Рисунок 1 - Химическая структура полиметилметарилата
Рисунок 2 - Химическая структура гидроксиэтилметакрилата
Согласно проведенным ранее работам [25; 31; 37; 44], имплантация любого чужеродного материала, в том числе биологических тканей, в ткани организма, вызывает воспалительно - репаративную реакцию, приводящую к активации пролиферации фибробластов, образованию новых коллагеновых волокон и других компонентов внеклеточного матрикса, и, как результат -формирование соединительнотканной капсулы вокруг импланта. Когда инородный материал вводится в толщу биологической ткани, происходит немедленная адсорбция тонкого слоя белков на его поверхности. Имплантированный полимер ввиду первоначального притяжения полиморфонуклеарных клеток и моноцитов становится основным объектом для реакции на границе «полимер – ткань». В ходе проведения спектрального анализа состава белкового слоя на поверхности импланта, было определено, что этот слой состоит из 6 основных белков: альбумин, фибронектин, трансферрин, фибрин/фибриноген, иммуноглобулин и фракция С3. Наличие этих компонентов на поверхности импланта изменяет его адгезивные свойства и приводит к появлению большей адгезии клеток [181]. Активация клеточной адгезии к материалу, находящемуся в толще стромы, приводит к образованию капсулы вокруг него. В исследованиях Zavala E. с соавторами (1984) было установлено, что величина толщины капсулы, образованной вокруг инородного тела, является относительным показателем биосовместимости [207].
Помещение любого материала в толщу тканей вызывает ответную реакцию со стороны организма. Однако следует отличать развитие ответа тканей на хирургическую травму, который чаще всего идет по типу воспаления, с изменениями, возникающими вследствие присутствия материала. Восстановление целостности ткани после нанесения хирургической травмы происходит в течение двух недель и заканчивается заживлением, проходя все стадии воспаления. Итогом является формирование прочной рубцовой ткани, которое происходит ввиду ответной реакции фибробластов, макрофагов и образования коллагена [200]. Только спустя этот срок можно однозначно говорить, что остаточная воспалительная реакция вызвана непосредственно присутствие материала в ткани [194].
Все биоматериалы можно разделить на токсичные, почти инертные, инертные и биоразрушаемые (Таблица 1) [38; 41]. Идеально биосовместимого материала не существует. Незначительная тканевая реакция так или иначе проявляться будет, при это возникновение клеточной адгезии и, как следствие, капсулообразование будет зависеть от физико-химических свойств самого импланта: пористость, степень заряда поверхности, ее гидратация, качество обработки поверхности [26].
Токсичным считается материал в том случае, когда его химический состав или производные данного вещества, которые вымываются из импланта, при его нахождении в организме, определяют токсическое воздействие на клетки и ткани. Такие материалы являются неприемлемыми для производства биологических имплантов [41].
В зависимости от характера образующейся вокруг инородного тела капсулы, материалы разделяют на почти инертные, когда определяемая капсула тонкая и не прилегает к поверхности импланта, инертные, в случае применения которых капсула отсутствует или очень тонкая, и биоактивные, в случае которых определяется прилегающая капсула (Таблица 1) [207].
Биодеградируемые материалы при длительном нахождении в ткани организма происходит его растворение, а сам материал замещается тканями человека, при этом важным, чтобы продукты растворения были не токсичными [41].
1.2.1. Модели для определения и оценки биосовместимости полимерных материалов
Среди используемых в экспериментальной практике моделей для определения и оценки биосовместимости полимерных материалов можно различить модели in vivo, с использованием экспериментальных животных, и in vitro, с применением клеточных или тканевых культур.
Наиболее часто для изучения биосовместимости материалов используют модели in vivo (модели экспериментальных животных). Для офтальмологической практики такими животными являются кролики определенных пород, хотя встречаются работы, в которых в качестве объекта исследования используют человекообразных обезьян, кошек, собак, птиц, морских свинок [76; 79; 91; 105; 114; 117; 125; 134; 141; 194]. Такое разнообразие связано с особенностями строения различных отделов глаза. Патологическое влияние импланта на ткани роговицы определяют в соответствии с возникновением признаков воспалительной и структурно-пластической реакций [6; 17; 42]. Ввиду наличия дополнительного воздействия на ткани роговицы в ходе нанесения механической травмы, необходимо строго дифференцировать изменения, вызванные хирургическим вмешательством и возникающие в ответ на действие имплантированного полимера. Безусловно, экспериментальные исследования in vivo на модели животных весьма удобны и показательны, ведь при их проведении возможно максимально сымитировать течение раннего и позднего послеоперационного периода с учетом их стадийности [194; 200]. Однако, в случае использования данной модели, исследователи сталкиваются с некоторыми сложностями, этическими и/или финансовыми вопросами (проведение хирургического вмешательства, выбор анестезии, медикаментозного сопровождения, способ выведения животного из эксперимента, покупка и содержание животных в специализированных вольерах и др.).
На сегодняшний день предпринимаются попытки заменить ставший классическим тест на токсичность - Draize Test, предложенный FDA в 1944 году, исследованиями на клеточных культурах [94; 175]. Культура клеток эпителия роговицы человека была выбрана из-за того, что именно эти клетки, первыми контактируют с окружающей средой и вступают в активацию раневого процесса [81; 94]. Логично, что использование данной культуры клеток не достаточно корректно для определения биосовместимости материалов, имплантируемых в строму роговицы. Последние исследования в этой области посвящены выделению первичной культуры клеток кератоцитов стромы роговицы, которые используют для исследования фундаментальных общебиологических вопросов, а так же в практических целях, в качестве тест-объектов при анализе биосовместимости новых материалов и фармакологических веществ [161; 165]. Наравне с использованием этой культуры клеток, некоторыми авторами предложено использование выделенных культур других клеток [73; 121; 168; 196; 205; 209].
Ответом на действие конкретного токсина in vitro может быть изменение метаболизма или выживание клеток, в то время как главную проблему in vivo могут составлять тканевой (воспалительная реакция, фиброз) или системный ответ (лихорадка, сосудистая реакция). Для получения таких ответов предложено использование модели органотипических культур [38; 129]. Главным преимуществом перед клеточными культурами при этом является сохранение структурного единства, при котором поддерживается клеточная связь, присутствующая в ткани. Среди ограничений использования данной модели можно выделить сложности в проведении биохимического и молекулярного анализов изменений, происходящих в процессе культивирования, которые связаны с более сложной организацией таких экспериментальных моделей, в сравнении с клеточными культурами. Стоит так же отметить, что при использовании органотипического культивирования процент реагирующих клеток или клеток, дающих ответ на действие определенного стимула (реакция с материалом импланта, с химическим веществом), значительно меньше, чем в случае выделенных клеточных культур. Немаловажным является и невозможность размножения органотипических культур, а значит увеличение расходуемого на исследование материала.
1.2.2. Способы изменения биосовместимости полимерных материалов
Среди описанных в литературе полимерных материалов, используемых в хирургии роговицы, наибольшее распространение получили ПММА и ГЭМА. Их применение не всегда сопровождается полным отсутствием реакции со стороны тканей организма, данные материалы обладают относительной инертностью. Когда речь идет об использовании полимеров, как основы для производства интрастромальных имплантов, необходимо соблюдение определенных требований, а именно прозрачность материала, высокое качество обработки поверхности, отсутствие капсулообразования, при длительном нахождении в тканях органа. Несоответствие выдвигаемым требованиям приводит к развитию помутнения ткани роговицы, что в свою очередь влияет на ее рефракционные свойства. При периферическом положении импланта, возможно некоторое допущение перечисленных критериев [34; 121; 196].
Для изменения адегзивных свойств материала и, как следствие, увеличение биосовместимости имплантов, разработано множество методик воздействия, изменяющих поверхностные свойства полимерного изделия.
Ниже более подробно рассмотрены наиболее часто используемые при производстве интрастромальных имплантов полимеры и методы модификации их поверхности.
Полиметилметакрилат – твердый, жесткий, стеклообразный, но хрупкий полимер с температурой стеклования равно приблизительно 100°, не растворим в воде и алифатических углеводородах и стоек к воздействию масел, жиров, щелочей и разбавленных кислот (рисунок 1) [41].
В настоящее время ПММА используют для производства различных имплантов, применяемых в офтальмологии: интраокулярных линз, внутрикапсульных колец, интрастромальных роговичных сегментов, кератопротезов, внутрироговичных линз и других [14; 48; 49; 51; 83; 156]. Первые попытки имплантации ПММА в строму роговицы были предприняты в середине ХХ века [60; 65; 139; 140].
В литературе имеются данные об изменении адгезивных свойств имплантов, выполненных из ПММА. Обработка поверхности полимерного изделия меняет его поверхностную энергию, а, следовательно, гидрофобные и/или гидрофильные свойства, которые непосредственно определяют адгезивность материала. Среди способов воздействия на поверхность импланта выделяют: непосредственная обработка поверхности, нанесение специализированного покрытия и дополнение основного вещества вспомогательными.
Обработку поверхности изделия проводят несколькими способами: химическое окисление (обработка озоном), обжиг поверхности, и физическое воздействие (обработка низкотемпературной плазмой, фотонами света и радиационными излучением). Все выше перечисленное способствует образованию на поверхности новых химических соединений или изменению качества поверхности. В имеющейся литературе, посвященной тематике использования интрастромальных имплантов с модифицированной поверхностью, была найдена только одна работа, посвященная использованию роговичных сегментов выполненных из ПММА с поверхностью, обработанной растворами глюкозаминогликанами (ГАГ) [58]. Методы обработки поверхности изделий, выполненных из ПММА, будут проанализированы на примере использования ИОЛ.
Суть модификации поверхности полимерных имплантов заключается в присоединении к основной макромолекуле различных молекул, обладающих гидрофильными или гидрофобными свойствами, которые, в свою очередь, изменяют адгезивные свойства полимера и его биосовместимость. Одним из примеров нанесения химического вещества на поверхность полимера является покрытие ИОЛ тефлоном. В результате на поверхности образуется тонкий слой фторуглеродов. В исследованиях на кроликах было доказано, что использование ИОЛ, обработанных тефлоном AF, отличается значительно более низкой адгезией клеток, в сравнении с ИОЛ, поверхность которых не была изменена. Полученные результаты имели подтверждение при проведении электронно-сканирующей микроскопии и спектрометрии эксплантированных ИОЛ. Установленный антиадгезивный эффект увеличивает биосовместимость ПММА в естественных условиях [149; 198].
Следующим способом модификации поверхности ПММА можно выделить обработку раствором гепарина. Отрицательный заряд молекулы гепарина так же приводит к уменьшению адгезии клеток и микроорганизмов и активации фибробластов, макрофагов и гранулоцитов, и, как следствие, уменьшает вероятность капсулообразования [78; 133; 170].
Группа исследователей из Университета Калифорнии (США) провели работы по изменению адгезивных свойств поверхности ПММА, используемой для производства кератопротезов. В исследовании проводили сравнение адгезии клеток стромы роговицы к полимерным дискам, выполненным из ПММА, поверхность которых была модифицирована с использованием диамино-полиэтиленгликоля (диамино-ПЭГ) и аргининглициласпаргиновой кислоты (RGD-пептид). Присутствие ПЭГ на поверхности ПММА дисках значительно снижало адгезию клеток стромы роговицы в сравнении с RGD – модифицированной поверхностью и не модифицированной (p<0,05). Полученные результаты свидетельствовали, что адгезией клеток стромы роговицы к поверхности полимерного импланта можно управлять с помощью изменения характеристики его поверхности, повышая таким образом биосовместимость и функции имплантата [168].
В своей работе Mateo N. и Ratner B. (1989) изучали влияние перфторпропана, окиси этилена, ГЭМА и N-винил-2-пирролидона (NVP) на адгезивные свойства ПММА. Авторами было установлено, что адгезия клеток увеличивается для материалов с повышенным обогащением углеводородов и материалов с эфирными и кето-эфирными цепями [157].
Еще одним способом модификации поверхности имплантов из ПММА является обработка плазмой. С физической точки зрения плазма – это частично или полностью ионизированный газ, в котором плотности положительных или отрицательных зарядов практически одинаковы [29]. При сильном нагревании любое вещество испаряется, превращается в газ. Если продолжать увеличивать температуру, происходит резкое усиление процессов ионизации, т.е. молекулы газа начнут распадаться на соответствующие атомы, которое затем превращаются в ионы. Для плазмы принято использовать два определения: низко и высокотемпературная, при этом низкотемпературной принято считать плазму с температурой Т≤105К, а высокотемпературной - Т≥106 - 108К. Для получения различных химических веществ используют плазмотроны, создающие струи низкотемпературной плазмы, с помощью которой наносят различные покрытия [29]. В офтальмологии обработку низкотемпературной плазмой чаще всего используют для силиконовых и силикон - гидрогелевых интраокулярных и контактных линз. Исследования в этой области были начаты в 90-ых годах ХХ века и были посвящены оценке изменения гидрофильных свойств силиконовых ИОЛ в уcловиях in vivo и in vitro.
Так в работе Hettlich H. с соавт. (1992) в условиях in vitro (модель культуры клеток глаза кролика) и in vivo (экспериментальные животные кролики) было проанализировано влияние низкотемпературной плазмы в присутствии кислорода на гидрофильные свойства силиконовых ИОЛ и возникновение задних синехий при их имплантации в заднюю камеру [120]. Изменение гидрофильности поверхности силиконовых ИОЛ были подтверждены и другими исследователями с применением нитрита титана (TN). В ходе работы было установлено уменьшение гидрофильности поверхности и как следствие уменьшение адгезивных свойств используемых силиконовых ИОЛ [119; 197].
Подобные результаты были получены Eloy R. со автор. (1993) в исследования in vitro ИОЛ выполненной из ПММА, фторирование поверхности которых выполнено низкотемпературной плазмой с применение CF4 . Авторы установили снижение адгезии гранулоцитов человека к поверхности ПММА и гомогенности распределения молекул фтора на поверхности ИОЛ [101]. Подобные результаты были получены Qu C. с соавт. (2004), которые изучали изменение адгезивных свойств ИОЛ, выполненных из ПММА с поверхностью, модифицированной плазмой в присутствии альфа – аллил-гликозида [171]. В данных исследованиях было установлено уменьшение гидрофильности поверхности, уменьшение адгезивных свойств ИОЛ и увеличение их биосовместимости.
Особое внимание следует уделить работе коллектива авторов из Государственного Университета Сан-Паулу, посвященную исследованию биосовместимости роговичных сегментов (РС) модели FerraraRing, поверхность которых была модифицирована с использованием глюкозаминогликанов (хонтроитинсульфат). В ходе исследования in vivo (экспериментальные животные кролики) были проанализированы следующие параметры: наличие отека, васкуляризации, развитие инфекции и экструзии РС на первые сутки после операции, через 30 и 60 дней после операции. На гистологических срезах фиксировали количество слоев эпителия роговицы в проекции РС, возникновение отечной дегенерации клеток стромы роговицы и наличие воспалительных клеток, неоваскуляризации и формирования капсулы. Авторами было отмечено значительное отличие группы РС с модифицированной поверхностью от РС без хондроитинсульфатного покрытия. Предложенные к использованию РС вызывали меньше клинических и гистологических изменений, демонстрируя более высокую биосовместимость [58].
Гидроксиэтилметакрилат (гидрогель) – пористый гидрофильный материал, относящийся к той же группе полимеров, что и ПММА, был синтезирован в 1960 году и состоит из сложных эфиров акриловой и метакриловой кислот (рисунок 2) [98; 99; 199]. Важной характеристикой для этих веществ является температура перехода, равная 110° С, что значит, что при температуре ниже этого значения имплант твердый, а при превышении температуры становится гибким [2]. Этот показатель накладывает определенные условия на процесс производства и предоперационной подготовки имплантов.
Данный полимер используется в офтальмологической практике достаточно широко как основа для интраокулярных и контактных линз, а так же в качестве сополимера коллагена, для производства интракорнеальных импланов [5; 9; 21; 37; 153; 154; 205]. Ввиду наличия включений ОН - групп, ГЭМА обладает возможностью связывать молекулы воды, а значит обладать большей гидрофильностью, в сравнении с ПММА, что положительным образом сказывается на биосовместимости имплантов, выполненных из этого полимера. Увеличение содержания воды в составе гидрогеля увеличивает диаметр и количество пор на поверхности изделия, что изменяет проницаемость для питательных веществ и влияет на биосовместимость [160; 174].
Исследования ГЭМА, как полимера, потенциально пригодного для применения в хирургии роговицы, начались в конце 60-ых - начале 70-ых годах ХХ века. Одним из первых на хорошую совместимость ГЭМА с тканями роговицы обратил внимание Dohlman C. (1967) [97]. В своих исследованиях Yamagushi T. (1984) в условиях эксперимента in vivo на приматах определил, что интрастромальные импланты, выполненные из ГЭМА, достаточно стабильны при длительном нахождении в тканях роговицы, а ранний полеоперационный период отличается практически полным отсутствием воспалительной реакции и гистологических признаков изменений в строме [202].
Позднее в работах Mester U. с соавт. (1979) и Smetana T. с соавт. (1987) было предложено использование ГЭМА со значительным содержанием воды (65-75%) [163] и c наличием коллагена [190] в качестве основы для производства кератопротезов. В результате исследований было установлено также ареактивное течение послеоперационного периода, отсутствие капсулообразования вокруг импланта и минимальная реакция со стороны роговицы при помещении материала в переднюю камеру экспериментальных животных (кролики).
Однако хорошая адгезия кератоцитов не всегда нужное условие, при использовании интракорнеальных имплантов, ввиду вероятности развития фибропластических процессов и образования соединительнотканной капсулы, которая может нарушить оптические свойства роговицы. Поэтому, как и в случае использования ПММА, различными исследователями были предложены варианты модификации поверхности полимерного изделия из ГЭМА.
Так Hsiue G. (1993-1994) в своих исследованиях предложил метод плазменной полимеризации ГЭМА в присутствии силиконовых каучуков, аргона (Ar) и поли-4-метил-1-пентана (ТРХ). Для проведения эксперимента была использована модель двумерного клеточного культивирования эпителия роговицы кролика. В результате исследования было отмечено, что при модификации поверхности полимера в присутствии силиконовых каучуков, ТРХ и в группах контроля (ГЭМА не модифицированный) имеется достаточная адгезия и рост клеток эпителия в отличие от групп образцов с Ar - плазменной обработкой, в которых адгезия была незначительна [122; 123; 124]. Несколько позднее данные были подтверждены с использованием ион-масс спектрометрии и Фурье – спектроскопии. Аналогичные результаты получил в своей работе Lee S. (1996): в условиях эксперимента in vitro им была определена необходимая концентрация силикона на поверхности мембран из ГЭМА для адгезии и хорошего роста эпителия роговицы [148].
В 2001 году Merrett с соавт. опубликовали работу, посвященную оценке разницы адгезии клеток к мембранам из ГЭМА с поверхностью, модифицированной с использованием различных пептидов (аргинин – глицин -аспаргиновая кислота (Arg – Gly – Asp, RGDS), тирозин – изолейцин – глицин – серин – аргинин (Tyr – Ile – Gly – Ser - Arg, YIGSR). Для получения максимального покрытия поверхности авторами был также использован хлористый тизил в качестве источника атомов азота, связывание которого происходило в присутствии ацетона. Увеличение концентрации пептида на поверхности полимера увеличивало адгезивную способность ГЭМА [162]. В 2004 году Bi J. с соавт. получил аналогичные результаты, однако в качестве модифицирующего агента был выбран полиэтиленгликоль (ПЭГ) [68]. В это же время многие исследователи начали проводить работы по изучению свойств сополимеров: смесей ГЭМА и ПММА, сополимеров коллагена и ПММА.
Годом позднее Jacob J. T. с соавт. (2005) опубликовали результаты исследования, в котором сравнивали адгезивные способности ГЭМА, связанного с белками внеклеточного матрикса (фибронектин, ламинин, IGF-1) и пептидными последовательностями, связанными через ПЭГ-цепи. В качестве опытного объекта была выбрана культура клеток эпителия роговицы кролика. Гидрогель, представляющий собой смесь ГЭМА и ПММА, был исследован на предмет наличия клеточной адгезии и влияния модифицированной поверхности на скорость клеточного роста. Полученные результаты подтвердили гипотезу о том, что привязка определенных белков внеклеточного матрикса и/или пептидов к поверхности гидрогеля улучшает рост и адгезию эпителиальных клеток [127].
В работе Guo P. (2007), с применением электронно-сканирующей микроскопии и с использованием иммуногистохимической окраски, было проведено изучение реакции ткани роговиц кроликов и обезьян на имплантацию кератопротезов, выполненных из ГЭМА и смеси ГЭМА с ПММА. В ходе выполнения работы было зафиксировано прорастание фибробластов на сроке в две недели после операции, а на сроке до 2 - 3 месяца после имплантации кератопротеза было отмечено врастание новообразованных сосудов [117].
В исследовании Zainuddin M. c соавт.(2008) увеличение адгезивных свойств поверхности гидрогеля было достигнуто при проведении радикальной полимеразной прививки. Результаты показали, что модифицированные образцы гидрогеля имели более равномерное распределение адгезированных клеток на своей поверхности за счет наличия фосфатных групп [205].
Анализируя описанные выше характеристики наиболее часто используемых полимеров для интракорнеальных имплантов, можно заключить, что необработанные поверхности ПММА и ГЭМА обладают различной способностью к адгезии клеток роговицы. В случае ПММА частота инкапсуляции импланта, значительно выше, чем у ГЭМА. Гидратация гидрогелей характеризует его гидрофильность, и, как следствие, адгезивные свойства материала, а значит и биосовместимость. Модификация поверхности имплантов, выполненных из ПММА и ГЭМА, различными способами в одинаковой степени влияет на их адгезивные способности и инкапсуляцию. Стоит отметить, что в случае данных материалов для производства интрастромальных имплантов используют двустадийный подход, описанный выше.
Среди полимеров, используемых для производства имплантов в офтальмологии, применяют и те, производство которых может идти по одностадийной схеме. К таким веществам относится олигоуретанметакрилат (ОУМА), использование которого первоначально ориентировалось на стоматологическую практику. В офтальмологии ОУМА используют в качества основы для изготовления ИОЛ, дренажей, внутрикапсульных колец [22; 34].
В своей работе Горбунова Н. Ю. (2008) исследовала эффективность предложенного антиглаукоманого дренажа, выполненного из ОУМА, который в структуре вещества составлял около 60% массы и по своим свойствам был близок к силоксанам. Такая форма ОУМА не связывается с водой и является гидрофобной. Благодаря использованию технологии фотолитографии возможно изготовление перфорированного дренажа с необходимыми параметрами. В результате проведения блокировки находящихся на поверхности свободных радикалов материал становился нетоксичным, устойчивым в биологически активных средах. Данные были подтверждены при использовании электронного парамагнитного резонанса [8].
В 2015 году исследователями из МНТК «Микрохирургии глаза» им. акад. С.Н. Федорова была представлена работа, посвященная исследованию в условиях in vitro течению раннего послеоперационного периода при имплантации интракорнеальных линз, выполненных из ГЭМА и ОУМА. Авторы выявили отсутствие выраженной воспалительной реакции в ответ на присутствие в ткани роговицы ОУМА, как нового в практике роговичной хирургии материала. Однако более подробного изучения биосовместимости при длительном нахождении ОУМА в строме роговицы пока проведено не было [45].
Автором не были найдены публикации в отечественной и зарубежной литературе, посвященные исследованию биосовместимости тканей роговицы человека с ОУМА, возможности его использования для изготовления интрастромальных имплантов.
Ввиду этого остается актуальным поиск полимера, который бы обладал наименьшей токсичностью при его длительном нахождении в строме роговицы. Немаловажным является возможность формирования из предлагаемых полимеров конструкций со сложными профилями.
