1.3. ТИАБ увеальной меланомы с прогностической целью.

     В настоящее время ТИАБ УМ становится все более востребованной манипуляцией благодаря расширяющемуся изучению прогностически и предиктивно значимых молекулярных нарушений, для определения которых необходимо получение клеток опухоли. Основанием этому является, как уже было сказано, органосохраняющая направленность в лечении УМ, чаще встречающиеся малые формы, а также возрастающая грамотность пациентов. Так, по данным Beran T.M. с соавт.(2009г) [49], 97% пациентов с УМ хотели бы знать о риске развития МТС.

    Несмотря на активное изучение УМ, метастатическая форма остается инкурабельным заболеванием с медианой общей выживаемости не более 12 мес [58, 74, 152]. При этом, такой низкий уровень выживаемости стабилен на протяжении последних 30 лет [205]. Существенное увеличение выживаемости может быть достигнуто при комплексном лечении пациентов с единичными метастатическими очагами небольшого размера [5, 58]. Соответственно, наиболее актуальными направлениями клинических исследований при УМ в настоящее время являются: поиск методов раннего выявления небольших метастатических очагов и разработка эффективной адъювантной терапии [11, 12, 94]. Подобный подход доказал свою эффективность при лечении метастатической формы меланомы кожи [6, 13–15]. Для обоих этих направлений критически важен адекватный отбор пациентов с высоким риском развития МТС, который существенно затрудняется отсутствием высокоинформативных валидированных прогностических критериев. В рамках ТИАБ спектр прогностических морфологических и генетических факторов, анализ которых возможен на небольшом объеме материала, может быть очень ограниченным, в связи с чем необходимо выделение наиболее значимых.

    Прогноз при УМ индивидуален и зависит от широкого круга факторов [50, 63]. C более высоким риском метастазирования ассоциированы мужской пол пациента, а также возраст старше 65 лет. Shields CL с соавт. (2009г) было доказано, что с каждым миллиметром проминенции опухоли риск развития МТС увеличивается на 5% [193]. В два раза чаще МТС отмечают у пациентов с УМ цилиарного тела [135, 146], а также при экстрабульбарном росте [177].

    Кроме того, прогностическую ценность имеют морфологические признаки. В качестве предикторов плохого прогноза при УМ описано большое количество митозов, некрозы, признаки патологического сосудообразования (псевдососудистые петли [57, 97, 139, 232], наличие инфильтрирующих опухоль лимфоцитов или макрофагов [66, 226] и проникновение опухолевых клеток в окружающие ткани (инвазия или инфильтрация [65]). Однако определение морфологических признаков, предусматривающих сохранение архитектоники опухолевой ткани, при ТИАБ УМ не представляется возможным. Единственной морфологической особенностью опухоли, определение которой возможно в рамках цитологического исследования, является клеточный тип. Ассоциация клеточного типа с развитием МТС УМ была доказана еще в середине прошлого столетия на материале 2652 энуклеированных глаз. Так, 3- и 5-летний уровень выживаемости при эпителиоидноклеточной УМ, по данным Paul E.V. с соавт.(1962г) [162], составляет 60% и 48%, соответственно. При этом выживаемость пациентов с УМ веретеноклеточного строения намного выше и определяется на уровне 95% и 90% для 3 и 5 лет, соответственно. Значимость данного прогностического фактора подчеркивается многими исследователями [83, 100, 123, 140, 162, 179, 180], однако его определение на материале биопсии не проводится [184].

    Совокупность клинических и морфологических факторов дает важную, но далеко не исчерпывающую информацию о риске метастазирования конкретной опухоли. В связи с этим большие надежды возлагаются на молекулярные факторы прогноза [33]. Молекулярный патогенез УМ изучен достаточно хорошо. «Драйверами» канцерогенеза при УМ являются мутации в «горячих точках» генов GNAQ, GNA11 и реже – других генов того же сигнального каскада (CYSLTR2, PLCB4 и, возможно, также PLCB3) [33].

    Согласно данным литературы, мутации генов CYSLTR2 и PLCB4 определяются в 10% случаев, тогда как GNAQ или GNA11 - в 85% [81, 118, 203]. Цыганков с соавт. (2015г) [19] выявляли мутации этих генов в 90% случаев при анализе периферической крови пациентов без признаков МТС.

    Кроме того, в ряде случаев отмечали встречаемость мутаций двух генов одновременно. Полученные результаты противоречат данным литературы, с которыми авторы сравнивают результаты своей работы: по данным Van Raamsdonk C. D. [169], мутации генов GNAQ и GNA11 являются взаимоисключающими, а также соматическими - определение их возможно лишь в ткани УМ [75, 132, 168]. Metz C. H. D. С соавт. (2013г) [147] сообщает, что выявление мутаций таких генов в периферической крови отмечали у более молодых пациентов лишь с большими МТС УМ, что может быть полезным для ранней диагностики диссеминации. Несмотря на высокую специфичность мутаций генов GNAQ и GNA11, свидетельств об использовании данных нарушений для дифференциальной диагностики УМ, по данным литературы, нет. Связь данных нарушений с риском развития МТС, согласно исследованиям, малозначительна[44, 133]. Однако Van Raamsdonk C. D. С соавт. (2010г) [169] сообщали о тенденции к повышению уровня выживаемости при мутации гена GNA11 по сравнению с мутацией GNAQ или вовсе без мутаций. При этом работа Griewank K. G. (2014г) [107] свидетельствует об обратном: уровень выживаемости пациентов с УМ при мутации GNA11 уступает уровню выживаемости без нее. Противоречащие данные, малое количество работ на данную тему, а также отсутствие в отечественной практике анализа выживаемости при данных мутациях, требует проведения дополнительного ретроспективного исследования.

    Молекулярные нарушения-«модификаторы», появляющиеся на более поздних стадиях канцерогенеза, при УМ демонстрируют значительное разнообразие, и их набор, обнаруживаемый в конкретной опухоли, существенно коррелирует с риском ее метастазирования. На основании анализа молекулярных нарушений-«модификаторов» при УМ можно выделить четыре класса опухолей, которые ассоциированы с различным прогнозом – условно говоря, «хорошим», «средним», «плохим» и «очень плохим» [33]. Существование этих четырех молекулярных классов было многократно продемонстрировано в работах нескольких независимых научных групп с применением различных молекулярно-биологических методов – цитогенетического анализа, мутационного тестирования и профилирования экспрессии мРНК (табл. 1.1.).

    Фундаментальное исследование консорциума TCGA 2017 г. [170] с помощью высокопроизводительного анализа генома, метилома, транскриптома и протеома клеток УМ подтвердило биологическую релевантность этой четырехчастной классификации и в очередной раз показало ее корреляцию с прогнозом, т.е. с риском метастазирования и смерти от УМ. В последние годы были разработаны подробные прогностические классификаторы-номограммы, которые учитывают клинические, морфологические и молекулярные факторы и позволяют максимально индивидуализировать прогноз пациентов с УМ [78, 88, 222, 225].

    Использование молекулярных факторов в этих номограммах не только повышает точность прогноза, но также может «компенсировать» отсутствие некоторых клинических или морфологических данных (например, при недоступности гистологического материала [222]. Несмотря на это, уровень прогностической эффективности, продемонстрированный в работах [78, 88, 222, 225], все же далек от идеала. Это объясняется рядом противоречий в исследованиях, несогласованности результатов, а также широким спектром генетических нарушений, входящих в прогностические классификации.

    Органосохраняющая направленность и необходимость поведения ТИАБ требует выделения наиболее значимых прогностических генетических маркеров, набор которых будет достаточен для определения риска развития МТС, а также реален в рамках относительно малого количества материала. Первым генетическим фактором, влияние которого на развитие МТС было доказано еще в 1996г, является потеря одной копии хромосомы 3, состоящей из короткого (3р) и длинного (3q) плеч. Prescher с соавт. (1996г) [54]. при исследовании 54 энуклеированнных глаз с УМ выявляли моносомию хромосомы 3 в 56% случаев. При этом уровень 3-летней выживаемости при данном нарушении составил 50%. Последующие исследования выявляли моносомию 3 хромосомы практически в том же количестве образцов - в 50-65% случаев. Уровень выживаемости пациентов при делеции хромосомы 3 варьируется от 42% до 54% при сроках наблюдения от 2 до 8 лет [54, 69, 123, 126, 178, 194]. На основании отечественных исследований четкого представления об уровне выживаемости при данном нарушении создать не представляется возможным ввиду противоречивости представленных данных [19]. Работа Shields CL с соавт. (2011г), посвященная анализу 500 образцов УМ методом FISH, сообщает о встречаемости моносомии 3 хромосомы лишь в 25% [194]. Еще 27% приходится на частичную моносомию х ромосомы 3, которую авторы расценивают эквивалентом дисомии: 3-летний уровень метастазирования составляет 2,6% и 5,3% при дисомии и частичной моносомии, соответственно. Данное наблюдение находит подтверждение и в других исследованиях [29, 171, 194, 219]. При этом, ряд авторов утверждает о необходимости расценивать неполную делецию хромосомы 3 как прогностически неблагоприятный фактор или маркер, свидетельствующий о промежуточном прогнозе [71, 73, 90, 194]. Противоречивые данные требуют дополнительного изучения нарушения и его связи с выживаемостью пациентов с УМ. Кроме того, для анализа статуса хромосомы 3, как правило, выполняют исследование всей хромосомы или ее короткого плеча (3р). Исследований, посвященных оценке выживаемости при делеции каждого из плеч – длинного и короткого - по данным литературы, нет, что, однако, может иметь значение.

    В рамках исследования нарушений хромосомы 3 также изучают ее маркерный регион, расположенный на коротком плече (3р) - ген ВАР1, о котором впервые в 2010 г сообщил Harbour с соавт.(2010г) [111]. Мутация гена ВАР1, по данным литературы, ассоциирована как с делецией хромосомы 3, так и с высоким риском развития МТС [76, 82, 170, 229, 91, 93, 99, 111, 112, 134, 150, 154]. Так, согласно различным источникам, уровень 3- и 5-летней выживаемости пациентов с УМ при мутации гена ВАР1 почти в два раза ниже, чем при его нормальном статусе [91, 124, 155, 161, 171, 218]. Примечательно, что исследование региона ВАР1 проводится по двум основными направлениям. Одна часть авторов выполняет поиск мутаций гена ВАР1, другая – оценку ядерной экспрессии белка BAP1 иммуногистологическим или иммуноцитологическим методом, что является суррогатным маркером для скрининга мутационного статуса гена BAP1. При этом единого мнения о том, как исследовать данное нарушение не существует. С одной стороны, van de Nes JA с соавт. (2016г) [154] утверждает, что определение уровня экспрессии белка ВАР1 является более надежным методом, чем определение мутации одноименного гена по Сэнгеру. С другой – имеющиеся данные о неполном совпадении результатов иммуноцитохимического исследования ВАР1 с его мутационным статусом, по мнению Kalirai H. с соавт. (2014г) [124], показывают несостоятельность суррогатного маркера и метода его определения. Кроме того, иммуноцитохимический метод требует получения более объемного материала по сравнению с мутационными исследованиями, что в рамках ТИАБ может быть затруднительно. Это делает генетические тесты, направленные на определение мутации гена ВАР1, более предпочтительными [81]. Однако отсутствие четкого представления о предиктивной точности каждого из подходов, не позволяет сделать вывод, какой из методов целесообразно использовать у пациентов при проведении ТИАБ УМ с прогностической целью.

    Еще одним важным, но «второстепенным», по данным литературы, предиктивным цитогенетическим фактором является изменение хромосомы 8, состоящей также из двух плеч – короткого (8р) и длинного (8q). При этом изменение копийности короткого плеча встречается реже, чем длинного. Увеличение копий 8q, по данным литературы, выявляют в 37-67% случаев [55, 69, 73, 80, 81, 90, 123, 127, 134, 157, 215]. В исследовании Shields CL с соавт. (2017г) [198], посвященном анализу выживаемости 1059 пациентов в зависимости от цитогенетических нарушений, уровень смертности на момент 3 лет при изменении региона 8р составил 29%. Увеличение копийности 8 q было ассоциировано с развитием МТС при 3-летнем сроке наблюдения примерно у того же количества пациентов с УМ (21%), что соотносится с данными Damato B с соавт. (2003г) [178]. Согласно The Cancer Genome Atlas (TCGA), изменения короткого плеча хромосомы 8 не учитываются для определения прогностического класса и риска возникновения МТС -значимым является результат исследования лишь длинного плеча. Однако существующие данные о связи делеции 8р с развитием МТС УМ [90] не позволяют полностью исключить это нарушение из спектра прогностических маркеров.

    Место других цитогенетических факторов является неоднозначным и требует последующего изучения. Так, изменение копийности хромосомы 1, а именно ее короткого плеча, по данным Ewens, K. G. С соавт. (2013г) [90] выявляется в 18% случаев УМ. Уровень 3- и 5-летней выживаемости при делеции региона 1р составляет 50% и 38%, соответственно, при нормальном его статусе - 85% и 70%, соответственно [90]. Häusler T с соавт. (2005) [114] сообщает о встречаемости данного нарушения в УМ с моносомией 3 хромосомы. Было показано, что пациенты с опухолями, содержащими одновременно моносомию хромосомы 3 и делецию региона 1р, имеют в 7,8 раз более высокий риск развития МТС по сравнению с пациентами без таких нарушений или при одном из них [126]. Однако в отечественной литературе представлены данные об отсутствии значимости изменения хромосомы 1 в вероятности развития МТС. Так, Цыганков с соавт.(2015г) [19] не получили различий в выживаемости пациентов с и без потери копии хромосомы 1. Относительно редкая встречаемость изменения хромосомы 1 у пациентов с УМ, ее связь с моносомией 3, а также свидетельства об отсутствии ее значимости в риске развития МТС, требуют проведения дополнительного исследования с последующим определением необходимости включения данного нарушения в прогностическую панель при проведении ТИАБ.

    Работы, посвященные изучению хромосомы 6, малочисленны и противоречивы. С одной стороны, изменение хромосомы 6 считается прогностически благоприятным фактором [86, 160]. Увеличение копийности ее короткого плеча (6р) также может быть ассоциировано с нормальным статусом хромосомы 3, что ложилось в основу предложения выделять УМ с таким набором изменений в отдельный прогностический класс [53, 86, 160]. С другой стороны, делеция длинного плеча (6q), по данным ряда авторов, ассоциирована с высоким риском развития МТС [28, 198]. Другие авторы свидетельствуют об отсутствии разницы в выживаемости пациентов с какими-либо изменениями хромосомы 6 [90]. Среди нарушений-«модификаторов», кроме ранее описанного ВАР1, также выделяют маркеры, входящие в состав мутационной классификации риска развития МТС УМ, – мутации генов EIF1AX и SF3B1. Мутация гена EIF1AX, по разным данным, встречается в 8-21% случаев УМ [82, 91]. Считается, что данное нарушение обладает «защитными» свойствами – мутация EIF1AX ассоциирована с дисомией 3 хромосомы и с минимальным уровнем МТС у пациентов с УМ. Различными авторами было показано, что мутации генов EIF1AX, BAP1 и SF3B1 являются взаимоисключающими, хотя мутационная классификация предусматривает комбинацию мутации генов SF3B1 и ВАР1 в рамках 4, самого неблагоприятного, прогностического класса [170].

    Мутация гена SF3B1, встречающаяся в 10-30% случаев и, как правило, у пациентов более молодого возраста [76, 142, 175], также ассоциирована с нормальным статусом хромосомы 3. Выявление такой мутации, по мнению Harbour JW с соавт. (2016г, 2014г) [76, 94] свидетельствует о низком риске развития МТС. Однако, в отличие от мутации гена EIF1AX, выявление SF3B1, по ряду данных, может предсказывать возникновение МТС на более поздних сроках. Так, Yavuzyigitoglu с соавт. (2016г) [228] показали, что МТС у пациентов с таким нарушением развиваются в среднем через 8,2 лет наблюдения, что было подтверждено в рамках других исследований [33, 48, 93]. Существующие также данные об отсутствии статистически значимой разницы в выживаемости пациентов с мутацией гена SF3B1 и без нее, демонстрируют неоднозначность мнений в отношении данного нарушения. Целесообразность его анализа на материале ТИАБ требуется определить в рамках ретроспективного собственного исследования.

    Таким образом, несмотря на имеющиеся в литературе данные о проведении биопсии внутриглазных образований, остаются нерешенными многие вопросы, которые не позволяют ТИАБ расценивать как целостную технологию, препятствует ее полноценному и безопасному использованию как с диагностической, так и с прогностической целью. Это касается и отсутствия четкого представления об оптимальном инструментальном обеспечении процедуры и самой методики манипуляции. По данным литературы, ТИАБ, как правило, выполняется не специализированными инъекционными иглами, предназначенных для других целей. При этом биопсийные иглы для ВГО не разработаны. Кроме того, не ясной остается техника забора материала, не определен оптимальный доступ для очагов различной локализации. Инструментальная и методическая неразработанность являются одной из причин не только низкой информативности и качества материала, получаемого при ТИАБ, но и возможных осложнений, профилактика которых не описана. В частности, не определены принципы борьбы и предотвращения возможных витреальных кровоизлияний. Отсутствие описанных в литературе мер профилактики ятрогенного экстрабульбарного распространения опухоли по раневому каналу диктует необходимость разработки такого метода. По данным литературы, существующая техника обработки материала ТИАБ внутриглазных образований не позволяет «максимально» использовать биопсийный материал, что также отрицательно сказывается на его информативности. Это особенно актуально в отношении прогностической ТИАБ УМ, при которой необходимо проведение не только цитологического исследования, но и генетического. Обилие морфологически и генетически предиктивно значимых маркеров, определенных различными авторами, не позволяет выделить наиболее «веские», анализ которых на относительно небольшом количестве материала ТИАБ позволит с высокой степенью достоверности предсказывать риск развития МТС. Не проведен сравнительный анализ встречаемости различных маркеров в однородных группах пациентов с МТС и без МТС. В литературе отсутствуют данные об оценке выживаемости в зависимости от основных предиктивно значимых нарушений, определяемых на одном и том же ретроспективном материале.

    Разработка всех составляющих целостной технологии ТИАБ, включающей инструментальное обеспечение, методические приемы, профилактику осложнений, обработку материала, и определение прогностической панели наиболее значимых маркеров, предсказывающих метастатический потенциал УМ, позволит не только повысить диагностическую ценность процедуры, но и сделать ТИАБ необходимым инструментом в определении прогноза у пациентов с УМ, что является актуальным направлением не только в офтальмоонкологии, но и в онкологии в целом.