2.1. I этап – Исследование влияния rhBMP-2 на культуру клеток in vitro

    Метод получения первичной культуры кератоцитов роговицы кролика Роговица вырезалась из глаза без захвата лимбальной зоны, десцеметова мембрана с эндотелием отделялась физически с помощью пинцета, эпителий соскабливался с помощью скребка. Оставшаяся строма нарезалась с помощью ножниц на кусочки ∼ 1-1,5 мм² , которые в виде суспензии в культуральной среде RPMI-1640 (ООО НПП «ПанЭко», Россия), 10% фетальной бычьей сыворотки (ООО НПП «ПанЭко», Россия) помещались на поверхность жидкого коллагена, нанесенного тонким слоем на дно культуральной посуды. В результате происходило гелеобразование вокруг кусочков стромы роговицы, и последние оказывались «впаянными» в коллагеновый гель. Это значительно увеличивало площадь контакта ткани с коллагеновым гелем и ускоряло выход клеток из ткани.

    Вышедшие из кусочков стромы клетки снимали с поверхности коллагенового геля с помощью стандартной методики трипсинизации и использовали для эксперимента.

    Оценка влияния препарата rhBMP-2 на жизнеспособность и пролиферативную активность культуры кератоцитов

    Для оценки влияния препарата rhBMP-2 производства ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России на жизнеспособность и пролиферативную активность культуры кератоцитов клетки рассевали в лунки 96-луночного планшета в количестве 6 тысяч клеток/лунку и культивировали 24 ч в культуральной среде, содержащей 10%-ную фетальную бычью сыворотку. Затем среду отбирали и вносили свежую, содержащую препарат rhBMP-2 в концентрациях 5, 10 и 30 мкг/мл. Испытано два варианта культуральной среды, содержащей препарат rhBMP-2, – с содержанием сыворотки 10% и 1%.

    Контрольные варианты не содержали препарат rhBMP-2. Каждый вариант испытывали в трех повторах. Через 2 суток оценивали жизнеспособность культуры окрашиванием флуоресцентными красителями Хехст 33342 (ядра всех клеток) и пропидий йодид (мертвые клетки), а также пролиферативную активность при помощи МТТ-теста. Для этого в культуральную среду добавляли реагент МТТ (SigmaAldrich, США) в концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали в течение 4 часов. Затем среду отбирали, промывали 2x раствором фосфатного буфера и экстрагировали кристаллы формазана из клеток при помощи ДМСО (диметилсульфоксид) производства (ООО НПП «ПанЭко», Россия). Экстракты измеряли при помощи планшетного фотометра (Multiskan FC, США) при длине волны 492 нм. Чем больше клеток в лунке, тем больше кристаллов формазана образуется.

    Оценка влияния препарата rhBMP-2 на миграцию кератоцитов (метод царапины)

    Клетки высевали в лунки 96-луночного планшета (Techno Plastic Products AG, Швейцария) и культивировали до достижения ими конфлюэнтного монослоя. Затем наконечником автоматической пипетки (Techno Plastic Products AG, Швейцария) делали царапину в монослое, создавая тем самым брешь размером ∼ 1 мм. Культуральную среду заменяли на среду с низким содержанием фетальной сыворотки (1%) (Gibco, США), в опытные лунки добавляли препарат rhBMP-2 в концентрации 30 мкг/мл. Спустя 2 суток оценивали заполнение бреши клетками визуально при помощи оптической микроскопии на микроскопе (Olympus CX43, Япония).