3.2. Операции с формированием роговичного клапана и интрастромальным эксимерлазерным воздействием

     Опытная группа (ИнтраЛАЗИК). В опытной группе на 6-и глазах кроликов выполняли воздействие только ФСЛ, формируя роговичный клапан.

    На 6-е сутки, биомикроскопия: глаз спокоен, роговица прозрачная, определялся четкий контур сформированного клапана, глубже лежащие среды глаза не изменены. На световых микроснимках горизонтальный разрез едва заметно контурировался (стрелки), в месте бокового разреза эпителий был гиперплазирован, на краю клапана по ходу разреза вглубь (примерно на 120 мкм) в строме определялась выраженная эпителиальная пробка (звездочка), плотно контактирующая с поперечно обрезанными концами коллагеновых фибрилл (головки стрелок). Ниже места бокового разреза роговица была не изменена (рис. 14а, б).

    На трансмиссионных электронных микроснимках роговицы в зоне бокового воздействия по краю клапана определялась выраженная воспалительная инфильтрация, вызванная деструктивными изменениями после воздействия ФСЛ. Эпителий был утолщен, в верхних слоях отмечалось упорядоченное расположение отечных, отличающихся полиморфизмом поверхностных клеток и крыловидных клеток (звездочка), межэпителиальные промежутки расширены, десмосомы в соединительном межклеточном пространстве эпителиальных клеток – выражены слабо (стрелка) (рис. 15а).

    Базальные клетки имели цилиндрическую форму, отличались полиморфизмом, внутри их цитоплазмы наблюдалась перинуклеарная микровакуолизация. В основании базальных клеток имелось выраженное скопление полиморфно-ядерных лейкоцитов (круг). Базальная мембрана была обычных размеров и идентифицировалась практически на всем протяжении эпителиально-стромальной границы, где видно место ее разрыва (стрелка). Ниже она граничила с обрывками разрыхленных коллагеновых волокон (звездочка), соприкасающими ся с активно делящимися, мигрировавшими в разрез эпителиальными клетками (э) (рис. 15б).

     Содержимое эпителиальной пробки было представлено продуктами деструкции клеток стромы и в основном мигрировавшими эпителиальными клетками с кистовидными полостями в центре (рис. 15в, г). Рядом с поперечно обрезанными концами фибрилл (звездочка) и ниже бокового разреза определялось множество кератобластов с обширным резервуаром ретикулярной ткани. В поверхностных слоях стромы близко к месту бокового разреза видны сильно расширенные промежутки в межтканевом пространстве, дальше – определялся более упорядоченный ход волокон и просматривалось начало горизонтального разреза (стрелка) (рис. 16а). В зоне горизонтального разреза определялись деструктивные клеточные отложения (стрелка) в расширенных межклеточных пространствах меж-ду непрерывными коллагеновыми фибрилла-ми (круг) (рис. 16б). Эпителий и субэпители-альный слой над горизонтальным разрезом соответствовали контрольной норме. Эндотелий и прилегающая к нему строма роговицы ниже разрезов также соответствовали норме. В контрольной роговице указанных изменений не наблюдалось.

    Через 14 мес.: биомикроскопия – глаз спокоен, роговица прозрачная, виден контур клапана. На световых микроснимках место горизонтального разреза не просматривалось, а по ходу бокового разреза в области края клапана хорошо виден выраженный рубец (стрелки). Прилежащие к интрастромальному рубцу ткани и другие отделы роговицы были без изменений и соответствовали контрольной норме (рис. 17а, б). Ультраструктурный анализ роговицы кроликов показал, что клетки эпителия в зоне воздействия и в интактных зонах не различались. В области края клапана базальная мембрана имела слегка извитой ход (звездочка). В прилежащих отделах фибриллы были сохранны и соответствовали контрольной норме (рис. 18а). Основные изменения в опытных образцах были выявлены в месте бокового разреза по ходу рубца и в смежной зоне, где на фоне измененных фибрилл были видны скопления кератоцитов (К) (рис. 18б). В ниже лежащих отделах роговицы изменений обнаружено не было.

     На 8-и глазах кроликов опытной группы был выполнен ИнтраЛАЗИК.

    На 6-е сутки, биомикроскопия: глаз был спокоен, роговица – прозрачная, четко контурировался край роговичного клапана. Глубже лежащие среды глаза – не изменены.

    На световых микроснимках в строме четко просматривался интерфейс. Край клапана был заполнен эпителиальной пробкой, как описано в предыдущем разделе. В зоне абляции волокна прокрашивались менее интенсивно, они были утолщены и отечны. В смежных областях в строме выявлялось выраженное количество кератобластов. В области клапана эпителий и строма были не изменены. Ближе к интерфейсу фибриллы клапана были несколько отечны, ход их по всему горизонтальному разрезу не изменялся, а в строме иногда выявлялись активные кератоциты. Ниже эксимерлазерного воздействия роговица была не изменена и соответствовала контрольной норме.

    На электронных микроснимках эпителий в области клапана не изменился, все его слои были послойно дифференцированы. В строме роговичного клапана фибриллы располагались упорядоченно, их ход и структура не нарушались. Ближе к горизонтальному разрезу определялись единичные кератобласты на фоне несколько разрыхленных коллагеновых волокон.

     В месте горизонтального разреза непосредственно в зоне абляции определялись обширные участки скопления деструктивных клеток на фоне незначительных обрывков коллагеновых фибрилл (звездочка). Вокруг зоны абляции коллагеновые фибриллы были разрыхлены и отечны, межтканевые промежутки – значительно расширены (стрелки) (рис. 19а). В зоне, смежной с лазерным воздействием, между фибриллами в значительном количестве располагались кератобласты (К) (рис. 19б). Дальше от места абляции вокруг интерфейса коллагеновые фибриллы были чуть разрыхлены, а в смежной зоне определялись кератобласты. Ниже зоны абляции фибриллы стромы были не изменены и располагались упорядоченно, десцеметова мембрана и эндотелий соответствовали контрольной норме.

    Через 14 мес., биомикроскопия: глаз спокоен, роговица прозрачная, определяется край клапана. Глубже лежащие среды глаза не изменены.

    На световых микроснимках хорошо просматривались деструктивные изменения волокон в месте эксимерлазерной абляции (звездочка). В области клапана, сделанного на глубину около 120 мкм и занимающего около 1/2 всей толщины роговицы опытных образцов (при общей толщине роговицы кролика в контроле в среднем 280 мкм), эпителий был не изменен, но базальная мембрана имела волнообразный ход, однако извитость ее была менее выражена по сравнению с контролем (стрелки). Роговица ниже места воздействия была не изменена (рис.20а). По сравнению с интактным участком общая толщина роговицы уменьшена на ⅓, близко к краю клапана волокна стромы не изменены, отчетливо просматривался интрастромальный рубец (звездочка) в месте стыка обрезанных волокон и соединения горизонтального и бокового разрезов (рис. 20б).

    На электронных микроснимках роговицы эпителий в области клапана не изменился, базальная мембрана имела слегка волнообразный ход (круг). В строме клапана коллагеновые фибриллы располагались несколько волнообразно, но упорядоченно, их ход и структура не нарушались (звездочка) (рис. 21а). Ближе к горизонтальному разрезу определялись измененные, более плотные кератоциты на фоне нормальных коллагеновых фибрилл (рис. 21б).

     В зоне эксимерлазерной абляции по ходу горизонтального разреза определялся интрастромальный рубец (звездочка), по ходу которого просматривались измененные коллагеновые фибриллы на фоне деструктивных клеток (стрелки) и на границе с нижележащей стромой, где определялись единичные кератобласты (рис. 22а, б). Строма, расположенная ниже места воздействия, десцеметова мембрана и эндотелий были не изменены и соответствовали контрольной норме (рис. 22в).

    Контрольная группа (ЛАЗИК)

    На 5-е сутки, биомикроскопия – глаз спокоен, роговица прозрачная. Световая микроскопия и морфометрия – в месте воздействия отмечалось значительное истончение роговицы (145 мкм) почти в 2 раза по сравнению с нормальными участками (248 мкм). Волокна стромы располагались компактно, были гомогенизированы почти на всю толщу. По ходу всего интрастромального разреза на фоне поврежденных волокон и в зоне абляции имелось умеренное скопление кератобластов. В нижележащих участках стромы рядом с местом абляции волокна были сильно разрыхлены.

     Через 9-14 мес.: биомикроскопия – глаз спокоен, роговица прозрачная, глубже лежащие среды не изменены. Световая микроскопия и морфометрия – в сравнении с участками без воздействия (23 мкм) был несколько утончен слой наружного эпителия (19 мкм), его клетки располагались в 1-2 слоя, и в области клапана волокна были истончены (круг) (рис. 23), а базальная мембрана имела волнообразный ход (круг) (рис. 24). В месте воздействия строма была истончена (155 мкм) по сравнению с нормой почти в 2 раза (366 мкм) (звездочка) (рис. 24а). Едва определялся интрастромальный рубец в зоне разреза и абляции (стрелки) (рис. 23а, рис. 24а). Рубец по краю клапана также почти не выявлялся, границы его были размыты и просматривались нечетко (рис. 24б). В зоне интерфейса была видна дезорганизация волокон стромы с образованием полостей и расширенных промежутков (стрелки) (рис. 23б). Количество кератоцитов было несколько увеличено по краю крышки и почти не определялось в зоне разреза и абляции.

    Ультраструктурный анализ роговицы кроликов в контрольной группе через 14 мес. после операции показал, что в зоне клапана эпителий соответствовал норме и не отличался от интактных участков. Обнаружены структурные изменения коллагеновых фибрилл клапана, которые были несколько уменьшены в диаметре и дезорганизованы на фоне расширенных межтканевых промежутков. Базальная мембрана имела несколько волнообразный ход (стрелки) (рис. 25а).

    Наиболее значимые изменения выявлены в месте разреза клапана кератомом, где отмечалось нарушение хода коллагеновых фибрилл. Особенно значимо определялось изменение хода фибрилл и их дезорганизация в слабовыраженном рубце по краю клапана (круг) (рис. 25б). В зоне абляции и интрастромального разреза сформировалось умеренное соединительнотканное уплотнение (стрелки) на фоне сильно измененных фибрилл стромы (звездочка) и кератоцитов (К) (рис. 26а). В интактных зонах, не подверженных облучению и воздействию кератома, изменений не найдено. В участках, расположенных ниже эксимерлазерного воздействия все слои роговицы соответствовали норме (рис. 26б).

    В контроле на 2-х глазах кроликов роговичный клапан был удален.

     Через 14 мес. (без клапана): биомикроскопия – глаз спокоен, на роговице СЭФ в 3 балла с врастанием сосудов с лимба. Световая микроскопия и морфометрия – в зоне воздействия имелось резкое утолщение эпителия (39 мкм), располагающегося в 5-6 слоев (стрелка), и в особенности основного вещества (361 мкм) по сравнению с участками без воздействия (342 мкм). В строме имелась гомогенизация волокон, которая распространялась почти на всю толщуи захватывала около ⅔ толщины основного вещества роговицы с беспорядочным расположением фибробластов (звездочка). Нижние отделы стромы, десцеметова мембрана и эндотелий – без особенностей (круг) (рис. 27а, б).

    Ультраструктурный анализ показал, что в зоне воздействия эпителий был сильно гиперплазирован, в верхних слоях отмечалось беспорядочное расположение отечных, отличающихся полиморфизмом клеток, с инородными включениями конъюнктивальных клеток и клеток крови (звездочка), базальная мембрана имела волнообразный и прерывистый ход (стрелки) (рис. 28а). В субэпителиальном слое и в прилежащих отделах стромы отмечалось выраженное скопление кератобластов (К) с обширным резервуаром ретикулярной ткани на фоне сильно измененных фибрилл (круг) в зоне абляции (рис. 28б). Ниже лежащие отделы стромы, десцеметова мембрана и эндотелий были без изменений.

    Итак, во второй серии опытов:

    • в опыте и в контроле выявлено значительное истончение роговицы после воздействия;

    • в опыте и в контроле обнаружены изменения в роговичном клапане, занимающем почти 1/2 всей толщины роговицы, а именно – волнообразный ход базальной мембраны и прилежащих слоев стромы, при этом все эти изменения более выражены в контроле;

    • в опыте и в контроле наиболее выраженные изменения наблюдались в месте резекции клапана и эксимерлазерной абляции, однако они проявлялись по-разному: в опыте при формировании клапана происходило повреждение волокон в основном в области бокового разреза; в контроле – по всему разрезу;

    • ультраструктурный анализ через 14 мес. после воздействия показал сохранную структуру роговицы со слабым интрастромальным рубцом по всему разрезу и признаками структурных изменений волокон клапана в контроле, а также сильным интрастромальным рубцом в области бокового разреза в опыте;

    • в контрольных образцах без клапана в течение всего периода наблюдения на фоне интенсивной терапии отмечалась сильная воспалительная реакция, которая заканчивалась нарушением пролиферативной стадии воспаления и формированием выраженного помутнения роговицы;

    • в опыте и в контроле ниже лазерного воздействия изменений в структуре роговицы не обнаружено; при офтальмологическом обследовании глаз подопытных животных ни в одном случае не было обнаружено повреждений радужки, хрусталика, сетчатки.

     Резюме

    Подводя итог, отметим, что формирование неповрежденного роговичного клапана и его сохранность являются важными условиями, обеспечивающими не только быструю реабилитацию, но и сохранение оптических свойств роговицы. Выполнение технологий ЛАЗИК и ИнтраЛАЗИК с предварительным формированием клапана роговицы толщиной 160 и 120 мкм и выполнением абляции на глубину 130 мкм способствовало истончению роговицы кроликов почти в 2 раза (при исходной толщине роговицы кролика в среднем 280 мкм). При этом в области клапана был обнаружен волнообразный ход базальной мембраны и прилежащих слоев стромы, что было сильнее выражено после ЛАЗИК. В отдаленном периоде наиболее значительные изменения в структуре волокон клапана, особенно в области его края, и слабый интрастромальный рубец по всему сформированному разрезу были выявлены после ЛАЗИК, что обуславливает нестабильность роговицы в области клапана и возможность его смещения на фоне травмы в отдаленном периоде после операции. Выраженный рубец по краю клапана после ИнтраЛАЗИК, видимый при биомикроскопическом обследовании и подтвержденный данными световой и электронной микроскопии, является «опорным элементом», поддерживающим биомеханическую стабильность роговицы после вмешательства. Этому же способствует отсутствие выраженного повреждения фибрилл по ходу горизонтального разреза клапана после ИнтраЛАЗИК. Из всего сказанного можно заключить, что для предупреждения ослабления и истончения роговицы в передней и средней части стромы, и для минимизации изменений фибрилл, входящих в состав роговичного клапана, необходимо выполнять ЛАЗИК и ИнтраЛАЗИК с формированием тонкого клапана (90-100 мкм). ИнтраЛАЗИК способствует большей биомеханической стабильности роговицы, по сравнению с ЛАЗИК.