2.1 Материал и методы экспериментального исследования

     Исследование основано на сравнительной проспективной рандомизированной с параллельным контролем оценке различных техник заготовки ультратонкого трансплантата для ЗПК. Экспериментальная работа основана на изучении и сравнительной оценке качества поверхности стромы донорской роговицы, сформированной с помощью 2-х различных фемтосекундных лазеров, эксимерного лазера и механического микрокератома методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Также в ходе исследования была проведена оценка воздействия различных методов заготовки ультратонкого трансплантата и аппланации интерфейса ФСЛ на эндотелий донорской роговицы с применением витальных красителей для идентификации и подсчета живых и мертвых клеток.

    2.1.1 Общая характеристика экспериментального материала

    Методом АСМ суммарно было изучено 50 образцов. В первой части работы, посвященной изучению качества поверхности, сформированной с помощью ФСЛ, исследовали 30 образцов. В группу 1 было включено 10 роговичных дисков, полученных при формировании ультратонкого трансплантата с помощью ФСЛ с низкой плотностью энергии с эндотелиального доступа. В группу 2 было включено 10 роговичных дисков, полученных при формировании ультратонкого трансплантата с помощью ФСЛ с высокой плотностью энергии с эндотелиального доступа.

    Группу 3 (Контроль) составили 10 роговичных лоскутов, полученных в ходе заготовки ультратонкого трансплантата для задней послойной кератопластики с помощью механического микрокератома Moria LSK-One (Франция). Сканировали поверхность стромального роговичного диска или лоскута, конгруэнтную поверхности трансплантата для Ф-ЗПК. Во второй части работы по сканированию, посвященной изучению качества поверхности, сформированной с помощью эксимерного лазера, исследовали 20 образцов.

    В 1-ю (основную) группу было включено 10 роговичных лоскутов, полученных в ходе заготовки ультратонкого трансплантата для ЗПК с помощью механического микрокератома Moria LSK-One (Франция) и последующей фотоабляцией поверхности, конгруэнтной трансплантату, в режиме «простая ФТК» на глубину 50 мкм с помощью эксимерного лазера Микроскан 500 (Оптосистемы, РФ).

    Во 2-ю (контрольную) группу было включено 10 роговичных лоскутов, полученных при заготовке ультратонкого трансплантата для ЗПК с помощью механического микрокератома Moria LSK-One (Франция).

    Для исследования влияния метода заготовки трансплантата на ЭК использовали 40 донорских человеческих корнеосклеральных дисков с жизнеспособным эндотелием, отбракованных глазным банком по количеству ЭК (ПЭК<2000). Подсчет осуществили с помощью зеркального микроскопа Konan Eye Bank Kerato Analyzer (Konan Medical Inc., Japan). Было сформировано 4 группы по 5 пар роговиц (каждая пара взята от одного донора).

    Группа 1. Ультратонкие трансплантаты для ЗПК толщиной 130 мкм были выкроены с эндотелиальной поверхности роговицы с помощью ФСЛ с низкой плотностью энергии по описанной выше методике, с той лишь разницей, что сформированный трансплантат не отделяли шпателем от окружающей стромы. Контролем были интактные корнеосклеральные диски тех же доноров, заготовленные, хранившиеся и транспортировавшиеся в тех же условиях.

    Группа 2. Донорские роговицы, на эндотелиальную поверхность которых была выполнена аппланация лазерного интерфейса в течение 30 секунд без формирования среза. Парные интактные корнеосклеральные диски тех же доноров, заготовленные, хранившиеся и транспортировавшиеся в тех же условиях, были использованы в качестве контроля.

    Группа 3. Ультратонкие трансплантаты для ЗПК толщиной 130 мкм были выкроены с эндотелиальной поверхности роговицы с помощью ФСЛ с низкой плотностью энергии по описанной выше методике. Контролем служили ультратонкие трансплантаты для ЗАПК, выкроенные с помощью механического микрокератома Moria Evolution 2 LSK-2 по технологии 2-х срезов.

    Группа 4. В основную группу вошли 5 донорских роговиц, из которых выкроили ультратонкие трансплантаты методом последовательного применения микрокератома (Moria LSK-One или Moria Evolution 2 LSK-2) и эксимерного лазера (Микроскан 500). Контрольная группа состояла из 5 донорских роговиц, полученных из парных глаз тех же доноров, из которых сформировали ультратонкие трансплантаты при помощи методики, то есть благодаря двукратному использованию механического кератома (Moria LSK-One или Moria Evolution 2 LSK-2).

    2.1.2 Характеристика фемтосекундных лазеров

    В основе принципа работы ФСЛ лежит следующий механизм. Лазерное излучение формируется в виде очень коротких импульсов, что позволяет достигать высокого уровня плотности энергии, что приводит к образованию плазменного пучка, который испаряет биологическую ткань с образованием микроскопических пузырьков газа, которые раздвигают окружающие ткани и, сливаясь друг с другом при перемещении фокуса, формируют разрез. В ходе исследования использовали 2 фемтолазерные системы – это «Фемто-Визум» (Оптосистемы, РФ) и «LDV Z8» (Ziemer, Швейцария). ФСЛ «Фемто-Визум» – это первый и пока единственный ФСЛ российского производства. Это полностью волоконный лазер с длиной волны 1030-1040 нм. Частота повторения импульсов – 1 МГц, длительность импульса – 300-400 фемтосекунд (1 фс = 10^-15с), мощность импульса – 0,25-0,9 мкДж, дистанция между импульсами – 2-5 мкм, размер лазерного пятна в фокусе – 2 мкм, размер рабочей зоны – 9,5 мм, глубина воздействия – 80-1200 мкм (шаг 1 мкм). Лазер использует растровый паттерн сканирования и плоский аппланационный интерфейс.

    ФСЛ «Фемто-Визум» имеет алгоритм создания: роговичного лоскута, проведения послойной и сквозной кератопластик, формирования тоннелей для имплантации роговичных сегментов.

    Для формирования плоскостного среза роговицы были применены следующие настройки: энергия импульса 0,6 мкДж, расстояние между точками – 5,0 мкм, между рядами – 5,0 мкм, растровый паттерн сканирования. Диаметр трансплантата задавали равный 8,0 мм, толщину 130 мкм, время выкраивания трансплантата составляло 20 сек. Аппланацию интерфейса лазера к трансплантату производили с помощью электрического сервопривода операционного стола. ФСЛ «LDV Z8» – это мобильная система швейцарского производства с оригинальным аппланационным интерфейсом, подключенным к основному блоку с помощью гибкого штатива. Это волоконный фемтосекундный лазер с длиной волны 1020-1060 нм. Частота повторения импульсов >5 МГц, мощность < 0,1 мкДж, длительность 200-350 фс, дистанция между импульсами регулируется скоростью движения головки, размер рабочей зоны – 9,5 мм, глубина воздействия 50-900 мкм (шаг 1 мкм). Диаметр импульса 2*2*2 мкм. Лазер использует растровый паттерн сканирования и плоский аппланационный интерфейс. Особенностью работы данного ФСЛ является высокая плотность энергии, лазер создает сфокусированный пучок лазерных импульсов, перекрывающих друг друга, что, по мнению производителя, позволяет получить поверхность среза максимально высокого качества.

    ФСЛ «LDV Z8» имеет алгоритмы: создания роговичного лоскута, проведения послойной и сквозной кератопластик, формирования тоннелей для имплантации роговичных сегментов, выполнения аркуатных насечек, а также пакет для фемто-ассистированной катарактальной хирургии.

    Настройки для формирования горизонтального среза роговицы были следующими: энергия импульса 0,1 мкДж, расстояние между точками – 1,0 мкм, между рядами – 1,0 мкм, растровый паттерн сканирования. Диаметр трансплантата выбирали равный 8,0 мм, толщину 130 мкм, время работы лазера при выкраивании составляло 90 сек. Аппланация интерфейса лазера к трансплантату производится с помощью мануального механического привода при установке глаза в искусственную переднюю камеру глаза (Ziemer, Швейцария). По следующей формуле была рассчитана плотность энергии на мм² поверхности стромы роговицы для использованных при формировании плоскостного разреза настроек.

    Плотность энергии на площадь поверхности плоскостного среза роговицы для ФСЛ «Фемто-Визум» составила 24000 мкДж/мм² или 24 Дж/мм², а для ФСЛ «LDV Z8» – 100000 мкДж/мм² = 100 Дж/мм². Исходя из полученных значений, ФСЛ «Фемто-Визум» можно условно обозначить как лазер с низкой плотностью энергии. В таком случае ФСЛ «LDV Z8» необходимо условно обозначить, как лазер с высокой плотностью энергии. Далее по тексту для идентификации ФСЛ будет применяться упомянутое условное разделение.

    2.1.3 Характеристика эксимерного лазера

    В ходе работы использовали эксимерный лазер Микроскан 500 российского производства, выполненный по металлокерамической технологии (Оптосистемы, РФ). Он имеет частоту импульсов 500 Гц, характеризуется высокой стабильностью средней мощности энергии и большим ресурсом газовой смеси. Лазер снабжен компьютерным управлением, обеспечивающим поддержание требуемого уровня энергии в импульсах генерации, автоматическую замену газовой смеси, проведение необходимых калибровок.

     В эксимерном лазере установки Микроскан 500 используется четырехкомпонентная газовая смесь (Ne, Ar, He, F). Газовая смесь возбуждается сильноточным электрическим разрядом, под воздействием которого происходит образование молекул ArF. Переход в основное состояние сопровождается распадом эксимерных молекул и выделением освободившейся энергии в виде УФ-излучения (с длиной волны 193 нм), которое формируется резонатором в мощный направленный импульсный луч лазера. При работе с эксимерным лазером после определенной наработки количества импульсов необходимо производить замену газовой смеси, т.к. происходит ее деградация в результате реакций химически активного фтора с материалами конструкции лазера. Генерация лазерного излучения запускается через управляющую программу системы. Инициализация лазерных импульсов осуществляется с помощью дистанционной ножной педали.

    После выполнения операционной программы управляющий компьютер автоматически перекрывает излучение лазера. Используя инновационную технологию летающего пятна, Микроскан 500 может формировать поверхность роговицы любой заданной формы. Это позволяет использовать его для широкого диапазона терапевтических и оптико-реконструктивных операций. Лазер дает возможность проведения фото-терапевтических операций в различных режимах: «простая ФТК» и «сложная ФТК» с регулируемой глубиной абляции.

    2.1.4 Технология заготовки трансплантата с помощью механического микрокератома

    Заготовка трансплантата для ЗАПК была проведена в условиях Глазного тканевого банка МНТК «Микрохирургия глаза». Выкраивание было выполнено при помощи микрокератома Moria LSK-One (Франция) и набора сменных головок калибра 130, 200 и 300 мкм.

    Предварительно заготовленный в Глазном банке и хранящийся в растворе для хранения роговицы производства ООО «Научно-экспериментальное производство Микрохирургия глаза» (Россия, ТУ 9393-013-29039336-2007, регистрационное удостоверение № ФСР2010106650) донорский корнеосклеральный диск монтировали в ИПК (Moria, Франция), внутри которой методом ирригации сбалансированного солевого раствора создавали давление 90 мм вод. ст. Согласно данным средних значений толщины лоскутов, формируемых головками величиной 130, 200 и 300, производили последовательные, послойные срезы донорской роговицы с целью достижения минимально возможной величины остаточной стромы, под контролем ОКТ (Optovue, США).

    Как правило, первый срез выполняли головкой 300 мкм. После повторного ОКТ сканирования, в зависимости от толщины остаточной стромы, проводили второй рез головкой 300, 200 или 130 мкм. Роговично-склеральное кольцо, содержащее истонченную до искомой толщины строму и ДМ с эндотелием, помещали во флакон с раствором для хранения роговицы изготовления ООО «Научно-экспериментальное производство Микрохирургия глаза» (Россия, ТУ 9393-013-29039336-2007, регистрационное удостоверение № ФСР2010106650). Трансплантат высекали непосредственно перед пересадкой в условиях операционной вакуумным трепаном диаметра 8 мм (Barron, USA, рис. 5 А, Б, В).

    2.1.5 Стандартная технология заготовки трансплантата с помощью фемтосекундного лазера

    Наиболее распространенный и описанный в литературе метод формирования трансплантата подразумевает применение ФСЛ с высокой плотностью энергии [52]. В качестве донорского материала использовали корнеосклеральный диск диаметром 16 мм, предварительно заготовленный в донорском Глазном банке и содержащийся в растворе для хранения роговицы изготовления ООО «Научно-экспериментальное производство Микрохирургия глаза» (Россия, ТУ 9393-013-29039336-2007, регистрационное удостоверение № ФСР2010106650). Эндотелием вверх его устанавливали на ИПК (Ziemer, Швейцария). Далее при помощи ирригационной системы заполнили ИПК сбалансированным солевым раствором, при этом давление регулировалось высотой поднятия бутылки 30 см от уровня столика для инструментов.

    После нанесения нескольких капель раствора для хранения роговицы изготовления ООО «Научно-экспериментальное производство Микрохирургия глаза» (Россия, ТУ 9393-013-29039336-2007, регистрационное удостоверение № ФСР2010106650), провели установку головки лазера, затем, путем вращения специального кольца, выполнили аппланацию и увеличили ее диаметр – до необходимых 9 мм (рис. 3, 6). Аппланацию лазерного интерфейса выполнили без установки вакуумного кольца.

    Использовали следующие параметры горизонтального реза: глубина – 130 мкм, диаметр – 8 мм, скорость перемещения фокуса по строме – 11 мм/с, мощность – 95%. Настройки для циркулярной диссекции: глубина – 130 мкм, диаметр – 8 мм, скорость реза – 40 мм/с, мощность – 110%. Время фемтодиссекции составило около 60 сек., общее время контакта эндотелия с интерфейсом – порядка 90 сек. Остаточные тканевые мостики разделили тупым шпателем (рис. 7).

    2.1.6 Атомно-силовая микроскопия поверхности роговичного лоскута

    Для исследования использовали поверхность стромального роговичного лоскута, конгруэнтную поверхности трансплантата для ЗПК (рис. 7). Донорский корнеосклеральный диск содержали в растворе для хранения роговицы производства ООО «Научно-экспериментальное производство Микрохирургия глаза» (Россия, ТУ 9393-013-29039336-2007, регистрационное удостоверение № ФСР2010106650). При выкраивании ультратонкого трансплантата для задней послойной кератопластики образцы, содержащие поверхность, конгруэнтную поверхности трансплантата, помещали в 10% формалин. Непосредственно перед исследованием они подвергались лиофильной сушке (Labconco FreeZone, США). Процедуру сублимационной сушки проводили по стандартной методике.

    Полученные обезвоженные образцы исследовали с помощью атомно-силовых микроскопов Certus IV и Certus V (NanoScanTechnologies, Россия) в контактном режиме в воздушной среде. При микроскопии использовали зонды для контактной атомно-силовой микроскопии MSCT-AUNM (Veeco, США) с жесткостью балки 0,01 Н/м и радиусом кривизны зонда 10 нм. Количественный морфометрический анализ провели с использованием штатного программного обеспечения микроскопа.

    Перед расчетом среднеквадратичной шероховатости поверхности, полученные изображения программными средствами распрямили по осям х, y. При этом в случае каждого из образцов проанализировали не менее 5 изображений площадью 400 мкм² (20х20 мкм).

    2.1.7 Оценка потери эндотелиальных клеток в эксперименте

    Донорский корнео-склеральный диск и полученный из него трансплантат содержали и транспортировали в растворе для хранения роговицы производства ООО «Научно-экспериментальное производство Микрохирургия глаза» (Россия, ТУ 9393-013-29039336-2007, регистрационное удостоверение № ФСР2010106650). Выполнили окрашивание эндотелиального слоя образцов флуоресцентными красителями в чашках Петри по следующей методике.

    Для окрашивания живых клеток использовали Calcein Violet 450 AM

    Viability Dye (Thermo Fisher Scientific, 65-0854-39) – мембранно-проницаемый краситель, окрашивающий живые клетки и клетки, находящиеся на ранней стадии апоптоза, агент c максимумом возбуждения 408 нм и максимумом эмиссии – 450 нм (рис. 19А, 20А). При проникновении в клетку внутриклеточные эстеразы расщепляют ацетоксиметильную (АМ) сложноэфирную группу, в результате образуется мембранно-непроницаемый флуоресцентный краситель Calcein Violet. Мертвые клетки с нарушенными клеточными мембранами не удерживают данный краситель.

    Клетки, находящиеся на поздней стадии апоптоза, и мертвые клетки визуализировали с помощью красителя Propidium Iodide (Sigma Aldrich, P4170) – флуоресцентный краситель нуклеиновых кислот с максимумом возбуждения 540 нм и максимумом эмиссии 608 нм. Данный краситель окрашивает ядра погибших клеток (рис. 19Б, 20Б). Целостность мембраны живых и клеток на ранней стадии апоптоза исключает их окрашивание данным маркером.

    Перед окрашиванием исследуемые роговицы промыли в чашке Петри стерильным раствором PBS (Phosphate-Buffered Saline, pH-7.4, Thermo Fisher Scientific, 10010023). Далее ткань перенесли в другую чашку Петри с раствором красителей в PBS: Calcein Violet 450 AM – 10 мкМ и Propidiumiodide – 500 нM, и инкубировали в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре, чтобы предотвратить выцветание флуоресцентных меток. По истечении получаса роговицу промыли чистым раствором PBS и переместили в пластиковую чашку Петри со стеклянным дном (MatTek Corporation) в 1 мл PBS эндотелием вниз, сверху накрыли покровным стеклом. Все описанные процедуры провели в стерильных условиях в ламинарном шкафу.

    Для визуализации окрашивания использовали инвертированный микроскоп Leica DMIL HC (Leica, Германия). Возбуждение флуоресцентных меток происходило при освещении образца ртутной лампой с применением синего и красного фильтров. Возбужденные метки красителя Calcein Violet в сочетании с синим фильтром придали синюю окраску цитоплазме живых клеток и клеток на ранней стадии апоптоза (рис. 1Б, 2Б). Возбужденные метки красителя Propidium Iodide в сочетании с красным фильтром придали красную окраску ядрам мертвых клеток и клеток, находящихся на поздней стадии апоптоза (рис. 16В, 17В). Выполнили по 5 снимков каждой роговицы: центральная зона и четыре квадранта на периферии (сверху от центра, снизу от центра, справа и слева соответственно).

     Подсчет живых и мертвых клеток с полученных изображений провели с применением программы ImageJ. Выполнили подсчет количества живых и мертвых клеток, далее рассчитали процент мертвых клеток от общего их количества. Общее число клеток подсчитали как сумму живых и мертвых, окрашенных в синий и красные цвета, соответственно.