2.1 Материал и методы экспериментального исследования

    Экспериментальное исследование основано на изучении ХРК 14-ти глаз 14-ти кроликов после проведения СМЛВ. Лазерному воздействию подвергался 1 глаз каждого кролика, парный (интактный) глаз служил контролем. Все животные -пигментированные кролики породы Шиншилла, возраст около 6 месяцев, вес 4-5 килограммов. Лазерное воздействие осуществлялось после общей внутривенной анестезии животного. Медикаментозный мидриаз опытного глаза достигался однократной инстилляцией растворов тропикамида 1% и фенилэфрина 2,5% за 30 минут до лазерного воздействия. После эпибульбарной анестезии раствором проксиметакаина 0,5% на глаз животного устанавливалась контактная линза Reichel-Mainster 1X. Лазерное вмешательство осуществлялось при помощи стандартной щелевой лампы и лазерных установок "IQ 577" (IRIDEX Corp., США) или "Supra 577.Y" (Quantel Medical, Франция), с длиной волны 577 нм и возможностью работы в микроимпульсном режиме с минимальной скважностью 5%.

    Морфологические исследования проводились для уточнения характера патоморфологических изменений ХРК. С этой целью энуклеированное глазное яблока кролика фиксировали в 10 % нейтральном формалине в течение суток. После фиксации материала проводили макроскопический осмотр объекта исследования. Далее участки глазного яблока, подвергнувшиеся лазерному воздействию, заливались в парафин по традиционной методике. С каждого блока выполняли по 50 срезов толщиной 4-5 мкм, окрашивали их гематоксилин-эозином. Просмотр препаратов и фоторегистрацию осуществляли под микроскопом “Opthon” с телевизионной приставкой при увеличении ×40, ×125, ×400.

    Иммуногистохимический анализ проводили на парафиновых срезах.

    Наличие PEDF в тканях выявляли с помощью мышиных моноклональных антител к PEDF (фирма-производитель «Abcam», [1C4]) и системы визуализации HRP Polymer Detection System Mouse/Rabbit/Rat, (Almabion, Россия).

    Для этого парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. Демаскировку антигенов проводили путем 60-минутного прогревания срезов на водяной бане в предварительно нагретом до 95-99 °С цитратном буфере. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 15-20 минут, и переносили в пирофосфатный буфер на 5 минут. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 20 минут с 3% перекисью водорода, приготовленной на дистиллированной воде, а затем промывали 5 минут в фосфатном буфере. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 15 минут с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с первичными антителами проводили при температуре 37°С в термостате в течение 30 минут. После инкубации стекла промывали дважды по 5 минут в фосфатном буфере.

    Инкубацию со вторичными антителами, входящими в состав системы визуализации, проводили при температуре 37°С в течение 30 минут, затем срезы промывали дважды по 5 минут в пирофосфатном буфере. Для визуализации ИГХ реакции использовали DAB Chromogen из системы визуализации HRP Polymer Detection System Mouse/Rabbit/ (Almabion, Россия). Реакцию проводили в течение 5-10 минут. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в среду заводского приготовления.

    Негативным контролем служила иммуногистохимическая реакция без добавления первичных антител.

    Результаты окрашивания оценивали при световой микроскопии с увеличением х10, х20, х40, на микроскопе «Carl Zeiss» №984557 axiolab E-re (Германия). Для всех маркеров отмечали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана).