1.2. Методы диагностики хронических нарушений эпителизации роговицы герпесвирусной этиологии

    Метод флюоресцирующих антител

    Одним из наиболее быстрых и специфичных методов диагностики герпесвирусных заболеваний глаз по данным Kaufman H.E. (1962) и Pettit T.H. (1981) являлся метод флюоресцирующих антител (МФА). Материалом для исследования служили соскобы с конъюнктивы и эпителия роговицы [35, 107].

    По данным исследований, проведенных Каспаровым А.А. (1972) и Зайцевой Н.С. (1975), антиген ВПГ обнаруживался в соскобах эпителия конъюнктивы и роговицы при поверхностных формах поражения у 39-81%, при глубоких формах – у 40-63% пациентов [12, 16].

    Kaufman H. (1978) в своих исследованиях показал возможность применения МФА в диагностике герпесвирусных иридоциклитов [108].

    Зайцева Н.С. (1975) и Кричевская Г.И. с соавт. (2000) показали, что даже после наступления выздоровления, возможно наличие специфического свечения у 11-45% пациентов, которое может определяться и в клинически здоровом глазу, чего никогда не бывает при заболеваниях не герпесвирусной этиологии [13, 28].

    Однако получение материала для проведения МФА связано с проведением соскоба с пораженной конъюнктивы или роговицы, что приводит к дополнительной травме эпителия, а кроме того, применение анестетиков, используемых при заборе материала, может оказывать дополнительное токсическое действие. Также, при переходе заболевания в подострую или хроническую формы значительно уменьшается ценность данного метода.

    Реакция непрямой гемагглютинации

    В 1979 г. Майчук Ю.Ф. с соавт. разработали метод диагностики офтальмогерпеса с помощью исследования слезной жидкости на наличие антигена ВПГ с использованием реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) [35]. Забор материала производился без предварительной анестезии, использовалась слеза в объеме одной капли, с последующим разведением в 0,5 мл физиологического раствора.

    Для постановки РНГА использовался герпетический гама-глобулиновый эритроцитарный диагностикум. Помимо стандартных для серологических реакций контролей: контроля эритроцитов, исходного материала на агглютинацию эритроцитов, при РНГА использовался дополнительный контроль на специфичность агглютинации. Это достигалось путем введения в реакцию специфической противогерпетической сыворотки.

    По данным проведенных сравнительных исследований, герпетическая этиология заболевания была подтверждена у 56% пациентов с поверхностными формами офтальмогерпеса, в отличие от реакции иммунофлюоресценции у этих же пациентов, показавшей положительный результат лишь в 20% случаев. При наличии глубоких поражений офтальмогерпесом РНГА позволяла выявить ВПГ в 73% случаев [35].

    Метод выделения вируса в культуре клеток

    С целью определения герпесвирусной этиологии также может быть использован метод выделения вируса. Ведущим фактором в определении результата данного исследования является глубина поражения роговицы.

    Наиболее часто можно выделить вирус при поверхностной патологии. Для проведения исследования используется соскоб конъюнктивы или роговицы, что может способствовать дополнительной травматизации тканей [35].

    Цитологический метод

    Представляет собой исследование фиксированных и окрашенных соскобов конъюнктивы и роговицы. Среди характерных для герпесвирусного процесса изменений отмечается: разрыхленность эпителия, дегенерация ядер в виде полиморфной вакуолизации, образование ядерных включений, также может наблюдаться появление многоядерных клеток, лимфоидная реакция с наличием средних и больших лимфоцитов, плазматических клеток и моноцитов [35, 36].

    Метод электронной микроскопии

    В 1972 г. как быстрый метод диагностики Kobayashi S. была предложена электронная микроскопия, а в 1976 г. Kajima M. с соавт. провели ряд исследований, подтвердивших эффективность электронной микроскопии, после чего метод был предложен в качестве диагностического в оценке герпесвирусных заболеваний роговицы [цит. по 35, 39].

    Иммуноферментный анализ крови

    Чувствительность иммуноферментного анализа крови (ИФА) при исследовании антител к ВПГ 1 типа составляет 91-96%, специфичность – 92-95%. Для ВПГ 2 типа чувствительность укладывается в 97-100% и специфичность 94-98% [84].

    Исследование включает определение антител Ig G, M к ВПГ. Антитела Ig M являются показателем острой инфекции и появляются в среднем на 2-3-й неделе от начала заболевания. По данным Кишкун А.А. (2006), пик титров отмечается на 4-6-й неделе с момента развития клинической картины заболевания и снижается через 2-3 месяца после перенесенной инфекции.

    При повторном инфицировании, как правило, не происходит существенного изменения Ig M.

    До 80-90% лиц старше 40 лет имеют антитела Ig G к ВПГ-1, 2, при реактивации инфекции отмечается нарастание титров Ig G [23].

    Антитела Ig M к ЦМВ, как правило, появляются через 1-2 недели от начала заболевания. Антитела Ig G к ЦМВ появляются в среднем через 2-4 недели после заражения и могут сохраняться в крови до 10 лет. О реактивации инфекции может говорить 4-кратное увеличение титров Ig G.

    В 1989 г. Hedman K.M. с соавт. предложили выявление авидности антител Ig G к ЦМВ как индикатор определения срока первичного заражения [23].

    Полимеразная цепная реакциия

    Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является методом определения ДНК (РНК) вирусов. Kleppe с соавт. в 1971 г. впервые описал основные принципы ПЦР и состав реакционной смеси для получения копий ДНК [48].

    Однако на тот момент не было продемонстрировано ключевой особенности ПЦР – увеличения количества копий фрагмента исходной ДНК.

    Метод полимеразной цепной реакции был предложен в 1983 г. и заключается в многократном копировании in vitro сравнительно коротких, двухцепочечных фрагментов ДНК. Основой реакции является механизм, реализованный вследствии внутриклеточной репликации молекул ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы.

    Материалом для исследования может служить соскоб с конъюнктивы или роговицы. Метод является высокочувствительным и может быть использован для определения вирусов при остром или хроническом течении заболевания [65, 111, 136].

    Метод цитопатического эффекта

    Под термином цитопатический эффект подразумевают изменения, происходящие в клеточных структурах, непосредственно связанные с внутриклеточным размножением цитопатогенных вирусов. Основным морфологическим проявлением цитопатогенного эффекта вируса на клетки является дезинтегративное набухание ядер клеток. Данный феномен может использоваться в качестве выявления в культурах клеток хронической вирусной инфекции. Другим проявлением являются цитохимически выявляемые изменения метаболизма клеток. В процессе цитохимической обработки материала исследования выявляются изменения нуклеинового, нормального белкового и углеводного обмена. Изменения обмена веществ возникают как защитная реакция клеток, а также являются следствием деструктивных изменений в клетках на фоне цитопатического эффекта.

    Данный метод исследования проводится на стандартной культуре клеток эпителия почек обезьяны и в настоящий момент является «золотым» стандартом определения наличия реплицируемого вирусного материала.

    Выделяют несколько форм развития цитопатического эффекта: равномерная мелкозернистая деструкция клеток, очаговая мелкозернистая деструкция, гроздевидные скопления пораженных клеток и равномерная крупнозернистая деструкция клеток. Последняя характерна для положительного результата исследования при герпетической инфекции [53, 164].