Техника холодовой консервации трупных роговиц человека для трансплантации

    Техника холодовой консервации отобранных для трансплантации трупных роговиц состоит из четырех ступеней, согласно предложенным методикам:

    1) методика антисептической обработки трупных глаз человека;

    2) методика выкраивания роговично-склерального диска для консервации и трансплантации;

    3) методика микробиологического тестирования консервированных роговиц на стерильность;

    4) методика морфометрического тестирования эндотелиальных клеток консервированных роговиц для сквозной трансплантации.

    Ступень 1. Методика антисептической обработки трупных глаз человека

    Трупное глазное яблоко для последующего выкраивания донорской роговицы подвергается антисептической обработке с помощью 5% р-ра Бетадина. Антисептическая обработка трупного глаза производится непосредственно перед выкраиванием и консервацией роговицы по следующей технике:

    • глазное яблоко, фиксированное с помощью хирургического зажима за остаток прямой или косой мышцы, обильно омывается струей проточной холодной воды в течение 20-30 секунд, после чего ополаскивается струей стерильного изотонического р-ра Натрия хлорида;

    • глазное яблоко переносится в стерильный пластиковый контейнер объемом 60 мл (ООО «Гем») таким образом, чтобы поверхность роговицы была ориентирована кверху;

    • в контейнер заливается 30 мл 5% р-ра Бетадина. 5% р-р Бетадина приготовляется из официнального 10% р-ра Бетадина непосредственно перед употреблением путем разбавления стерильным изотоническим раствором Натрия хлорида в соотношении 1 : 1;

    • глазное яблоко выдерживается в 5% р-ре Бетадина в течение 5 минут, после чего раствор сливается в лабораторную раковину;

    • глазное яблоко в этом же контейнере заливается до верха первой порцией стерильного изотонического раствора Натрия хлорида. Через 10 секунд раствор сливается, а глазное яблоко вновь заливается второй порцией р-ра Натрия хлорида на 10 сек, после чего раствор сливается, а глазное яблоко заливается третьей порцией р-ра Натрия хлорида на 1 мин, после чего раствор также сливается;

    • контейнер с обработанным глазным яблоком закрывается винтовой крышкой и в таком виде сохраняется до момента выкраивания и консервации роговицы.

    Период от дезинфекции до начала консервации роговиц не должен превышать 30 мин в связи с дальнейшим нарастанием отека тканей роговицы и возникновением складок десцеметовой мембраны.

    Ступень 2. Методика выкраивания роговично-склерального диска для консервации и трансплантации

    Выкраивание роговично-склерального диска и его холодовая консервация осуществляются по следующей методике:

    • перед употреблением все инструменты стерилизуются автоклавированием или в сухожаровом шкафу в обычном режиме;

    • после антисептической обработки глазное яблоко фиксируется. Далее с помощью шприца и тупоконечной канюли поверхность роговицы орошается стерильным 40% р-ром глюкозы с одновременным механическим слущиванием переднего эпителия роговицы. Более тщательное удаление эпителия производится с помощью роговичного скребца-скарификатора;

    • бульбарная конъюнктива отсепаровывается от склеры по кругу от лимба и до экватора с помощью роговичных ножниц и фиксационного пинцета, затем иссекается. Поверхность склеры зачищается скребцом и готовится к трепанированию;

    • трепанирование производится диаметром 16 мм на глубину ⅔-¾ толщины склеры – до первой перфорации и появления в просвете сосудистой оболочки;

    • склера по окружности дорезается роговичными ножницами, а роговично-склеральный комплекс тупым путем отделяется от иридо-хрусталиковой диафрагмы и переносится в стеклянный флакон объемом 20 мл со стерильным раствором для хранения роговицы. Флакон с донорской роговицей герметично укупоривается завинчивающейся пластиковой пробкой и переносится в холодильник для хранения при температуре +4…8° С в течение 1–14 суток.

    При выборе роговиц для трансплантации в зависимости от сроков холодовой консервации следует придерживаться ниже приведенных рекомендаций:

    1. Для выполнения оптических сквозных и послойных кератопластик сроки консервации роговиц не должны превышать 4 суток.

    2. Для выполнения оптико-реконструктивных сквозных и послойных кератопластик сроки консервации роговиц не должны превышать 6 суток.

    3. Для выполнения реконструктивных (мелиоративно-тектонических) сквозных и послойных кератопластик сроки консервации роговиц не должны превышать 14 суток.

    Ступень 3. Методика микробиологического тестирования консервированных роговиц на стерильность

    Для бактериологического исследования консервированных роговиц на стерильность в процессе выкраивания роговично-склерального диска из него иссекаются 4 кусочка бульбарной конъюнктивы, а с поверхности роговицы собираются 4 порции скарифицированного переднего эпителия, 2 кусочка конъюнктивы и 2 порции эпителия переносятся в пробирки с жидкой средой Сабуро (10 мл) для выявления грибковой флоры, другие 2 кусочка конъюнктивы и 2 порции эпителия помещаются в пробирку с тиогликолевой средой (10 мл) для выявления бактериальной флоры.

    Пробирки маркируются и помещаются в термостаты. Пробирки со средой Сабуро инкубируются в термостате при +31° С в течение 8 суток, пробирки с тиогликолевой средой инкубируются в термостате при +37° С в течение 5 суток. Все пробирки ежедневно осматриваются на пророст.

    Предварительные результаты бактериологического исследования консервированных роговиц, как правило, определяются уже на 2-4 сутки инкубирования тканевых образцов. В случае пророста инкубационной среды с тканевыми образцами соответствующая роговица во флаконе с раствором для хранения уничтожается путем автоклавирования и утилизируется по акту списания.

    В том случае, если бактериологически инфицированная роговица уже была трансплантирована, реципиенту назначается профилактическая антибиотикотерапия, а пробирка с проросшей питательной средой передается в клинико-бактериологическую лабораторию для типирования микроорганизма и, в случае необходимости, определения его чувствительности к антибиотикам.

    В процессе консервации также осуществляется ежедневный контроль изменения цветности и прозрачности раствора для хранения роговицы. В норме раствор абсолютно прозрачен, а его цвет ярко-красный.

    Эти свойства раствора не должны изменяться в течение всего периода консервации роговицы. В случае контаминированности и развития микрофлоры раствор начинает мутнеть, а ее цвет постепенно меняется от ярко-красного до оранжево-желтого или малинового. Флаконы с консервированными роговицами, подозрительные на контаминированность, передаются в клинико-бактериологическую лабораторию для дальнейшей верификации.

    Роговицы во флаконах с консервационной средой без признаков контаминированности и с предварительным отрицательным результатом бактериологического исследования соответствующих тканевых образцов после проведения морфометрического тестирования эндотелиальных клеток передаются в клинику для трансплантации.

    Ступень 4. Методика морфометрического тестирования эндотелиальных клеток консервированных роговиц для сквозной трансплантации

    Перед выполнением сквозной трансплантации консервированной роговицы она должна пройти обязательное морфометрическое тестирование с целью исключения трансплантационного материала с низкой пороговой плотностью эндотелиальных клеток. Для определения плотности эндотелиальных клеток (ПЭК) Американской и Европейской ассоциациями ГТБ на современном этапе рекомендуется использовать автоматизированные компьютерные методы морфометрии. При этом табельными для Глазных тканевых банков являются кератоанализаторы (Eye bank Keratoanalyzer) типа модели ЕКА-98, выпускаемой фирмой Konan (Япония). Приборы этого типа не относятся к медицинскому оборудованию и не подлежат обязательной сертификации на территории Российской Федерации, могут быть приобретены через представительства соответствующих фирм в России.

    Морфометрический анализ эндотелиальных клеток на кератоанализаторе достаточно прост и выполняется по автоматизированной методике согласно прилагаемым к прибору программам. Основным преимуществом данной методики является возможность проведения морфометрического анализа роговиц непосредственно во флаконах с консервационной средой, что абсолютно предотвращает инфекционную контаминацию донорского материала в процессе проведения теста. При этом нижний порог ПЭК консервированной роговицы не должен быть ниже 2000 кл/мм².

    Результаты анализа консервированных роговиц с морфометрической характеристикой и микроскопической картиной пласта эндотелиальных клеток выводятся на бумажный бланк в качестве приложения к сопроводительной документации на трупную консервированную роговицу человека для трансплантации.