Таблица 1 – Дизайн исследования in vitro
Таблица 2 – Микрохирургический инструментарий для выделения РПЭ
На данном этапе проводилось выделение РПЭ от кроликов доноров-трупов, его культивирование с последующим конструированием 3D клеточных сфероидов. В ниже приведенных таблицах 2 и 3 представлены микрохирургический инструментарий, использованный для выделения РПЭ, а также перечень лабораторного оборудования, используемого при выполнении этапов работ in vitro.
Для иммуноцитохимического исследования отдельно формировали 2D (плоскостные) и 3D (объемные) культуры РПЭ. Оценивали экспрессию характерных эпителиальных маркеров, таких как: RPE-65 (высокоспецифичный маркер пигментного эпителия сетчатки), ZO-1 (белок запирающих межклеточных контактов), цитокератин 8, 18 (белки промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток), а также мезенхимального маркера виментина. Также на данном этапе оценивали морфологические особенности 2D и 3D культур, диаметр и форму полученных 3D сфероидов РПЭ, и их адгезивные способности. В нижеприведенной таблице 4 представлены реактивы, использованные на этапе исследования in vitro для культивирования и фенотипической идентификации клеточных культур РПЭ.
Помимо этого, была отработана методика проведения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) 3D сфероидов РПЭ и проведена оценка жизнеспособности полученных трехмерных клеточных культур после краткосрочной гипотермической консервации.
Все этапы исследований серии in vivo проводились на базе Калужского филиала ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России под руководством заместителя директора по научной работе, к.м.н. Трифаненковой И.Г., и при непосредственном участии заведующего операционным блоком, к.м.н. Плахотнего М.А. и заведующей диагностическим отделением №2, к.м.н. Ерохиной Е.В.
В данной серии экспериментов проводили оперативное вмешательство кроликам (n=30) по разработанной методике, описанной в разделе 4.1. Животные были разделены на 3 равные группы – 2 опытные и 1 контрольную. Кроликам из 1-й опытной группы субретинально вводили 81 сфероид, из 2-й опытной группы – 162 сфероида. Животным из контрольной группы субретинально инъецировали 50 мкл физиологического раствора. Для послеоперационного контроля всем экспериментальным животным после оперативного вмешательства проводилась биомикроскопия, офтальмоскопия, фоторегистрация глазного дна, УЗ В-сканирование внутриглазных оболочек, ЭРГ и ОКТ сетчатки. В нижеприведенных таблицах 5 и 6 представлены оборудование и расходные материалы, использованные для оперативного вмешательства, а также методы для послеоперационного наблюдения за кроликами и сроки наблюдения. Далее животные выводились из эксперимента, глазные яблоки энуклеировались для последующего гистологического исследования, проводившегося на базе Лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России под руководством заведующей лабораторией, к.м.н.Шацких А.В.
