1.5 Прижизненное изучение морфологии роговицы методом конфокальной микроскопии после LASIK

     Софокусная (конфокальная) микроскопия была создана для целей клеточной биологии. В частности, в отличие от обычной микроскопии в проходящем свете, этот метод позволяет изучать морфологию клеток прижизненно. Такая возможность обеспечивается получением максимального контраста исследуемого образца на заданной глубине сканирования. Достичь контраста позволяет ликвидация «шума» фона исследуемого объекта, путем максимального уменьшения диаметра светового пучка, который может быть уменьшен применением диафрагм, щелей или лазерного излучения. Кроме того, важным параметром является разрешающая способность объектива микроскопа. В связи с этим развитие конфокальной микроскопии (КМ) во второй половине XX в. шло параллельно с совершенствованием оптики и разработкой лазеров [52].

    Термин «конфокальный микроскоп» появился в 1977 г. – позже создания самого прибора [52]. Первый конфокальный микроскоп был описан Naoro H. в 1951 году [173]. Этот прибор сразу нашел применение для детального изучения гистологических препаратов и оценки поглощения света ядрами окрашенных клеток [5].

    Вторым этапом явилось создание конфокального микроскопа с подвижным сканирующим предметным столиком. На этом принципе было основано большинство первых КМ [169].

    Egg, использующий для работы диск Нипкова [110]. Опытный образец в ходе работы er M.D. и Petran M. в 1967 г. создали первый тандемный сканирующий КМоставался неподвижным, сканирование происходило за счет перемещения диафрагм микроскопа с множеством круглых отверстий [190]. Этот микроскоп открыл возможность прижизненного изучения объектов без их окраски.

    В конце 60-х г.г. прошлого века в СССР впервые в мире был создан первый конфокальный микроскоп со щелевыми диафрагмами, который оказался очень удачным, и сегодня, несмотря на развитие лазерных технологий, переживает второе рождение. Изобретатель этого прибора Свищев Г.М. не так давно (2011) опубликовал монографию о конфокальной микроскопии [52]. Примечательно, что обоснованный Свищевым Г.М. принцип КМ на основе щелевых диафрагм используется в аппарате «Confoscan» японской фирмы Nidek, который сегодня выпускают уже в четвертом поколении!

    Бурное развитие лазерных технологий нашло отражение и в конструкции КМ. Так, Davidovits P. и Egger M.D. в начале 70-х гг. прошлого века запатентовали в США первый лазерный КМ [106]. Лазерный источник света в силу особенностей лазерного излучения (монохроматичность, постоянная длина волны) позволил значительно улучшить качество изображений, и уже в 1973 г. авторы смогли сделать прижизненные микрофотографии эндотелия роговицы с помощью такого КМ [107].

    Важным этапом развития КМ стало комбинирование метода с флюоресцентной микроскопией. Изначально КМ была мало применима в силу низкого качества изображений в сравнении с флуоресцентными. После объединения конфокальной микроскопии с флуоресцентными методами КМ стала широко использоваться в клеточной биологии [104].

    Дальнейшее развитие метода было связано с совершенствованием обработки изображений, их реконструкцией и интерпретацией [92].

    На сегодняшний день этот метод применяют в иммуноцитохимических исследованиях, изучении структур нервной системы, трехмерной визуализации патологических образований и т. д. [36].

    Особенно актуально использование КМ в офтальмологии. У истоков применения КМ для изучения ультраструктуры роговицы стояли Davidovits P., Egger M., Masters B., Thaer A. [107, 161, 162].

    Большой вклад в адаптацию метода для целей офтальмологии, создание базы данных характерных изменений роговицы при разных видах офтальмопатологии, трехмерную реконструкцию изображений, изучение отдельных структур глаза внесла исследовательская группа из университета г. Росток во главе с профессором Guthoff R. [126, 221, 223].

    Приведенные работы являются важными вехами развития метода конфокальной микроскопии и прижизненного изучения морфологии клеток и тканей (таблица 2).

    Изучению биомеханики и морфологии роговицы, а также их взаимосвязи с отдаленными результатами LASIK посвящен ряд работ. Методы, применяемые в них, различны. На сегодняшний день достоверно послойно измерять толщину роговицы и исследовать ее структуру с достаточной достоверностью позволяют ограниченное количество приборов.

    Конфокальная микроскопия переднего сегмента глаза нашла широкое применение в офтальмологии, прежде всего для оценки состояния роговицы. Отечественные ученые внесли большой вклад в развитие этого диагностического метода [1-5, 25-27, 31, 33, 32, 44,46, 55, 57, 58, 61, 140].

    Существует несколько типов конфокальных микроскопов, используемых сегодня, – тандемно-сканирующие, щелевые, лазерные. В настоящее время чаще используют конфокальный микроскоп со щелевыми полевыми диафрагмами – «Confoscan 4» японской фирмы Nidek, имеющий разрешающую способность 1 мкм. Некоторые преимущества в сравнении с ним имеет аппарат компании Heidelberg Engineering – лазерный конфокальный микроскоп для переднего и заднего отдела – «Heidelberg Retinal Tomograph» (HRT). Корнеальный модуль этого прибора – «Rostock Cornea Module» (RCM), в отличие от других аппаратов, дает возможность исследовать не только центральную зону роговицы, но и все поверхностные структуры, а также передний сегмент глаза [61, 126].

    Авторы первого атласа для интерпретации результатов конфокальной микроскопии отмечают широкие возможности применения этого метода для оценки результатов гипотензивных операций, диагностики инфекционных и аллергических заболеваний роговицы, метаболических расстройств, измерения толщины и послойной визуализации трансплантата после кератопластики и других целей [126].

    Существует несколько пособий, созданных зарубежными разработчиками, производителями приборов и отечественными исследователями [5, 126]. Тем не менее, при использовании того или иного конфокального микроскопа достаточно часто спорным остается вопрос трактовки получаемых изображений.

    Кроме того, недостатками метода являются:

    1. Ограниченная зона визуализации, что препятствует исследованию одного и того же участка роговицы в разные сроки. Этот недостаток частично устранен в приборе «HRT+RCM», в котором предусмотрена возможность движения датчика по поверхности роговицы [219].

    2. Возможность автоматического сканирования только в двухмерном пространстве и отсутствие программного обеспечения для 3D-реконструкции изучаемых структур [219].

    3. Небольшая разрешающая способность объектива, не позволяющая визуализировать органеллы клеток и тонкие веточки нервов. В связи с этим полное сопоставление снимков КМ и гистологических препаратов пока не представляется возможным [219].

    4. Отсутствие возможности количественной оценки плотности кератоцитов и других клеток, хотя работы по созданию такого программного обеспечения ведутся [165, 166].

    5. Светорассеяние вблизи десцеметовой и боуменовой мембран, дающее ложную «гиперрефлективность» окружающих структур, в частности кератоцитов.

    Вместе с тем, при сравнении снимков КМ при патологических состояниях с вариантами нормы на той же глубине сканирования с учетом особенностей использования аппарата, конфокальная микроскопия открывает большие возможности прижизненного изучения тканей на клеточном уровне. Особенно актуален метод в оценке результатов операций LASIK, после которых происходит значительное изменение взаимоотношений слоев роговицы.

    Изучению изменений структуры и толщины роговицы после LASIK посвящен ряд работ. Большинство авторов отмечают увеличение толщины эпителия в ранние сроки после операции.

    Так, Reinstein D. et al. (2006, 2012) определили начало изменений толщины эпителия сразу после лазерной коррекции миопии и полного среза лоскута роговицы. Наибольшая толщина определялась в сроки между 1 днем и 1 месяцем после LASIK. У всех пациентов через 3 месяца после операции толщина эпителия стабилизировалась [199, 200]. Несмотря на то, что увеличение глубины абляции усиливает рост толщины эпителия, в ранние сроки после LASIK при исходной слабой степени миопии наблюдается больший рост толщины эпителиального пласта и связанный с ним регресс, чем при миопии средней и высокой степени [201]. В отдаленном послеоперационном периоде (более 3 месяцев) авторы не обнаружили достоверного изменения толщины эпителия и поэтому не связывают возможный дальнейший рефракционный регресс с этим параметром [200].

    Схожие результаты получили Spadea L. et al. (2000). В их исследовании была выявлена гиперплазия эпителия, которая стабилизировалась через 3 месяца после LASIK [218].

    В ряде других работ с помощью методов конфокальной микроскопии и оптической когерентной томографии были выявлены схожие сроки стабилизации толщины эпителия после LASIK – от 1 недели до 1 месяца [114, 137, 187, 232].

    Отдаленные результаты операций оценили Patel S. et al. (2007). Они нашли, что через 7 лет после LASIK толщина эпителиального слоя не отличается от таковой через 3 месяца после вмешательства [187]. Схожие данные получили и другие исследователи, изучившие двух- и трехлетние результаты [137, 171].

    При оценке толщины эпителия следует учитывать, что пациенты – кандидаты на LASIK, часто носят мягкие контактные линзы. При этом известно, что линзы длительного ношения провоцируют истончение эпителиального слоя роговицы, и это истончение перестает проявляться уже через 1 неделю после прекращения использования контактных линз [131]. Кроме того, негативным эффектом может быть развитие синдрома сухого глаза [112].

    Существует мнение, что гиперплазия эпителия в ранние сроки после LASIK является компенсаторным ответом роговицы с целью восполнить недостаток толщины после абляции за счет увеличения других слоев [200]. Иная точка зрения объясняет увеличение толщины эпителия развитием отека из-за наложения вакуумного кольца [5]. Эпителиальный пласт роговицы после LASIK представляет собой часть поверхностного лоскута, сформированного в ходе операции, поэтому изменения толщины эпителия отражаются на толщине лоскута.

    Reinstein D. et al. (2000) выявили высокую вариабельность толщины лоскута в ранние сроки после LASIK. При этом чаще всего он был тоньше запланированного [198]. Схожие результаты получили Vesaluoma M. et al. (2000) [231]. Балашевич Л.И. и соавт. (2009) исследовали лоскут с помощью ОКТ и нашли его неравномерность по толщине. Авторы объясняют это комплексом технических, микрохирургических и анатомо-оптических факторов [11].

    Кроме того, следует учитывать, что разные модели кератомов имеют разную точность [202, 203].

    Толщина лоскута имеет большое значение при планировании операции LASIK, так как необходимая толщина резидуального стромального ложа должна быть не менее 300 мкм для профилактики развития кератэктазии. В связи с этим применение LASIK бывает ограничено высокой степенью миопии и тонкой роговицей. Азнабаев Б.М. и соавт. (2005) предложили в этом случае использовать двухэтапную методику операции с абляцией и стромы, и лоскута [60].

    В отдаленные сроки после LASIK Patel S. et al. (2007) показали, что увеличение толщины лоскута в значительной степени объясняется увеличением толщины эпителия, максимальные значения данного показателя в их работе составили 12 мкм [187].

    Эти же авторы (2008) изучили изменения рефракционного индекса у большого количества пациентов (76 глаз 49 пациентов) до и сразу после абляции. Они определили увеличение рефракционного индекса тем больше, чем больше была продолжительность абляции [185]. В другом исследовании Patel S. et al. (2004) было обнаружено, что увеличение рефракционного индекса роговицы обратно пропорционально степени ее гидратации. Тем не менее, при реоперации LASIK гидратация соответствовала нормальным значениям, что с точки зрения авторов, свидетельствует о ее постепенном восстановлении после LASIK [186].

    Конфокальная микроскопия позволяет визуализировать заднюю поверхность лоскута роговицы [5].

    Одним из осложнений LASIK является формирование складок лоскута. Однако для этого необходимо достаточно грубое воздействие. Обычно появление складок связано либо с невыполнением пациентом рекомендаций врача в ранние сроки после LASIK («не тереть, не чесать, не давить, не сжимать»), либо с травмой глаза в отдаленном послеоперационном периоде [230]. Предложен ряд мер, направленных на улучшение адаптации лоскута в ходе операции и в отдаленные сроки после нее – складывание лоскута конвертом перед этапом абляции, транспальпебральное его расправление и др. [68].

    С другой стороны, микроскопические складки задней поверхности лоскута – стрии, наблюдаются очень часто при исследовании с помощью конфокальной микроскопии даже через много лет после операции. Стрии не имеют клинического значения, однако могут быть маркером для определения зоны операционного воздействия в отдаленные сроки после LASIK [5].

    Применение конфокальной микроскопии дает возможность послойного изучения основного вещества роговицы – стромы [5, 126].

    Конфокальная микроскопическая картина нормальной стромы включает несколько ярких неправильной овальной формы тел, которые являются ядрами кератоцитов и лежат в толще прозрачного бесклеточного матрикса. Строма условно разделяется на субслои: передний (непосредственно под боуменовой мембраной), средний и задний. Плотность клеток уменьшается от передней к задней части стромы [2, 126]. Активность кератоцитов в области лазерного воздействия наблюдается в ранние сроки после LASIK. В более глубоких слоях, по данным некоторых авторов, морфологические изменения исчезают через 2-6 месяцев после операции [5]. Другие авторы отмечают дефицит кератоцитов даже через 2,5 года после LASIK [115].

    Строма после LASIK перестает быть единым слоем из-за ее частичной абляции. Формируется новый участок, расположенный между лоскутом и ложем, который достаточно трудно определить уже через год после операции [11]. Существует мнение, что морфология этой зоны роговицы является главным фактором успешного функционального результата LASIK [5].

    Исследования, посвященные оценке плотности кератоцитов после LASIK, выявили снижение этого параметра в сроки от 6 месяцев до 5 лет [75, 113]. Однако приведенные выше ограничения конфокальной микроскопии в виде трудности поиска участка предыдущего сканирования, а также погрешности подсчета кератоцитов разными операторами, которые могут варьировать от 3 до 8%, затрудняют адекватную оценку [113, 165].

    Ряд исследователей оценили толщину стромы после LASIK с помощью конфокальной микроскопии. Так, Patel. S. et al. (2007) определили, что в сроки между 1 месяцем и 7 годами после операции не происходит никаких изменений ни в толщине стромы, ни в рефракционном результате [114,187].

    Работа, проведенная Ivarsen A. et al. (2009) выявила противоположные результаты через 3 года после LASIK. Была определена достоверная прямая корреляция увеличения толщины роговицы в центральной зоне и степени рефракционного регресса. При этом такая же корреляция была получена между толщиной остаточного стромального ложа и степенью регресса, что дало авторам возможность связать нарастание рефракционного регресса с увеличением толщины резидуальной стромы [137].

    Другое исследование через 2 года после LASIK не определило достоверного увеличения толщины стромы. Было выявлено снижение плотности кератоцитов в зоне абляции – поверхностные слои стромы резидуального ложа и задние слои лоскута [171]. Схожие данные о плотности кератоцитов получили Canadas P. et al. (2013) и Erie J. et al. (2006) [96, 113].

    С помощью конфокальной микроскопии возможно прижизненное изучение нервных волокон роговицы [219]. Современные приборы позволяют проводить реконструкцию хода нервов, их количественный подсчет и качественный анализ [148].

    Выкраивание поверхностного лоскута роговицы в ходе LASIK приводит к пересечению множества нервных волокон, что обуславливает снижение чувствительности роговицы и развитие синдрома сухого глаза [217]. При этом полное восстановление чувствительности может наблюдаться до полной регенерации нервных волокон. Степень снижения чувствительности роговицы коррелирует с глубиной и диаметром абляции [91].

    Изменения структуры суббазального нервного сплетения роговицы наблюдается уже через несколько часов после LASIK [132]. Некоторые остатки нервных волокон могут сохраняться до 3 суток после абляции, но в течение недели они постепенно исчезают [156, 220].

    Первые очень тонкие нервные волокна появляются не ранее месяца после операции, а полноценные разветвленные нервы обнаруживаются только через год после LASIK [220]. Процесс восстановления нервных сплетений не заканчивается и через 5 лет после операции [116].

    В последнее время все больше внимание исследователи уделяют поиску возможности увеличения скорости регенерации нервных волокон.

    Так, Joo M. et al. (2004) сообщили о положительном влиянии на восстановление нервных волокон цилиарного нейротрофического фактора [139]. Авторы предлагают инстиллировать этот препарат с целью профилактики развития синдрома сухого глаза после LASIK.

    Huang Y. et al. (2011) зарегистрировали увеличение скорости восстановления чувствительности в ответ на нанесение геля, содержащего рекомбинантный бычий основной фактор роста фибробластов, на роговицу после LASIK [135]. Кроме того, эффект регенерации нервных волокон наблюдали Niu L. et al. (2011) после применения геля с безбелковым экстрактом крови телят [176].

    Ghaffariyeh A. et al. (2009) предложили увеличить скорость восстановления нервных волокон путем чрезкожной электрической стимуляции роговицы после LASIK с параметрами 20 Гц, 60 минут [121]. Другие исследователи для уменьшения проявлений или предотвращения развития синдрома сухого глаза после LASIK предлагают использовать препараты искусственной слезы, циклоспорин А, обтурацию слезных точек и другие методы [74].

    Конфокальная микроскопия открывает возможности визуализации специфических для роговиц после LASIK изменений, в частности дебриса.

    Единого мнения на природу включений в зоне абляции, которые принято называть дебрис, на сегодняшний день нет. Высказываются предположения, что этот «мусор» представляет собой продукты абляции, эпителиальные клетки, попавшие на поверхность резидуальной стромы под действием сильной ирригации во время операции, секреты желез, кусочки тампонов и тупферов, микроосколки кератома, форменные элементы крови [101, 129]. Дебрис встречается в 2.6-40.0% случаев [94].

    Ismail M. (2001) с помощью конфокальной микроскопии предположил, что дебрис представляет собой жирные включения, попавшие в зону абляции с лезвия микрокератома. Автор провел эксперимент, показавший отсутствие дебриса после обработки лезвий кератома с помощью ацетона или спирта. Исследователь считает, что такой способ является профилактикой ДЛК [90]. Существуют противоположные точки зрения. При анализе результатов 12500 операций LASIK Першин К.Б. и соавт. (2001) не обнаружили связи ДЛК с LASIK [48]. Javaloy J. et al. (2006) изучили качество среза лоскута и наличие дебриса после применения одноразовых и многоразовых головок для микрокератома Moria и не обнаружили различий [138].

    Одной из основных функций конфокальной микроскопии является визуализация, качественный и количественный анализ эндотелиальных клеток роговицы.

    В конце 90х годов появился ряд работ, посвященных изучению влияния эксимерлазерной абляции на эндотелий.

    Так, Perez-Santonja J. et al. (1997) изучили плотность, форму и размер эндотелиоцитов в центральной зоне роговицы с помощью зеркальной микроскопии и выявили, что плотность эндотелиальных клеток (ПЭК) не только не уменьшается после операции, но даже становится несколько большей, что сопровождается сохранением нормальной гексагональной формы клеток и их размера. Авторы объясняют это тем, что пациенты перестали носить контактные линзы после хирургической коррекции аметропии [188].

    Pallikaris I. et al. (1997) определили уменьшение ПЭК в течение первого года после LASIK, но не более чем на 10% [181, 183].

    Другие исследователи не выявили достоверных изменений эндотелиоцитов после эксимерлазерных операций [125, 144].

    С появлением в рефракционной хирургии инфракрасных фемтосекундных лазеров с λ>1500нм снова встал вопрос о безопасности воздействия лазерной энергии.

    Сравнительное исследование безопасности механического микрокератома и фемтосекундного лазера для выкраивания лоскута роговицы, проведенное Klingler K. et al. (2012), еще раз подтвердило отсутствие влияния эксимерного излучения на эндотелий. Один из выводов гласил, что роговицы лиц, перенесших операцию LASIK, можно использовать для эндотелиальной кератопластики [146].

    Таким образом, анализ данных литературы показал, что, несмотря на бурное развитие, высокую эффективность, предсказуемость и безопасность операции LASIK изучение ее отдаленных результатов является актуальной задачей. Прежде всего, это связано с необходимостью оценки стабильности результатов коррекции в разные сроки после вмешательства у пациентов с различными исходными степенями миопии, так как публикации на эту тему малочисленны и срок наблюдения в них не высок. Вместе с тем, оценка рефракционного регресса и функциональных исходов LASIK может помочь в прогнозировании отдаленных результатов в зависимости от исходной степени миопии.

    Бурное развитие диагностических методов перед рефракционными операциями позволяет все более прецизионно измерять параметры роговицы, в частности, ее толщину. Однако широкий парк доступного оборудования с одними и теми же функциями, но разными принципами действия, обуславливает актуальность поиска наиболее точных методов.

    На сегодняшний день все большее распространение получает конфокальная микроскопия роговицы, которая позволяет проводить прижизненную оценку ультраструктуры роговицы. Представляется перспективным выполнение данной диагностической методики, являющейся аналогом гистологического исследования, у пациентов в отдаленные сроки после операции LASIK. Применение конфокальной микроскопии позволит более детально судить об изменениях морфологии роговицы после LASIK, что представляет значительный научно-практический интерес. Оптимизация методики с целью снижения риска эрозии и ее использование для исследования роговицы в ранние и отдаленные сроки после LASIK является актуальной задачей