2.1. Экспериментальная часть. Применение ПЭРГ в лечении эпителиальных дефектов роговицы кроликов

     После успешного прохождения технических испытаний (акт № 470.15.0484.Т от 18.09.2015г.) и токсикологической экспертизы (заключение № 469.15.0484.Р.14 от 28.08.2015г.) медицинского изделия «ПЭРГ», для оценки эффективности и безопасности медицинского изделия при эпителиальных дефектах роговицы на первом этапе были инициированы экспериментальные исследования на животных.

    2.1.1. Материалы и методы экспериментальной части

    Исследование проводили на 13 кроликах породы Шиншилла, на одном глазу которых создавали модель щелочного ожога роговицы методом Обенбергера [161]. Эта модель широко используется для исследования репаративных процессов роговичного эпителия, поскольку процессы, развивающиеся после щелочного ожога роговицы у кроликов, включают все компоненты, имеющие место при повреждении глаза у человека. Щелочной ожог III степени вызывали аппликацией фильтровальной бумаги в виде круга диаметром8 мм, смоченного2,5% раствором гидроксида натрия с экспозицией 10 секунд на роговицу (рис. 1б). Предварительно перед моделированием ожога животных усыпляли препаратом Золетил ® 100 (ВИРБАК, Франция) и обезболивали глаза Инокаином (Sentiss, Индия). Парный глаз у кроликов оставляли интактными (рис. 1а) для изучения и сравнения при морфологическом исследовании.

    В экспериментальной группе(6 кроликов, 6 глаз) лечение проводили ПЭРГ с аппликацией 2 раза в день до полной эпителизации. В контрольной группе (6 кроликов, 6 глаз) закладывали гель декспантенола 5% (корнерегель, Baush&Lomb, США) 2 раза в день до полной эпителизации(таблица 2). У 13-го кролика глаз с моделью ожога оставляли без лечения для изучения регенерации в условиях отсутствия терапии.

    Клинические методы:

    • клиническое исследование роговицы

    • окрашивание флюоресцеином

    • определение индекса поражения роговицы

    • фотографирование

    Изучаемые явления:

    • клиническое исследование роговицы: оценка прозрачности роговицы, изменений в строме и эпителии роговицы, бульбарной конъюнктивы, размер эпителиального дефекта, наличие отделяемого, инъекция сосудов и др., симптомов раздражения конъюнктивы

    • окраска флюоресцеином: количество и характер прокрашиваемых зон

    • определение индекса поражения роговицы

    Морфологический метод:

    • изучение гистологических срезов роговицы энуклиированных глаз с окраской гематоксилин-эозином методом световой микроскопии

    Изучаемые явления:

    • явления отёчности и воспалительной инфильтрации

    • структура эпителия роговицы

    • структурные особенности стромы роговицы

    Оценка токсичности ПЭРГ проводилась на основании наличия и интенсивности следующих симптомов: гиперемия и отёчность конъюнктивы, инъекция сосудов, хемоз, интенсивность слезотечения и светобоязни.

    Критериями эффективности в группе исследования явились: оценка скорости эпителизации, динамика индекса поражения роговицы, динамика симптомов раздражения, отсутствие окрашивания.

    Кратность обследования – ежедневное наблюдение и обследование в течение4-х недель.

    Животных выводили из эксперимента на 28-е сутки путем декапитации с предварительной анестезией. Затем проводили энуклеацию глазного яблока, роговицу фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, тщательно промывали, обезвоживали в спиртах с экспозицией по40 минут и в парафинах по 24 часа, после чего проводили заливку в парафин. Полученные на микрокератоме срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Изучение гистологических срезов проводили методом световой микроскопии с использованием микроскопа Leica DM 1000 (Leica Microsystems, Германия).