1.6 Кросслинкинг роговичного коллагена. История вопроса. Механизм действия

    История кросслинкинга начинается с идеи использования его в качестве консервативного метода лечения кератоконуса. В 90-ых годах у группы исследователей Дрезденского Технического Университета встала задача достичь стабилизации процесса с целью максимальной отсрочки сквозной кератопластики [133].

    Основанием для проведения исследований в этой области послужила серия работ, посвященных эффекту «склеивания» фибрилл коллагена с образованием димеров из двух α-цепей под влиянием различных внешних факторов: ферментов, озона, ультрафиолетового излучения и т.д.

    Данный эффект является результатом окислительного механизма, сопровождающегося высвобождением различных свободных радикалов. Оказалось, что в отличие от других способов индукции «склеивания», ультрафиолетовое излучение стимулирует образование синглетного кислорода, не вызывающего, в отличие от гидроксильного радикала, сопутствующей деградации CNBr белков коллагена [102]. Кроме того, была подтверждена способность ультрафиолетового излучения стимулировать продукцию матричных металлопротеиназ [118].

    Первые исследования в офтальмологии были начаты в 1990 году попыткой оценить возможность биологического окислительного «склеивания» роговичного коллагена под воздействием энзимов, тепла или излучения определенной длины волны, что приводило бы к повышению резистентности стромального коллагена [111]. Известно, что похожий механизм уплотнения и утолщения приблизительно на 4,5% коллагеновых волокон сопровождает «старение» роговицы, а также имеет место при сахарном диабете и связан с активацией гликозилирования в молекулах тропоколлагена [97, 102]. Механизм индукции «склеивания» коллагена при сахарном диабете включает каскад биохимических окислительных реакций, отражающих неферментативное гликозилирование [133]. Феномен повышения диаметра волокон коллагена может быть продемонстрирован с помощью сканирующей электронной микроскопии в стекловидном теле у больных сахарным диабетом [147]. Подобный процесс лежит в основе снижения эластичности стенок сосудов и развития микроангиопатии у пациентов этой категории [133].

    В результате серии работ была разработана наиболее эффективная и безопасная техника кросслинкинга роговичного коллагена, основанная на эффекте фотополимеризации стромальных волокон под воздействием фоточувствительной субстанции (раствор рибофлавина) и низких доз ультрафиолетового излучения твердотельного UVA – источника [145, 148]. Было доказано, что под влиянием ультрафиолетового излучения и рибофлавина происходит усиление поперечных внутримолекулярных связей роговичного коллагена с образованием димеров из двух α-цепей без деградации коллагеновых белков [102].

    Идея разработки клинического метода заключалась во временном приостановлении прогрессирования кератоконуса в рефракционной фазе за счет «склеивания» коллагеновых фибрилл и повышения биомеханической стабильности роговицы. Для использования в клинической практике был разработан прибор с твердотельным ультрафиолетовым источником, имеющий два наконечника и кнопку регулировки мощности, который в настоящее время нашел широкое применение в клинической практике.

    Общепризнанным является протокол, предложенный доктором Seiler T. и коллегами, включающий удаление эпителия в центральной 7-миллимитровой зоне, инстилляции 0,1% раствора рибофлавина в течении 30 -ти минут с последующим воздействием УФ с длиной волны 370 мкм и энергией излучения 3,0 МВт/см² [145, 146].

    Перед процедурой кросслинкинга проводится местная анестезия. Шпателем удаляется роговичный эпителий в пределах предварительно отмеченной окружности диаметром 7 мм. Затем пациенту закапывают 2-4 капли раствора, содержащего 0,1% рибофлавин, 20% декстран и анестетик. Луч ультрафиолетового излучения с длиной волны 365 нм фокусируется на вершине роговицы. Воздействие производится в течение 30 минут, мощность излучения на поверхности роговицы - 3 МВт/см² (5,4 Дж/ см²). Инстилляции раствора рибофлавина с последующим воздействием ультрафиолетового излучения повторяют 5 раз (общее время экспозиции - 25 минут, время процедуры в целом -30 минут), после чего роговицу промывают физиологическим раствором, закапывают антибиотик и надевают мягкую контактную линзу. В послеоперационном периоде больному назначают противоотечную и противовоспалительную терапию. На 5 день после полной эпителизации роговицы снимают контактную линзу и назначают инстилляции кортикостероидов и антибиотиков в течение 20 дней.

    До внедрения новой методики в клиническую практику было проведено множество экспериментальных работ, доказавших ее эффективность и безопасность.

    Wollensak и соавт. в 2004 году с помощью электронной микроскопии подтвердили факт «склеивания» фибрилл и утолщения коллагеновых волокон в роговице под воздействием рибофлавина и ультрафиолетового излучения, что приводило к повышению биомеханической устойчивости ткани. В передних отделах стромы диаметр коллагеновых волокон достоверно повышался на 12,2% (3,64 нм), в задних отделах стромы диаметр волокон увеличивался лишь на 4,6% (1,63 нм). Выявленные изменения оказываются значительно ниже критического порога толщины волокон, приводящего к помутнению роговицы [147].

    В экспериментах было доказано значительное повышение устойчивости ткани роговицы кроликов к механическому воздействию после процедуры кросслинкинга [136]. В другой серии работ в результате экспериментально индуцированного кросслинкинга роговичного коллагена ригидность человеческой роговицы возросла приблизительно на 300%, роговицы свиней – на 75% [148]. Повышение биомеханической ригидности ткани авторы связывают с фактом «склеивания» фибрилл и увеличения толщины коллагеновых волокон [143, 149, 152].

    Экспериментальные исследования подтвердили двукратное повышение устойчивости роговицы после комбинированного воздействия рибофлавина и ультрафиолетового излучения к действию ферментов: пепсина, трипсина и коллагеназы. Стабилизирующий биохимический эффект кросслинкинга может быть объяснен изменением третичной структуры коллагеновых фибрилл и блокированием специфических участков, взаимодействующих с ферментами. Данный факт объясняет эффективность метода в лечении язвы роговицы, а также частично обуславливает остановку прогрессирования кератоконуса, в патогенезе которого также играет роль повышенная активность коллагеназы. Подобный эффект повышения устойчивости ткани к коллагеназной биодеградации в результате процедуры кросслинкинга широко используется в современных биотехнологиях изготовления различных имплантов на основе коллагена [139].

    Помимо биомеханического и биохимического эффекта, процедура кросслинкинга роговичного коллагена ведет к формированию повышенной устойчивости роговицы к термическому воздействию. Денатурация коллагена с разрушением ковалентных связей между молекулами в роговицах, подвергшихся комбинированному воздействию UVA и рибофлавина, происходила при более высокой температуре, чем в контроле [90, 137].

    Во всех проведенных исследованиях эффект кросслинкинга оказался максимальным в передних отделах стромы толщиной не более 300 мкм. Это связано с высокой степенью абсорбции излучения в присутствии рибофлавина и поглощением до 95% излучения на уровне передних и средних слоев стромы.

    Данный факт объясняет преимущественно переднюю локализацию зоны утолщения коллагеновых волокон, асимметрию между передними и задними отделами стромы относительно устойчивости к ферментному, механическому и термическому воздействию, а также обуславливает минимальную степень воздействия ультрафиолетового излучения на эндотелий роговицы, хрусталик и другие структуры глаза [84, 93, 119, 121, 128, 137, 147]. Следует учитывать, что именно передние отделы стромы роговицы наиболее важны для поддержания кривизны роговицы и формирования оптического эффекта процедуры [122]. Для подтверждения безопасности процедуры для подлежащих структур была проведена дополнительная серия экспериментальных работ [151].

    Специфический цитотоксический эффект на эндотелий роговицы отмечался при интенсивности ультрафиолетового излучения на уровне эндотелия 0,65 Дж/см² (0,36 МВт/см²), что вдвое превышает мощность при терапевтических параметрах излучения (0,32 Дж/см²; 0,18 МВт/см²). Зная коэффициент абсорбции излучения в ткани человеческой роговицы в присутствии рибофлавина, было рассчитано, что при стандартной терапевтической мощности излучения (3 МВт/см²) на поверхности роговицы толщиной более 400 мкм, энергия на уровне глубоких слоев роговицы безопасна для эндотелия. Однако, в случаях язвы роговицы, развитого кератоконуса с выраженным истончением роговицы стандартная доза воздействия оказывается токсичной для эндотелиальных клеток. В таких случаях рекомендуется использовать альтернативные способы лечения или снижать мощность излучения. По мнению исследователей, у пациентов с кератоконусом и локальным истончением роговицы на ограниченном участке возможно использование стандартных доз излучения, так как локальная потеря эндотелиальных клеток компенсируется путем миграции с соседних участков [146].

    G.Wollensak и соавторы в эксперименте показали, что УФ излучение с длиной волны 370нм, используемое при проведении кросслинкинга, обладает повреждающим эффектом на клетки роговицы [150]. Во время исследований на кроликах после кросслинкинга авторы отметили гибель кератоцитов на глубине до 350 мкм, а через 6 месяцев их популяция полностью восстанавливалась. Клетки эндотелия роговицы имеют низкую регенеративную способность и их повреждение во время операции недопустимо[146]. E. Spoerl определил, что строма роговицы, пропитанная рибофлавином, поглощает 95% УФ излучения, в то время как в отсутствии рибофлавина данный показатель составляет лишь 32%. Таким образом, рибофлавин обладает защитным эффектом по отношении к эндотелию роговицы и остальным структурам глаза[138].

    К. Rocha с соавторами (2011) была предложена методика «Flash-linking», в которой предлагался новый сшивающий агент поливинилпиролидон вместо рибофлавина и время УФ облучения составляло всего 30 секунд при 4,2 мВт/см² [129]. Проведя измерения прочностных свойств роговицы с использованием эластометрии на свиных глаз ex vivo, авторы метода предположили, что «Flash linking» и стандартный кросслинкинг (КРК) могут иметь сопоставимый эффект [39, 98, 101].

    С помощью конфокальной биомикроскопии было выявлено разрежение кератоцитов в передних отделах стромы роговицы, что свидетельствует об их апоптозе и последующем некрозе под воздействием ультрафиолетового излучения заданной мощности [1, 94]. Степень гибели кератоцитов зависела от интенсивности ультрафиолетового излучения. При стандартных терапевтических дозах облучения в роговице человека гибель кератоцитов отмечалась в пределах передних отделов стромы толщиной около 300 мкм. Постепенное восстановление популяции клеток происходило в течение 3 месяцев за счет миграции из зоны неповрежденной роговицы [150].

    Кроме того, в первые дни после процедуры было обнаружено исчезновение субэпителиальных нервов. Однако, полная реиннервация роговицы с восстановлением ее чувствительности отмечалась уже через 1 месяц [150].

    Ни в одном эксперименте не было выявлено помутнения роговицы, хрусталика или признаков воспалительной реакции в глазах животных после комбинированного воздействия рибофлавина и ультрафиолетового облучения [136, 139, 147, 148]. Дегенеративный эффект излучения подтверждается отсутствием воспалительной реакции в ткани роговицы. К настоящему времени в мировой практике накоплен достаточно большой опыт клинического применения метода кросслинкинга роговичного коллагена, подтверждающий эффективность и безопасность процедуры для приостановления прогрессирования кератоконуса и повышения остроты зрения.

    Единственным побочным эффектом процедуры явился кратковременный отек ткани роговицы. Данный эффект отмечался приблизительно в 40% случаев, сопровождаясь транзиторным повышением среднего сферического коэффициента рефракции [89, 131].

    В течение 4-х летнего периода наблюдения за пролеченными пациентами не было отмечено изменения прозрачности роговицы и хрусталика, плотности эндотелиальных клеток, изменений внутриглазного давления, поражения сетчатки по данным оптической когерентной томографии. В большинстве случаев не потребовалось проведения повторных процедур [85, 87, 131, 145].

    Таким образом, многочисленные экспериментальные и клинические исследования показали эффективность и безопасность процедуры рибофлавин-UVA-индуцированного кросслинкинга роговичного коллагена. Возможные сферы клинического применения процедуры кросслинкинга роговичного коллагена касаются профилактики прогрессии миопии и развития ятрогенной кератэктазии после рефракционной хирургии.

    Имеются сообщения об успешном использовании процедуры кросслинкинга у пациентов с ятрогенной кератэктазией после операции Lasik. С помощью данной методики удалось повысить биомеханическую прочность роговицы и остановить прогрессирование данного осложнения [112].

    В последнее время появились сообщения об успешном использовании метода в клинике при лечении больных с язвой роговицы за счет выраженного антимикробного действия. Данный метод лечения был эффективен в отношении золотистого стафилококка, пневмококка с множественной лекарственной устойчивостью и Candida Albicans [73,139].

    Не исключено, что кросслинкинг склерального коллагена станет эффективной методикой повышения ригидности склеры с целью лечения прогрессирующей миопии.

    Имеются единичные данные об использовании кросслинкинга после послойной кератопластики при рецидивирующем герпетическом кератите. Авторы отмечают противовирусный эффект кросслинкинга при отсутствии влияния на эпителизацию и адаптацию трансплантата [39]. Авторами изучены особенности морфологической характеристики роговичной ткани после послойной кератопластики в комбинации с кросслинкингом коллагена роговицы в эксперименте на глазах кроликов. Показано, что под влиянием кросслинкинга происходит преобразование фиброцеллюлярной ткани в полноценную строму с нормальными оптическими свойствами; интерфейс-пространство при проведении послойной кератопластики в комбинации с кросслинкингом становится практически невидимым уже с первого месяца в отличие от послойной кератопластики [39].

    Анализ данных литературы показал, что описанная выше методика кросслинкинг позволяет усилить прочностные свойства роговицы, что делает ее возможной для использования в качестве одного из этапов в подготовке донорского материала для последующей кератопластики. Однако, остаются не изучены биофизические, биомеханические и биохимические свойства роговичной консервированной ткани, а также возможность и эффективность применения кератопластики с использованием кросслинкинг модифицированного донорского материла у пациентов с глубокими язвами роговицы для снижения риска расплавления трансплантата. В связи с этим закономерной и логичной с методологической точки зрения явилась предпринятая попытка научного обоснования эффективности обработки донорского материала по методу кросслинкинг для последующей кератопластики у пациентов с глубокими язвами роговицы.