Таблица 1 – Срок культивирования ретинального пигментного эпителия
Таблица 2 – Перечень используемых первичных антител
2.1.1. Характеристика донорского материала трупа для создания модели 2 D ретинального пигментного эпителия
В качестве первичного источника клеток РПЭ использовали глазные яблоки доноров-трупов без роговично-склеральных дисков, удаленных для целей трансплантации роговицы в Глазном тканевом банке ФГАУ «НМИЦ «МНТК «МГ» им. акад. С.Н. Федорова» г. Москва (заведующая Глазным тканевым банком к.м.н. Хубецова М.Х.), согласно разрешению на применение медицинской технологии ФС от 24 июня 2010 года № 2010/243 «Алгоритм заготовки трупных роговиц человека для трансплантации» и Лицензии Учреждения Федеральной государственной службы по надзору за Здравоохранением от 30.04.2008 № 99-01-005317 и от 18.02.2013 № ФС-99-01-008251 на вид медицинской деятельности по забору и заготовки трупных органов и тканей человека для трансплантации.
После удаления роговично-склеральных дисков передавались глазные яблоки доноров-трупов в ЦМБП МНТК «МГ» (заведующий ЦМБП – профессор С.А. Борзенок). Экспериментальные исследования на тканях, выделенных из трупных человеческих глаз, проводились в соответствии с официально принятыми процедурами и специальным разрешением в рамках законодательства РФ. Глазной тканевой банк МНТК «МГ» получает трупные человеческие глаза из танатологических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента Здравоохранения города Москвы. Лицензия на данный вид медицинской деятельности позволяет использовать ткани, выделенные из трупных человеческих глаз для целей трансплантации и научных исследований. В связи с установленным режимом работы в Глазном тканевом банке и Лаборатории клеточных технологий ЦМБП МНТК «МГ», к глазным яблокам доноров-трупов предъявляли требования инфекционной безопасности согласно СанПин [6]. Глазные яблоки доноров-трупов поступали в Глазной тканевой банк МНТК «МГ» из танатологических отделений Бюро судебномедицинской экспертизы, согласно действующему договору. Перед выкраиванием роговично-лимбальных дисков проводилась серологическая диагностика доноров-трупов на инфицированность вирусами ВИЧ I/II, гепатитов В и С, сифилиса, как наиболее опасных возбудителей заболеваний, представляющих потенциальную угрозу для персонала. Клинико-лабораторная диагностика указанных инфекций проводилась в клинической лаборатории МНТК «МГ» по образцам крови, поставляемым вместе с тканями глазных яблок доноров-трупов.
2.1.2. Выделение и клеточное 2D культивирование ретинального пигментного эпителия
Для выделения РПЭ в опытной группе было использовано 5 глазных яблок от 5 доноров показатели адреналиновой пробы С.А. Борзенка – Проба А. Из кадаверных глаз производили выделение клеток РПЭ сетчатки по оригинальной методике предложенной Борзенком С.А. и Поповым И.А. с соавторами (патент РФ на изобретение № 2569481 от 25.12.2014 «Способ получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия из глаза взрослого донора-трупа»). Так как данная техника обеспечивает выделение РПЭ почти в чистом виде, без примесей других клеточных структур. Глазное яблоко, соответствующее критериям описанных в главе 2.1.1., полностью погружали в стерильную чашку Петри (10 см) (Corning, США), наполненную DMEM/F12 (Sigma Aldrich, Канада), нагретым в инкубаторе до 37°С, в качестве иммерсионной среды. Склеру рассекали спереди назад тремя меридиональными разрезами длиной 2/3 длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением трех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибали, и со стороны супрахориоидального пространства пересекали вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склеру удаляли из операционного поля. Далее наносили три разреза ХПК – первый круговой разрез – на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез – в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез – на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяли от нейральной сетчатки пинцетом и укладывали на дно стерильной чашки Петри в положении «клетками РПЭ вверх», заливали двумя мл смеси раствора 0,25% трипсина-ЭДТА и раствора Версена (ПанЭко, Россия) в соотношении 1:1 по объему, инкубировали в стандартных условиях (37°С, 5% CO2 ) в течение 20 минут. По окончании инкубации в чашку Петри для нейтрализации ферментативной смеси добавляли 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (HyClone, TermoFisherScientific, США) и отделяли клетки РПЭ от мембраны Бруха гидродинамически многократным промыванием струей стерильного фосфатно-солевого буфера под напором из шприца. Полученную суспензию клеток РПЭ переносили в центрифужную пробирку 15 мл (Corning, США).
Суспензию клеток центрифугировали в режиме 1800 об/мин в течение 5 мин (центрифуга SL-40 R, Thermo Scientific, Германия). Надосадочную жидкость удаляли, а осадок разбавляли 2 мл питательной среды на основе полной ростовой среды Игла в модификации Дульбекко и среды Хэма F12 (DMEM/F12, Sigma, США) в соотношении 1:1 по объему с L-глутамином (DMEM/F12; 89% об.) (TermoFisherScientific, США) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Fetal bovine serum, FBS; 10 % об.) (HyClone, TermoFisherScientific, США), смеси антибиотиков (1,0 % об.) (пеницилин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл) (Sigma Aldrich, Канада).
Далее осуществлялся забор 10 мкл жидкости с культурой РПЭ и проводили подсчет клеток при помощи автоматического счетчика клеток Luna II (Logos biosystems, Корея). Отмеряли количество суспензии, содержащее 0,3х106 клеток РПЭ и переносили в чашку Петри (35 мм) (SPL, Корея), поверхность которой была предварительно смочена FBS. Чашку Петри накрывали крышкой и инкубировали в стандартных условиях. Первую смену питательной среды проводили спустя 10 дней культивирования, далее – каждые 3-4 дня. Таким образом получали первичную клеточную культуру т.н. нулевого пассажа - P0.
По достижении 80%-й конфлюентности культурального матраса питательную среду аспирировали и клетки РПЭ ферментативно дезагрегировали раствором 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 5 минут. Далее к суспензии клеток добавляли 1 мл питательной среды, клетки переносили в пробирку объемом 10 мл и центрифугировали в течение 5 минут (1100 об./мин.). Затем из пробирки удаляли надосадочную жидкость, клетки разбавляли 3 мл питательной среды. Полученную смесь рассаживали на 3 культуральных матраса, в каждый матрас добавляли 4 мл питательной среды, таким образом получали культуру клеток РПЭ 1-го пассажа – Р1.
Подобным образом производили рост клеток до 3-го и 5 -го пассажей (культура Р3, P5).
Полученные 2D культуры на Р1, Р3, Р5 использовали для проведения иммуноцитохимического исследования. Сроки культивирования РПЭ представлены в таблице 1.
2.1.3. Иммуноцитохимическое исследование 2D культуры клеток РПЭ
Таблица 3 – Перечень используемых вторичных антител
Таблица 4 – Перечень используемых первичных антител
Для анализа 2D клеточных культур первого, третьего, пятого пассажей (Р1, Р3, Р5) изучали экспрессию характерных маркеров ретинального пигментного эпителия (ZO-1, RPE65) [100, 138], а также, характерных молекул, определяющих мезенхимальный фенотип: белков цитоскелета (виментин); факторов сигнальной трансдукции и транскрипции (Snail1, Snail2 (Slug)), маркера миофиробластов (α-гладкомышечный актин). Появление молекул, определяющих мезенхимальный фенотип, указывает на феномен ЭМТ [5].
С этой целью использовали специальные 4-х или 8-ми луночные слайд-флаконы (SPL, Корея), в каждую лунку которого добавляли суспензию клеток, полученную согласно протоколам, описанным выше, в концентрации 5х103 с добавлением 0,8 мл соответствующей полной питательной среды.
Культивирование проводили в течение 5 суток при стандартных условиях. Протокол проведения иммуноцитохимического анализа для 2D клеточных культур на Р1, Р3, Р5 был одинаков и включал в себя следующие этапы:
1. Фиксация клеточных культур.
Для этого фиксаж проводили в 10% растворе формалина (pH-7.4) (PanReac AppliChem, Германия) в течение 10 минут при комнатной температуре. Фиксатор отмывали 3 раза по 5 мин холодным раствором (+4°С) фосфатно-солевого буфера (pH-7.4) (ПанЭко, Россия).
2. Пермеабилизация клеток.
Пермеабилизацию проводили 0,25% раствором Triton-X100 (PanReac AppliChem, Германия) в фосфатносолевом буфере в течение 10 минут. Далее клетки отмывали 3 раза по 5 минут раствором фосфатно-солевого буфера (pH-7.4). Для уменьшения неспецифического связывания антител производили обработку образцов раствором фосфатно-солевого буфера с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Tween 20 (PanReac AppliChem, Германия).
3. Окраска первичными антителами.
Образцы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре используя первичные антитела, разведенные в фосфатно-солевом буфере с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Tween 20, концентрация антител представлена в таблице 2. По истечению времени тщательно отмывали образцы раствором фосфатно-солевого буфера (pH7.4) 3 раза по 5 мин при комнатной температуре.
4. Окраска вторично-меченными антителами.
Для определения первичных антител использовали вторичные антитела, коньюгированые с флуорохромными красителями, разведенными в фосфатно-солевом буфере (pH-7.4) с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Tween 20, инкубировали в течение 1 часа, концентрация антител представлена в таблице 3. Вторичные антитела отмывали 3 раза по 5 м ин раствором фосфатно-солевого буфера (pH-7.4).
5. Контрастирование ядер.
Контрастирование проводили бис-бензимидом (Hoechst 33258) (ПанЭко, Россия) 0,1 мг/мл в растворе фосфатно-солевого буфера (pH-7.4), по истечению времени краситель также удалялся раствором фосфатно-солевого буфера (pH-7.4) 3 раза по 5 мин.
6. Заключение препарата под покровное стекло.
Полученные образцы монтировали фиксирующим раствором под покровное стекло, стекла хранились при t+4°С не более 2-х дней с момента окраски до момента анализа.
Исследование производили на инвертированном лазерносканирующем конфокальном микроскопе FLUOVIEW FV10i (OLYMPUS Corporation, Япония).
Полученные снимки анализировали, используя программное обеспечение «CellProfiler», которое позволяет выделять необходимые для анализа клеточные компоненты, а именно ядро, цитоплазму или клетку (ядро + цитоплазма), и рассчитать интенсивность свечения каждой клетки, используя встроенные инструменты программного обеспечения.
2.1.4. Иммуногистохимическое исследование образцов удаленных с помощью хирургического лечения идиопатических эпиретинальных мембран
Данная часть работы посвящена изучению процесса ЭМТ в иЭРМ, располагающихся в области витреомакулярного интерфейса, а также изучению закономерностей и степени прогрессирования фиброзного процесса, выявлению основных морфологических критериев, подтверждающих ремоделирование ткани сетчатки, исследованию уровня адгезии иЭРМ к поверхности сетчатки с помощью иммуногистохимического метода на удаленных образцах мембран у 75 пациентов (75 глаз) на разных стадиях пролиферативного процесса. А также определение корреляции МКОЗ от степени зрелости иЭРМ. Для этого проводили выявление маркеров ЭМТ, к которым относят виментин, α-SM актин, Snail + Slug, определяли уровни экспрессии коллагенов IV и VI типов и уровень маркеров глиальных клеток и гиалоцитов.
2.1.5. Описание и подготовка биологического материала, взятого для иммуногистохимического исследования
Подробно этапы хирургического вмешательства описаны в подразделе 2.4.2. Удаленные ЭРМ и ВПМ с помощью эндовитреального пинцета 705.44 P или 711.44 P Grieshaber Revolution («Alcon Laboratories Inc.» (США)) переносили в стерильные пробирки типа эппендорф (GenFollower, Китай). Данные образцы заливались 2,0 мл 4% параформальдегида (PanReac AppliChem, Германия). Через 4 часа их переносили в стерильные пробирки с 2,0 мл физиологического раствора. Затем мембраны фиксировали на предметном стекле с полилизиновым покрытием (Thermo SCIENTIFIC, USA). Биоптаты мембран отмывали 3 раза по 5 мин холодным раствором (+4°С) фосфатно-солевого буфера (pH-7.4).
Пермеабилизацию мембран проводили 0,25% раствором Triton-X100 в фосфатносолевом буфере в течение 10 минут. Далее образцы отмывали 3 раза по 5 минут раствором фосфатно-солевого буфера (pH-7.4). Для уменьшения неспецифического связывания антител производили обработку образцов раствором фосфатно-солевого буфера с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Tween 20. После чего, образцы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, используя первичные антитела, разведенные в фосфатно-солевом буфере с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Tween 20, концентрация антител представлена в таблице 4.
По истечению времени тщательно отмывали образцы раствором фосфатно-солевого буфера (pH 7.4) 3 раза по 5 мин при комнатной температуре. Для детекции первичных антител использовали вторичные антитела, коньюгированые с флуорохромными красителями, разведенными в фосфатно-солевом буфере (pH-7.4) с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Tween 20, инкубировали в течение 1 часа, концентрация антител представлена в таблице 5.
Вторичные антитела отмывали 3 раза по 5 мин раствором фосфатно-солевого буфера (pH-7.4). Контрастирование ядер проводили бис-бензимидом (Hoechst 33258) 0,1 мг/мл в растворе фосфатно-солевого буфера (pH-7.4), по истечении времени краситель также удалялся раствором фосфатно-солевого буфера (pH-7.4) 3 раза по 5 мин. Полученные образцы монтировали фиксирующим раствором под покровное стекло, стекла хранились при t+4°С не более 2-х дней с момента окраски до момента анализа. Исследование производили на инвертированном лазерносканирующем конфокальном микроскопе FLUOVIEW FV10i (OLYMPUS Corporation, Япония). Полученные снимки анализировали используя программное обеспечение «CellProfiler», которое позволяет выделять необходимые для анализа клеточные компоненты, а именно ядро, цитоплазму или клетку (ядро + цитоплазма), и рассчитать интенсивность свечения каждой клетки, используя встроенные инструменты программного обеспечения.
