1.3 3D клеточные сфероиды как форма трансплантата ретинального пигментного эпителия

    Для культивирования клеток и тканей многоклеточного организма с целью поддержания их жизнеспособности in vitro наиболее простым и воспроизводимым способом является 2D культивирование (англ. twodimensional, двухмерный) – это инкубирование клеточных культур на поверхности плоских субстратов – чашек Петри или культуральных матрасов. При этом делящиеся и распластывающиеся на плоскости клетки могут неограниченно разрастаться, но только в горизонтальной плоскости субстрата. Толщина 2D культуры у большинства зрелых соматических клеток ограничена и может составлять не более 2-3 слоев [85].

    Иначе дело обстоит с микроскопическими 3D (англ. three-dimensional, трехмерный) культурами клеток, имеющими три равноценные степени свободы, где клетки проявляют тенденцию к агрегации с последующей установкой межклеточных контактов и образованием микроструктур с минимальным соотношением поверхность/объем, т.е. сферических [16, 61].

    Характер межклеточных взаимодействий в сфероиде является профилактикой центральных некрозов клеток внутри сфероида, защищает клетки от апоптоза [84], а также делает их более устойчивыми к разрушению ионизирующей радиацией, гипертермии, ультразвуку и химиотерапевтическим агентам, что было объяснено изменениями функции клеточных сигнальных систем в клетках, объединенных в сфероид [50, 51]. В отличие от 2D культур, эпителиальные клетки наружных слоев сфероида образуют конгломерат, имеющий признаки естественной тканевой морфологии – полярность клеток, плотные межклеточные контакты, коллагеновые и гликозаминогликановые фибриллы десмосом и мембранных вдавлений [92]. Также в сфероиде наблюдаются функциональное разделение клеток, соответственно их локализации: поверхностные слои содержат большое количество митотирующих клеток, имеющих признаки эпителия, а клетки внутреннего – гипоксигенированного слоя, находятся в состоянии динамического покоя [31].

    С точки зрения процессов клеточного движения трансплантируемые сфероиды в толще ткани проявляют эффекты спраутинга (англ. sprouting – выпускание отростков в разные стороны) [78], а на плоской поверхности – эффект спрединга (англ. spreading – распластывание с образованием клеточного слоя) [123].

    Культивирование аллогенных клеток в форме 3D клеточных сфероидов для последующей трансплантации в последнее время является одним из молодых и перспективных направлений в современной трансплантологии. На сегодня имеются экспериментальные работы, посвященные трансплантации сфероидов гепатоцитов («искусственная печень») [82], хондроцитов [113], фибробластов [127], гладкомышечной ткани [29], костной ткани [77], щитовидной железы [132], периферической крови [117], костного мозга [83] и ряда эпителиальных тканей: эпителия щитовидной железы [62], носовой полости [33], носоглотки [31], двенадцатиперстной кишки [30], печеночных протоков [84], поджелудочной железы [68], простаты [87], дыхательных путей [105], а также гибридных, «гетеро-сфероидов» из клеток разных типов [122].

    В офтальмологической литературе представлены публикации по исследованию сфероидов из эпителия хрусталика [80], клеток трабекулярной сети [99], прогениторных клеток глазного лимба [19], человеческого РПЭ [15, 114], кератоцитов роговицы [10], а также имеются работы, в которых «сфероидом» или «микроагрегатом» называется псевдозамкнутый фрагмент сетчатки, полученный в ротационной культуре ткани [64]. Причем, все известные к настоящему моменту работы, так или иначе связанные с изучением сфероидов, построенных из клеток глаза, являются экспериментальными.

    В 2014 году С.А. Борзенком с соавторами была впервые показана возможность конструирования жизнеспособных 3D сфероидов для трансплантации из трупного человеческого РПЭ с заданным количеством клеток, а также была разработана оригинальная техника выделения РПЭ и подробно описана технология его культивирования. Экспериментальное исследование также подтвердило гипотезу о том, что 3D культивирование позволяет сохранять неизменным фенотип клеток РПЭ [5]. Помимо этого, в работе подробно изложены такие свойства 3D сфероидов РПЭ, как:

    1. Определенный диаметр – от 50 до 700 мкм (в зависимости от заданного количества клеток в сфероиде);

    2. 3D сфероиды РПЭ в толще жидкости быстро адгезируются к плоской поверхности (в том числе и к мембране Бруха), что может помочь снизить риск их диссеминации при субретинальной трансплантации;

    3. адгезированные 3D сфероиды РПЭ проявляют спрединг – распластывание и образование вокруг себя клеточного монослоя;

    4. функциональное разделение клеток по слоям соответственно их локализации, позволяющее снизить риск ЭМТ для сохранения фенотипа клеток.

    Следовательно, трансплантация зрелого аллогенного РПЭ в форме 3D клеточных сфероидов может обладать рядом преимуществ по сравнению с уже известными способами трансплантации РПЭ, к которым относятся:

    1. Микроинвазивность, как при трансплантации клеток РПЭ в форме суспензии.

    2. Ограничение самопроизвольной диссеминации клеток, как при трансплантации суспензии РПЭ.

    3. Явление спрединга слоя клеток, аналогично наблюдаемому при трансплантации фрагментов фетальной ткани.

    4. Сохранение фенотипа трансплантируемой культуры.

    5. Легитимность экспериментального и клинического использования зрелого аллогенного материала в рамках действующего законодательства.

    Анализ литературных источников показал, что в области трансплантации РПЭ имеются две проблемы: несовершенство предлагаемого биологического материала для трансплантации и травматичность вмешательства с высоким риском осложнений. Клетки РПЭ, трансплантируемые в форме суспензии, могут диссеминировать в витреальную полость с развитием пролиферативных осложнений и по субретинальному пространству, образуя неравномерный клеточный слой.

    Трансплантация лоскутов в виде ХПК может сопровождаться травматизацией трансплантата и требует проведения ретинотомического отверстия в парацентральных отделах с последующей ЭЛК сетчатки, а также зачастую требует тампонады витреальной полости СМ. Также, при трансплантации РПЭ как в форме суспензии, так и в виде лоскута, возможна трансформация клеточного материала в мезенхимальную ткань, что приводит к развитию СРФ и низким анатомо-функциональным результатам. Эти проблемы частично решались в процессе выполнения настоящего исследования.