Н. В. Балацкая, Е. В. Светлова, Н. В. Нероева, М. В. Рябина, А. Г. Кармокова, О. А. Лосанова, И. Ю. Черноморец, П. А. Илюхин // Молекулярная медицина. – 2021. – Т. 19, № 2. – С. 54-62.

    4. Разработка и апробация протокола оценки экспрессии гена VEGF-A в тканях глаза кролика методом ОТ-ПЦР для экспериментальных и доклинических исследований в офтальмологии / Е. В. Светлова, А. Г. Кармокова, Н. В. Нероева, Н. В. Балацкая // III Всероссийская конференция студентов и молодых ученых с международным участием «Естественнонаучные основы медико-биологических знаний»: сб. науч.-практ. конф. с междунар. участием / ред. кол.: Т. Г. Авачева, А. В. Ельцов, А. А. Кривушин. – Рязань, 2021. – С. 93-96.

    5. Смешанный (комбинированный) фенотип поздней стадии возрастной макулярной дегенерации / Н. В. Нероева, В. В. Нероев, М. В. Рябина, А. Г. Кармокова, О. А. Лосанова // Российский офтальмологический журнал. – 2021. – Т. 14, № 2. – С. 69-75.

    6. Изучение локальной экспрессии мРНК генов медиаторов воспаления в модели атрофии ретинального пигментного эпителия и дегенерации сетчатки, индуцированной субретинальным введением физиологического раствора в эксперименте у кроликов / В. В. Нероев, Н. В. Балацкая, Е. В. Светлова, Н. В. Нероева, П. А. Илюхин, М. В. Рябина, А. Г. Кармокова // Медицинская иммунология. – 2021. – Т. 23, № 4. – С. 813-818.

    7. Разработка лабораторных биомаркеров для определения тактики ведения больных на поздних стадиях возрастной макулярной дегенерации / Н. В. Балацкая, А. Г. Кармокова, И. Г. Куликова, А. Е. Андрюшин // Материалы научно-практических конференций в рамках VII Российского конгресса лабораторной медицины (РКЛМ): сборник тезисов – Москва, 2021. – С. 8.

    8. Особенности локальной экспрессии генов цитокинов иммунного ответа, трофических и вазорегулирующих факторов при моделировании атрофии ретинального пигментного эпителия / Н. В. Нероева, Н. В. Балацкая, В. В. Нероев, Е. В. Светлова, М. В. Рябина, П. А. Илюхин, А. Г. Кармокова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2021. – Т. 172, № 10. – С. 466-473.

    9. Комплексный анализ клинико-морфометрических признаков атрофических форм возрастной макулярной дегенерации / Н. В. Нероева, М. В. Рябина, А. Г. Кармокова, В. В. Нероев // Российский офтальмологический журнал. – 2021. – Т. 14, № 4. – С. 54-61.

    В том числе патенты:

    1. Пат. № 2709247 Российская Федерация, МПК7 G09B 23/28. Способ моделирования атрофии ретинального пигментного эпителия: № 2019126782 : заявл. 26.08.2019 : опубл. 17.12.2019 / Нероев В. В., Катаргина Л. А., Нероева Н. В., Рябина М. В., Зуева М. В., Цапенко И. В., Илюхин П. А., Киселёва Т. Н., Кармокова А. Г., Лосанова О. А., Майбогин А. М. ; заявитель и патентообладатель ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России. – 13 с. : ил. – Текст: непосредственный.

    2. Пат. № 2727000 Российская Федерация, МПК7 A61F 9/007, G09B 23/28. Способ моделирования атрофии ретинального пигментного эпителия: № 2019118981 : заявл. 19.06.2019 : опубл. 17.07.2020 / Нероев В. В., Нероева Н. В., Рябина М. В., Зуева М. В., Цапенко И. В., Илюхин П. А., Киселёва Т. Н., Кармокова А. Г., Лосанова О. А., Майбогин А. М. ; заявитель и патентообладатель ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России. – 10 с. : ил. – Текст: непосредственный.

    3. Пат. № 2731062 Российская Федерация, МПК7 C12Q 1/68. Способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего 1L-1β в тканях глаза кролика (Oryctolagus cuniculus), и набор для его осуществления: № 2019133560 : заявл. 22.10.2019: опубл. 28.08.2020 / Нероев В. В., Балацкая Н. В., Светлова Е. В., Нероева Н. В., Кармокова А. Г., Лосанова О. А. ; заявитель и патентообладатель ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России. – 12 с. : ил. – Текст: непосредственный.

    4. Пат. № 2745323 Российская Федерация, МПК7 C12N 15/00, C12Q 1/68. Способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего IL-18 в тканях глаза кролика Oryctolagus cuniculus, и набор для его определения: № 2020104268 : заявл. 31.01.2020: опубл. 23.03.2021 / Нероев В. В., Балацкая Н. В., Светлова Е. В., Нероева Н. В., Кармокова А. Г., Лосанова О. А. ; заявитель и патентообладатель ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России. – 13 с. : ил. – Текст: непосредственный.

    5. Пат. № 2750940 Российская Федерация, МПК7 C12N 15/00, C12Q 1/68. Способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего CCL-2 в тканях глаза кролика Oryctolagus cuniculus, и набор для его определения: № 2020126498 : заявл. 07.08.2020: опубл. 06.07.2021 / Нероев В. В., Балацкая Н. В., Светлова Е. В., Нероева Н. В., Кармокова А. Г., Лосанова О. А., Черноморец И. Ю. ; заявитель и патентообладатель ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России. – 14 с. : ил. – Текст: непосредственный. 6. Пат. № 2758662 Российская Федерация, МПК7 G01N 33/68, A61B 3/00. Способ определения показаний к антиангиогенной терапии при подозрении на влажную форму возрастной макулярной дегенерации: № 2021107234 : заявл. 19.03.2021: опубл. 01.11.2021 / Нероев В. В., Балацкая Н. В., Нероева Н. В., Рябина М. В., Кармокова А. Г., Куликова И. Г. ; заявитель и патентообладатель ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России. – 8 с. : ил. – Текст: непосредственный.

    

Список сокращений



    АФ – аутофлюоресценция

    ВМД – возрастная макулярная дегенерация

    ГА – географическая атрофия кДНК – комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

    МА – макулярная атрофия

    МКОЗ – максимально корригированная острота зрения мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота

    нХНВ – нелеченная хориоидальная неоваскуляризация

    ОКТ– оптическая когерентная томография

    ОКТ–EDI – оптическая когерентная томография

    в режиме улучшенной глубины изображения

    ОКТ–А – оптическая когерентная томография в режиме ангиографии

    ОПЭ – отслойка пигментного эпителия

    ПЦР – полимеразная цепная реакция

    РПЭ – ретинальный пигментный эпителий

    СЖ – слезная жидкость

    СК – сыворотка крови

    ТК – тканевой комплекс

    ФР – физиологический раствор хлорида натрия

    ХНВ – хориоидальная неоваскуляризация

    AREDS – Age–Related Eye Disease Study

    BDNF – нейротрофический фактор мозга

    cRORA – полная атрофия пигментного эпителия и наружных слоев сетчатки

    CXCL – хемокиновый лиганд СХС

    CXCR – рецепторы СХС-хемокинов

    EGF – эпидермальный фактор роста

    FGF – фактор роста фибробластов

    GM–SCF – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

    GRO – cвязанный с ростом онкоген

    HGF – фактор роста гепатоцитов

    IFN – интерферон

    IGF – инсулиноподобный фактор роста

    IL – интерлейкин IL-1RA – антагонист рецептора интерлейкина 1

    IP-10 – интерферон-γ-индуцированный белок 10

    iRORA – неполная атрофия пигментного эпителия и наружных слоев сетчатки

    LIF – ингибирующий фактор лейкемии

    MCP – моноцитарный хемотаксический протеин

    MIP – макрофагальный белок воспаления

    PDGF-BB – тромбоцитарный фактор роста

    PEDF – фактор пигментного эпителия

    PIGF – плацентарный фактор роста

    SCF – фактор стволовых клеток

    SDF – фактор стромальных клеток

    TNF – фактор некроза опухоли

    VEGF – фактор роста эндотелия сосудов

OAI-PMH ID: oai:eyepress.ru:avtoreferat593

Город: Москва
Дата добавления: 25.11.2021 12:01:10, Дата изменения: 18.02.2022 13:55:03



Johnson & Johnson
Alcon
Bausch + Lomb
Reper
NorthStar
ЭТП
Rayner
Senju
Гельтек
santen
Акрихин
Ziemer
Eyetec
МАМО
Tradomed
Nanoptika
R-optics
Фокус
sentiss
nidek