1.3.Фармакологический витреолизис

    Поиски неинвазивных методик лечения витреоретинальных заболеваний, направленных на устранение неблагоприятного воздействия СТ на сетчатку, привели к появлению термина «фармакологический витреолизис» [130,134,234,235]. Под этим термином подразумевают использование веществ, изменяющих молекулярную организацию стекловидного тела и тем самым уменьшающих или устраняющих его роль в заболевании. Справедливо будет отметить, что данный термин не вполне точно отображает суть процессов, описываемых большинством авторов. Дословный перевод слова «витреолизис» означает «растворение стекловидного тела». На сегодняшний день в литературе имеются упоминания лишь об одном ферменте, использующимся в офтальмологии с перспективой реального растворения стекловидного тела — коллализине с активным действующим веществом коллагеназой. Коллализин обладает избирательностью действия в отношении коллагена — белка, являющегося основным внеклеточным компонентом стекловидного тела. Коллаген устойчив к действию практически всех протеиназ, за исключением коллагеназы, которая расщепляет нерастворимый коллаген на два белковых фрагмента, растворимых в водной среде [42].
    Так Лыскин П.В. в 2007 г. использовал коллализин для витреолиза неудаленных остатков стекловидного тела в ходе интравитреального вмешательства по поводу отслойки сетчатки. После удаления стекловидного тела с поверхности центральных отделов сетчатки, с целью ее протекции для полного исключения теоретически возможного побочного воздействия коллализина на наиболее функционально значимые ее участки, осуществлялось введение в витреальную полость ПФОС до нижней границы определяемой зоны витреоретинальной адгезии, после чего прекращалась подача физиологического раствора, затем в витреальную полость вводился раствор ферментного препарата коллализин в объеме 5-10 мл при общем времени экспозиции 4-6 минут. Затем возобновлялась подача физиологического раствора. Автор отмечал повышение эффективности операции и уменьшение ятрогенных осложнений, связанных с процедурой механического удаления кортикальных слоев стекловидного тела с поверхности сетчатки [40].
    Однако в настоящее время большая часть работ, в которых используется термин «фармакологический витреолизис» посвящена ферментной индукции ЗОСТ. По данным авторов при фармакологическим витреолизисе происходит отделение СТ от сетчатки и его коллапс, во-первых, за счет разжижения гелеобразной структуры стекловидного тела, во-вторых, за счет ослабления адгезии ЗГМ к внутренней пограничной пластинке [112,131,143,252]. Так же как и в случае самопроизвольной ЗОСТ [86,116,180,232], успех фармакологического витреолизиса зависит от одновременного присутствия обоих процессов. Их разделение, особенно индукция разжижения и коллапса СТ без ослабления витреоретинальных связей, может значительно усугублять течение болезни. В категорию риска попадают заболевания, имеющие предрасположенность к отслойке сетчатки, такие как миопия, возрастные дегенерации, различные артро-офтальмопатии [108]. Кроме того, синхизис и синерезис без ослабления контакта между гиалоидом и сетчаткой может создавать проблемы на заднем полюсе глаза и приводить к таким патологическим состояниям, как витреопапиллопатии, витрео-макулярный тракционный синдром и даже вызывать макулярные разрывы.
    В течение ряда лет предпринималось немало попыток использования различных веществ для проведения фармакологического витреолизиса, но все они были не достаточно успешными для того, чтобы получить широкое клиническое применение. Среди используемых в настоящий момент препаратов выделяют две основные группы: неферментные и ферментные. В свою очередь, последние можно подразделить на субстратспецифичные и неспецифичные к субстрату [77].
    Субстратспецифичным ферментным препаратом, исследуемым в течение нескольких последних лет, является хондроитиназа. Этот препарат лизирует хондроитин сульфат, гликопротеин, который предположительно участвует в поддержании гелеобразного состояния стекловидного тела и витреоретинальной адгезии [90,229]. Hageman G.S. с соавторами в 1994 г. показали, что использование хондроитиназы, как этапа витреоретинальной хирургии, облегчает отделение премакулярных мембран и не вызывает каких-либо значительных побочных эффектов [146]. В своих исследованиях они применяли фермент, в сочетании с витрэктомией у пациентов с макулярными разрывами, обусловленными пролиферативной диабетической витреоретинопатией. Однако ранее в 1984 г. Quiroz H. с соавторами отмечали, что хондроитиназа не вызывает ни разжижения СТ, ни ЗОСТ [222]. Heegaard S. в 1994 г. при электронно-микроскопическом изучении состава и структуры ВПМ сетчатки кадаверных глаз также показал неэффективность данного фермента в отделении ЗГМ от ВПМ [153].
    Другим субстратспецифичным ферментом является гиалуронидаза. Ее механизм действия основан на гидролизе гиалуроновой кислоты с образованием глюкозамина и глюкуроновой кислоты, что приводит к деполимеризации и укорочению молекулы гиалуроновой кислоты [188,226,245]. Еще в 1974 г. Stankiewicz A. изучал разжижающее действие гиалуронидазы на СТ глаза кролика [245]. Согласно его исследованиям, гиалуронидаза способна самостоятельно стимулировать образование ЗОСТ, однако в эффективных концентрациях она вызывает отек и некроз сетчатки. Низкие концентрации фермента, введение которых не дает побочных эффектов, малоэффективны [183,184]. Кроме того, имеются данные о том, что гиалуронидаза также как и хондроитиназа вызывает ослабление связи между фоторецепторами и пигментным эпителием [266,267].
    Вопрос об эффективности гиалуронидазы в отношении индукции ЗОСТ на сегодняшний день остается спорным, и исследования в этом направлении ведутся многими научными школами. Так, например, в 1997 г. Karagozian H.L. с соавторами на глазах экспериментальных животных отмечали эффективность гиалуронидазы в случаях помутнений СТ, обусловленных интравитреальными кровоизлияниями [185]. Они показали, что использование данного фермента может не только служить качественным дополнением к интравитреальным хирургическим техникам, но и заменять их.
    Относительно неспецифичным ферментом является диспаза — нейтральная протеаза, получаемая из Bacillus polymyxa [172,250,268]. Механизм действия диспазы связан с ее способностью расщеплять базальные мембраны различных тканей [144,210], в том числе и базальные мембраны ретинального пигментного эпителия [220]. Данный фермент действует на IV тип коллагена и фибронектин, в то время как другие компоненты экстрацеллюлярного матрикса, такие как коллаген V, VII типов и ламинин устойчивы к его воздействию [250]. Авторы предполагают, что диспаза может избирательно воздействовать на ВПМ сетчатки именно в зоне витреоретинального контакта, так как известно, что ВПМ по своему молекулярному и структурному составу похожа на другие базальные мембраны. Tezel T.H. с соавторами в 1998 г. в исследованиях, проведенных на свиных и человеческих глазах, показали, что диспаза успешно индуцирует образование ЗОСТ, не разжижая СТ [250]. Однако Frenzel E.M. считает диспазу способной вызывать пролиферативную витреоретинопатию с образованием васкуляризованных эпиретинальных мембран [128], а Kang S.W. отмечал ее токсическое действие на внутренние слои сетчатки [184].
    В последнее время появляется все больше работ, посвященных способам индукции ЗОСТ с использованием фибринолитического фермента плазмина и активаторов его предшественника плазминогена, в первую очередь, рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (ТАП) [158,161,181,182,191,194,196,198,201]. Плазмин — сериновая протеаза, расщепляющая лизил-аргининовые и лизил-лизиновые связи в белковых субстратах, главным образом в фибрине и фибриногене. Кроме фибрина и фибриногена плазмин способен расщеплять некоторые факторы свертывания крови (XII, VIII), гормон роста, ?-глобулин. Он обладает эстеразной и амидолитической активностью (на этих свойствах плазмина основано несколько методов его количественного определения). Предположительно, плазмин способен гидролизировать коллаген IV типа за счет активации коллагеназы [259], а также имеет протеолитическую активность по отношению к ламинину и фибронектину [217], которые являются компонентами ВПМ сетчатки и связывают ее коллагеновые волокна с коллагеновыми волокнами ЗГМ СТ [101,189,190]. Плазмин, действуя именно в зоне витреоретинального контакта, расщепляет ламинин и фибронектин, индуцируя заднюю отслойку стекловидного тела [69,194].
    Одними из первых использовать интравитреальное введение плазмина для индукции ЗОСТ предложили Verstraeten T.C. с соавторами в 1993 г. [259]. В экспериментальных исследованиях они вводили 1 МЕ человеческого плазмина в полость СТ глаз кроликов, после чего в некоторых случаях выполняли центральную витрэктомию. Авторы предположили, что витреоретинальное соединение, ослабленное действием плазмина, под влиянием тракционных и аспирационных сил, создаваемых наконечником витреотома, должно полностью разрушаться, приводя к формированию ЗОСТ. В результате было показано, что предварительное интравитреальное введение плазмина значительно облегчает отделение гиалоида в ходе витрэктомии, способствуя образованию полной ЗОСТ, в то время как введение плазмина без последующей витрэктомии приводит к появлению лишь ограниченных участков отслоения ЗГИ от ВПМ. Из побочных эффектов авторы отмечали приходящие изменения показателей электроретинограммы, выраженные в снижении амплитуды B-волны с последующим ее восстановлением, объясняя эти изменения высокой осмолярностью раствора плазмина.
    Hikichi T. и Yanagiya N. в 1999 г. в экспериментальных исследованиях на глазах кроликов исследовали возможность индукции ЗОСТ путем интравитреального введения раствора плазмина и газа SF6 [163]. Кролики были разбиты на три группы: в первой группе в полость СТ через плоскую часть вводили 1 U (0,1 мл) человеческого плазмина и 0,5 мл SF6, во второй — только 1 U плазмина, в третьей — только 0,5 мл SF6. Результаты показали, что интравитреальное введение плазмина в комбинации с SF6 успешно индуцирует образование ЗОСТ, тогда как их изолированное введение не достаточно эффективно для этой цели.
    Gandorfer A. с соавторами в 2001 г. в исследованиях на свиных глазах показали, что плазмин может самостоятельно вызывать отслойку ЗГМ от ВПМ по всей поверхности сетчатки за исключением экватора без каких-либо дополнительных манипуляций [135]. Авторы отметили корреляцию между концентрацией и временем экспозиции фермента. Продолжительность экспозиции плазмина для получения протеолитического эффекта при его концентрации 1 U составила 30-60 мин. На глазах с ПВР для эффективной индукции ЗОСТ потребовалось 60 мин воздействия 2 U плазмина. При гистологическом исследовании экспериментальных глаз Gandorfer показал, что плазмин не оказывает воздействия на коллаген IV типа и не вызывает побочных эффектов, связанных с его токсическим действием на оболочки глаза.
    Тем не менее, не смотря на то, что Verstraeten T.C., Gandorfer A. и Hikichi T. в своих исследованиях не выявили гистологических свидетельств повреждения сетчатки при интравитреальном введении плазмина, некоторые авторы все же отмечают его цитотоксичность [215].
    В связи с этим многими авторами проводятся попытки хирургического использования аутогенного плазмина, который выделяется из собственной сыворотки крови пациента, что значительно снижает аллергические и токсические реакции. Так, например, Margherio A.R. с соавторами в 1998 г. предложили способ хирургического лечения травматических макулярных разрывов у детей с использованием аутологичного плазмина, в качестве дополнения к стандартному интравитреальному вмешательству [205]. Группа больных была выбрана с учетом того, что у детей адгезия СТ к сетчатке намного прочнее, чем у взрослых, поэтому отделение ЗГМ сопряжено с большими трудностями и часто сопровождается ятрогенными осложнениями. Использование аутоплазмина должно было облегчить отделение ЗГМ в ходе витрэктомии.
    Способ заключался в следующем. За три дня до вмешательства у каждого пациента из вены брали 20 мл крови и подвергали центрифугированию до получения свежей плазмы. Аутологичный плазминоген выделяли из плазмы методом хроматографии и превращали в плазмин с помощью стрептокиназы. Затем полученный плазмин подвергали тесту на стерильность и протеолитическую активность, после чего выдерживали в течение 48-ми часов при температуре 4°C. Во всех случаях за 15 мин до интравитреального вмешательства через сквозной прокол оболочек в области проекции плоской части цилиарного тела выполняли инъекцию 0.1 мл раствора аутологичного плазмина в дозировке 0.4 IU (интернациональных единиц). Авторы показали, что предварительное введение плазмина в полость СТ значительно облегчает отделение ЗГМ в ходе витрэктомии и позволяет избежать осложнений, связанных с многочисленными инструментальными манипуляциями, к которым приходится прибегать для того, чтобы разорвать прочный витреоретинальный контакт.
    Основываясь на работах Margherio A.R., Williams J.G. с соавторами в 2001 г. предложили использовать аутогенный плазмин для облегчения отделения ЗГМ в ходе витрэктомии на глазах с диабетической ретинопатией [261]. В свои исследования они включили шесть пациентов с тракционной ОС. Методика практически не отличалась от методики Margherio A.R., кроме того, что вмешательство проводилось на глазах взрослых пациентов с измененной ЗГМ и отслоенной сетчаткой. Авторы также отмечали значительное облегчение отделения гиалоида от ВПМ в ходе интравитреального вмешательства. Во всех случаях они достигли анатомического прилегания сетчатки без каких-либо побочных эффектов от введения аутогенного плазмина.
    Недостатком данных методик является высокая стоимость и длительность процесса выделения аутогенного плазмина, которые ограничивают его клиническое применение. В настоящий момент поиски в этом направлении активно ведутся во многих клиниках мира.
    Перспективным является использование для индукции ЗОСТ плазминогена и его активаторов [106,151,158,160,181,182,191,194,196,201]. Плазминоген — профермент, широко распространенный в организме [152,154]. Он обнаруживается в плаценте, сперме, миометрии, эндометрии, но, главным образом, в плазме крови, где его концентрация достигает 0.2 г/л. Плазминоген — гликопротеид с массой молекулы 92000-94000, содержащий 20 углеводов. Он синтезируется в печени, костном мозге, почках, причем весьма быстро, так как его концентрация может вырасти от нуля до нормальных значений в течение 24-х часов. Основная его функция в организме — участие в системе фибринолиза.
    Под действием некоторых активаторов плазминоген превращается в плазмин [88,154]. Активация плазминогена осуществляется по трем различным путям: 1) внутреннему, или гуморальному, когда все вовлеченные в процесс компоненты являются предшественниками; 2) внешнему, когда из тканей или сосудистой стенки активаторы выделяются в кровоток под действием некоторых стимулов, либо травмы; 3) экзогенному, когда активирующее вещество вводится в организм с терапевтической целью.
    Активаторы плазминогена — высокоспецифичные сериновые протеазы регуляторного типа. Активаторы обнаружены в крови, других биологических жидкостях и тканях организма человека и животных [93,139,150,202,239,246,253,255,260].
    Функции активаторов плазминогена: регуляция жидкого состояния крови (фибринолиза), овуляции и имплантации бластулы, регенерация тканей, активация коллагеназ, атерогенеза, роста и метастазирования опухолей и другие [24].
    Активаторы плазминогена классифицируются в зависимости от источника получения: тканевый, сосудистый, плазменный, активатор из мочи — урокиназа, а также АПГ, выделяемые культурами нормальных, раковых и трансформированных онкогенами клеток [24].
    Тканевые, сосудистые и плазменные активаторы, в отличие от урокиназы, сорбируются на фибрине. Фибрин ускоряет активацию плазминогена тканевым активатором, но не УК. В системе без фибрина — значительно активнее урокиназа.
    Синтезирующиеся в клетках эндотелия активаторы нередко остаются в них и по мере надобности расходуются на активацию локального или общего фибринолиза. АПГ высвобождается из эндотелия под действием многочисленных эндогенных и экзогенных стимулов: ацидоза и гипоксии — при закрытии венозного сосуда тромбом in vivo, некоторых вазоактивных медиаторов — гистамина, серотонина, брадикинина, каллидина, сосудистых препаратов — вазопрессина, станозолона.
    Hesse L. и Kroll P. в 1995 г. предложили использовать тканевой активатор плазминогена для облегчения отделения ЗГМ в ходе витрэктомии на глазах с ПДР [194]. В этих исследованиях раствор, содержащий 25 мкг ТАП, вводили в полость стекловидного тела за 15 мин до витрэктомии, так как авторы показали, что максимальная протеолитическая активность плазмина отмечалась через 15-60 мин после введения ТАП. Затем выполняли стандартное интравитреальное вмешательство с удалением ЗГМ и эпиретинальных мембран. Во всех случаях процесс отделения гиалоида и патологических мембран значительно облегчался по сравнению с контрольной группой, где ТАП не вводили.
    В 1999 г. Hesse L. и Kroll P. описали методику индукции ЗОСТ на глазах с ПДР путем интравитреального введения ТАП в сочетании с периферической криопексией сетчатки, суть которой заключалась в следующем [158]. За несколько недель до запланированного интравитреального вмешательства пациентам проводили периферическую криопексию сетчатки, после чего через 24 часа в полость СТ вводили 10 мкг рекомбинантного ТАП. В результате на глазах семи пациентов из 11-ти биомикроскопически и эхографически авторы выявили полную ЗОСТ, а у трех пациентов — частичную. Причем у трех молодых пациентов отслойка ЗГМ произошла непосредственно после введения фермента, что опровергает предположение некоторых авторов о том, что отслоение ЗГМ СТ от ВПМ сетчатки, индуцированное интравитреальным введением плазмина или его предшественников, связано не со специфичным действием плазмина на ламинин и фибронектин, а с воспалительным процессом, обусловленным протеолитическим действием данного фермента [149]. По мнению авторов криопексия повышает проницаемость сосудов сетчатки, способствуя выходу компонентов плазмы крови, в том числе плазминогена и плазмина, в периваскулярное пространство витреоретинальной поверхности. Таким образом, создается субстрат для действия ТАП. Последний активирует вышедший плазминоген, катализируя его превращение в плазмин, который в свою очередь гидролизует ламинин и фибронектин, вызывая ЗОСТ.
    Unal M. и Peyman G.A. в 2000 г. показали возможность индукции ЗОСТ путем комбинированного интравитреального введения плазминогена и урокиназы [257]. Исследования проводили на глазах экспериментальных животных, которых разделили на три группы: в первой группе в полость СТ вводили чистую урокиназу (1000, 5000 и 10000 IU (МЕ)); во второй — рекомбинантный плазминоген (0.1, 0.4, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 и 16.0 CU (казеинолитических единиц)). Результаты гистологических и электрофизиологических исследований показали, что наивысшей нетоксичной дозировкой урокиназы является дозировка 1000 IU, а наивысшей нетоксичной концентрацией плазминогена — концентрация 2.0 CU. Ни урокиназа, ни рекомбинантный плазминоген в отдельности не индуцировали отслойку ЗГМ. Поэтому в третьей экспериментальной группе интравитреально вводили комбинацию урокиназы (1000 IU) и плазминогена (0.1, 0.4, 1.0 и 2.0 CU) в нетоксичных дозировках, которая эффективно вызывала ЗОСТ, не оказывая какого либо токсического воздействия на сетчатку.
    Идея применения фибринолитических ферментов для индукции ЗОСТ довольно заманчива, но, несмотря на столь многочисленные работы в этом направлении, многие авторы отмечают их аллергенность, токсичность, возможность бактериальной и вирусной контаминации, а также геморрагических осложнений при их интравитреальном введении [103,149,168,173,179,254]. Основной причиной побочных эффектов является получение этих ферментов их плазмы крови человека.
    В последнее время в отечественной и зарубежной литературе появляются упоминания об успешном использовании в офтальмологии рекомбинантных проактиваторов плазминогена, которые получают из генетически трансформированных бактерий. Их применение лишено побочных эффектов, свойственных ферментам, получаемым из человеческой крови [4,9,13,15,87]. Понятие «рекомбинантный фермент» обозначает, что фермент синтезирован бактерией с генетическим материалом, перераспределенным в результате рекомбинации (в белок бактерии вносится человеческий ген, после чего она начинает синтезировать белок, полностью идентичный человеческому), а понятием «проактиватор» обозначается проферментная форма тканево- и урокиназоподобных активаторов плазминогена в плазме, тканях, культурной среде и не идентифицированного компонента плазмы, который в активном состоянии способен повышать функции плазминовой системы.
    За рубежом проводятся экспериментальные и клинические испытания индукции ЗОСТ модифицированной формой плазмина получившей название «микроплазмин» [104,129,132,133,136,142,143,221]. Микроплазмин обладает теми же протеолитическими свойствами, что и человеческий плазмин, но является более стабильной формой.
    В 2009 г. Chen W. с соавторами изучали на экспериментальных глазах возможность воздействия микроплазмина на белки витреоретинальной поверхности — ламинин и фибронектин. Авторы показали, что микроплазмин при интравитреальном введении полностью разрушает ламинин и фибронектин, находящиеся в слое фоторецепторов сетчатки, индуцируя, таким образом, полную ЗОСТ и не повреждая при этом внутреннюю пограничную мембрану сетчатки [105].
    Ранее в 2005 г. Sakuma T. с соавторами в эксперименте на глазах кроликов также показали способность микроплазмина индуцировать ЗОСТ при интравитреальном введении. При этом авторы отмечали стабильность показателей электроретинограммы и сохранность ультраструктуры сетчатки [227].
    Клинические исследования интравитреального ведения микроплазмина с целью индукции ЗОСТ провели de Smet M.D. и Gandorfer A. в 2009 г., вводя фермент перед витрэктомией по поводу витреомакулярной тракционной макулопатии. Результаты исследований показали клиническую эффективность микроплазмина с целью индукции ЗОСТ, но имелись осложнения — в нескольких случаях интравитреальное введение фермента привело к отслойке сетчатки [115].
    Появление рекомбинантных форм плазмина и проактиваторов плазминогена привело к значительному прогрессу в области фармакологического витреолизиса, однако, существенным недостатком, затрудняющим широкое клиническое применение этих препаратов, является их высокая стоимость.
    В 2012 г. Шарафетдинов И.Х. с соавторами экспериментально изучили возможность индуцировать ЗОСТ с помощью новой оригинальной патентозащищенной рекомбинантной формы модифицированного плазмина отечественного производства — миниплазмина, у которой помимо активного центра, как у микроплазмина, оставлен один крингл-домен [78]. По данным авторов наличие крингл-домена, а также оригинальная последовательность аминокислот в миниплазмине улучшают структуру молекулы, что увеличивает его способность гидролизовать фибронектин и ламинин. Экспериментальные исследования проводили на свежих энуклеированных свиных глазах, в витреальную полость которых вводили 0,1 мл миниплазмина в концентрации 180 мкг с экспозицией 120 мин. Сканирующая электронная микроскопия показала, что при интравитреальном введении миниплазмин в указанной дозировке и экспозиции вызывает индукцию ЗОСТ, а его клиническое использование в области лечения витреоретинальных заболеваний является перспективным [50].
    Однако, в настоящее время, миниплазмин не может применяться в клинической практике, поскольку официально не зарегистрирован для применения в офтальмологии.
    Таким образом, резюмирую вышеизложенное, можно сказать, что вопрос об оптимальном ферментном препарате для индукции ЗОСТ на глазах с отслойкой сетчатки остается по-прежнему нерешенным. В связи с этим продолжаются поиски доступного фермента, который бы индуцировал ЗОСТ, не вызывая побочных эффектов и не оказывая отрицательного влияния на течение отслоечной болезни.