1.4. Проблема гипотермической консервации и жизнеспособности донорских роговиц в культуральных средах

    В 1934 г ФилатовВ.П. впервые в мире предложил уникальный метод продления жизни трупной донорской роговицы до ее пересадки во влажной камере при низких температурах [38;69], что явилось существенным вкладом в борьбу с роговичной слепотой во всем мире [51; 58; 92]. Долгоевремя метод консервации глазных яблок по Филатову считался непревзойденным, позволявшим сохранять донорские роговицы до 2-5 суток и даже более [7].

    И только в 60-х годах прошлого века рядом офтальмологов было, что хранение трупных донорских роговиц в изолированном виде в физиологических растворах значительно пролонгирует жизнеспособность их клеточного пула [1; 2; 3; 39; 42; 55; 78; 104; 114; 122].

    Новая эра холодового сохранения донорских роговиц началась с 1974 г и связана с именами Mc Carey E. и Kaufman H.E. Авторы сообщили, что роговицы новозеландских кроликов, консервированные в среде для тканевых культур (среда McCarey-Kaufman) при t +4°С, сохраняют свою жизнеспособность до 14-ти дней [96; 97]. Однако, в результате дальнейших исследований было установлено, что HEPES-буфер и гентамицин, содержащиеся в данной среде, оказывали неблагоприятное воздействие на насосную функцию ЭК, что приводило к отеку стромы роговиц и сокращало сроки их консервации [83].

    С этого периода началась активная разработка и усовершенствование растворов для гипотермической консервации. В 1985 г. Kaufman H.E. с соавторами разработали среду К-Sol [87]. Согласно мнению авторов, была достигнута сохранность жизнеспособности донорских роговиц даже в течение 2-х недель консервации. Однако другие исследователи установили, что, несмотря на сохранность гистологии и архитектоники роговиц до 10-ти суток, на функциональном уровне к этому сроку их эндотелий становился нежизнеспособным [49; 67]. Эти наблюдения побудили исследователей продолжить поиски оптимального состава консервационных сред.

    В 1990 г. группа исследователей EBAA предложила новую рецептуру среды, без хондроитин-сульфата, лишь незначительно изменив концентрацию декстрана-40, которая была ими названа Dexsol. Примерно в то же время H.E. Kaufman с соавторами усовершенствовали ранее предложенную пропись и разработали среду Optisol [88], которая была признана эталонной и до настоящего времени остается табельной для всех ГБ Америки и других стран [115].

    В 1990 г в России был предложен состав отечественной среды для гипотермической консервации роговицы (пропись Борзенка-Мороз), который также имеет в своем составе компоненты, регулирующие онкотическое давление в ткани роговицы, но от выше приведенных сред существенно отличается уточненным подбором аминокислотного состава и содержанием энергетически активного субстрата – натрия ?-оксибутирата, способствующих пролонгированию энергетического метаболизма и оказывающих выраженное защитное действие на ЭК, тем самым обеспечивая стабилизацию клеточных мембран, их исходную плотность и достаточный уровень содержания в них макроэргических соединений как минимум до 6-ти суток консервации [28; 72; 73]. В настоящее время среда Борзенка-Мороз зарегистрирована, производится и является коммерчески доступной («Раствор для хранения роговицы» ТУ № 9398-013-29039336-2008 ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) применяется во всех Глазных тканевых банках Российской Федерации. В 2008 г С.А. Борзенком были подробно изложены морфологические, ультраструктурные и функциональные характеристики ЭК роговиц, консервированных в предложенной среде [3]. При этом необходимо отметить, что для других промышленно выпускаемых в мире сред, такое подробное описание морфофункциональных характеристик донорского материала обнаружить не удалось.

    Анализ причин ограниченных сроков гипотермической консервации донорских тканей, проведенных отечественными трансплантологами, показал невозможность увеличения сроков гипотермического сохранения донорского материала уже потому, что сама гипотермия, снижающая кислородную и энергетическую потребность тканей, превращается из фактора защиты в фактор повреждения клеток [40]. В результате воздействия пониженных температур в клеточных структурах развиваются конформационные перестройки (в структуре мембранных липидов и белков, регулируемых энергией слабых связей), которые нарушают адекватность сниженного энергетического метаболизма и способствуют накоплению энергетической задолженности в тканях. При этом усиливаются диффузионные процессы, приводящие к развитию интерстициального отека и повреждению клеток донорского трансплантата как органов, так и витальных тканей.

    Исследованиями зарубежных офтальмологов было установлено по F-актину ЭК роговиц, консервированных в среде Optisol-GS в гипотермических условиях что, к 7-ми суткам их хранения возникают значительные повреждения и поломки в цитоскелете [86].

    На сегодня, по общепринятому мнению в мировой трансплантологии, для пролонгирования допустимых сроков холодовой консервации донорских тканей (в том числе и роговиц), необходимо использовать методы фармакологической протекции с помощью патогенетически ориентированных лекарственных препаратов и ростовых факторов, которые, в страиваясь в мембранные структуры клеток, стабилизируют энергетический метаболизм, повышают эффективность внутриклеточных взаимодействий органелл и межклеточных взаимодействий [3; 32; 40].

    В ряде зарубежных публикаций показана возможность стимуляции эндотелиальных клеток, синтеза в них ДНК, митотической активности с помощью эпидермального фактора роста (EFG), фактора роста фибробластов (FGF), трансформирующего ростового фактора β (TGF-β), тромбоцитарного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), гепарина, 3',5'-циклического монофосфата и селенитов. При этом наиболее выраженным эффектом обладают FGF и EFG [68; 76; 82; 116; 121; 133; 139].

    Отечественными офтальмологами было установлено, что в норме не наблюдается активного образования перечисленных факторов роста и их воздействия на клетки эндотелия интактных роговиц [33; 36]. Синтез биологически активных факторов начинается только при системных патологических процессах, таких как сахарный диабет, злокачественные опухоли, системные заболевания.

    В настоящее время продолжает интенсивно исследоваться влияние различных факторов роста и их сочетания с другими биологически активными веществами на эндотелий трупной донорской роговицы при ее консервации перед трансплантацией.

    Также было выявлено протективное воздействие человеческого EGF и инсулина, введённых в пропись среды Optisol, на стабильность фосфолипидов клеточных мембран донорских роговиц в процессе гипотермической консервации [93].

    По данным Rieck P.W. с соавторами (2003 г.), введение FGF-2 в среду Optisol в концентрации 40 нг/мл способствует достоверно значимому снижению обратимого и необратимого апоптоза ЭК донорских роговиц не менее, чем на 48% при снижении потери ЭК на 38 и 54% соответственно по сравнению с контролем в течение 14-ти суток гипотермической консервации [113].

    Не так давно установлено, что помимо ультраструктурной и морфофункциональной сохранности для максимальной сохранности ПЭК трансплантата в послеоперационном периоде необходимо сохранение баланса между про- и антиапоптотическим балансом в ЭК [44; 90]. Изначально апоптоз рассматривался учеными как процесс, сопровождающийся «физиологической гибелью» отживающих клеток, в противовес некрозу - «насильственной гибели» клеток. Однако было показано, что апоптоз сопровождает патологические процессы как in vivo, так in vitro при воздействии на культуры клеток различных этиопатогенетических факторов [89]. Одним из таких индукторов апоптоза ЭК в процессе консервации трупной донорской роговицы является холодовой стресс [16; 23; 59; 91; 119]. От показателя апоптотически поврежденных клеток (апоптотического индекса) зависит благополучие отдаленного посттрансплантационного периода (от 1 недели до 1 года) [44; 71; 91; 103].

    К физиологическим ингибиторам апоптоза относятся факторы роста, экстрацеллюлярный матрикс, аминокислоты, пептиды, антиоксиданты, фосфолипиды, нейтральные жиры, соли макро- и микроэлементов, цинк и другие вещества, обеспечивающие нормальное функционирование и жизнедеятельность любых клеток. В этой связи исследования жизнеспособности ЭК и возможности ингибирования апоптотического процесса в ЭК донорских роговиц с помощью различных биологически активных веществ на этапе консервации являются актуальными [140].

    На сегодня опубликованных работ по изучению ПЭК в трансплантатах роговицах, подвергшихся апоптозу в процессе консервации очень мало. Однако в них прослеживается зависимость выраженности апоптоза от состава сред, способа консервации, длительности, исходного состояния трупа-донора роговиц. При этом предельно допустимый показатель апоптотически поврежденных ЭК в случае гипотермического хранения в течение 14-ти суток в известных средах не должен превышать 15-17% [45; 71; 91; 103].

    Как отмечалось выше, принято считать, что введение в состав консервационных сред фармакологических препаратов как клеточных протекторов и ингибиторов апоптоза более предпочтительно, чем ростовых факторов. На этом принципе основано несколько зарегистрированных в Российской Федерации изобретений на составы сред для консервации донорской роговицы. Среда с препаратом «Адгелон» – неспецифическим регуляторным гликопротеином [17]; средство с гомеопатическим препаратом NeyDIL № 37 – специфическим внутриклеточным регуляторным пептидом [34], средство с препаратом «Полудан» [5].

    Несомненно, выше названные растворы эффективно защищают ЭК от патогенетических последствий холодового и других стрессорных воздействий в процессе консервации при +4...6⁰С. Однако они в своем составе не содержат должной концентрации высокомолекулярных веществ (Полиглюкина – декстрана 40 000 D), способной эффективно и в кротчайший срок произвести дегидратацию стромы до первоначальных показателей толщины интактной роговицы.

    M. Tang и соавторами (2013 г.) была проведена оценка задних трансплантатов роговицы с помощью FD-OCT (фурье-оптической когерентной томографии), консервированных в различных средах, после их выкраивания микрокератомом по стандартной технике DSAEK [125]. Авторы измеряли центральную и периферическую толщины трансплантата сразу после выкраивания, затем через 1, 2, 3 и 4 часа после гипотермической консервации. Было установлено, что средняя толщина трансплантатов сразу после выкраивания составляла 188,7 ± 44,4 мкм (146 – 255 мкм), но после 4-х часов хранения в консервационных средах уменьшалась до 147,5 ± 33,0 мкм (116 – 190 мкм). При этом в течение 1-го часа консервации толщина уменьшалась на 30,5 мкм, далее эффект дегидратации был незначительным, к 3-м часам составлял всего -2,0 мкм, а к 4-м часам 0 мкм. Истинная толщина послойного трансплантата после DSAEK зависит от его исходной гидратации и времени пребывания в консервационных средах. Для зарубежных ГБ проблема выкраивания ультратонких трансплантатов номинальной толщины без отбраковки материала техникой DSAEK практически неактуальна в связи с небольшими сроками посмертного извлечения роговиц в виде корнео-склеальных комплексов при отсутствии отека стромы. Табельные среды ГБ ЕВАА и EEBA (Optisol, Eusol и др.) несомненно обеспечивают остаточную дегидратацию и поддержание онкотического баланса тканей роговицы в процессе консервации. Однако для ГТБ Российской Федерации выше означенная проблема представляет актуальность.

    Борзенком С.А. (2008 г.) было установлено, что среднее время доставки в ГТБ энуклеированных глаз трупов-доноров после вскрытия в среднем составляет 14-16 часов [3]. За это время диски роговиц подвергаются коллоидному набуханию в пределах +30% от исходного объема. По мнению автора данного исследования , как зарубежные, так и отечественные среды (Борзенка-Мороз) не в состоянии обеспечить номинальную дегидратацию набухших и утолщенных после смерти донорских роговиц для получения ультратонких трансплантатов после консервации техникой одного прохода микрокератома без отбраковки материала.

    Таким образом, как показал анализ литературных источников, до настоящего времени как в России, так и за рубежом отсутствуют рецептуры консервационных сред для номинальной дегидратации донорской роговицы и оптимальная техника выкраивания ультратонких трансплантатов (80–130 мкм, в среднем 105 мкм) методом одинарного прохода микрокератомом в условиях ГТБ на этапе предоперационной подготовки. И если в ГБ Америки и Европы уже имеются Протоколы выделения задних послойных трансплантатов роговицы, то алгоритмы получения и заготовки ультратонких сегментов трупных донорских трансплантатов роговиц для ЗАПК в системе Российских ГТБ до настоящего времени отсутствуют.

    Нерешенность вышеперечисленных проблем в технологии ЗАПК для Российской Федерации обусловливает актуальность проведения фундаментальных медико-биологических и экспериментально-клинических исследований.