2.1.Первый этап. Выделение клеток ретинального пигментного эпителия донора-трупа для трансплантации

     В данной работе выбор зрелых аллогенных клеток РПЭ человека в качестве источника клеточного материала для трансплантации обусловлен следующими аргументами:

    1. Согласно российскому законодательству, сегодня к трансплантации разрешены только зрелые клетки сетчатки.

    2. В системе МНТК МГ имеется доступ к трупному донорскому материалу.

    3. Не было обнаружено ни клинических, ни экспериментальных сообщений о развитии опухолевых осложнений при трансплантации аллогенного РПЭ в субретинальное пространство.

    В литературе встречается несколько способов выделения РПЭ из трупного донорского глаза. Самым распространенным среди клеточных биологов и офтальмологов-экспериментаторов способом является способ переднего доступа, при котором после удаления роговично-склерального диска наносят круговой разрез по зубчатой линии и удаляют иридохрусталиковую диафрагму вместе с цилиарным и стекловидным телом, после чего иссекают сетчатую оболочку вокруг зрительного нерва. Таким образом, получают «глазную чашу», состоящую из склеральной оболочки, выстланной изнутри ХПК. Далее глазную чашу заполняют ферментативной смесью, инкубируют, после чего забирают клетки РПЭ из чаши в форме суспензии. Данный способ применялся как на заре исследований по трансплантации РПЭ, так, в той или иной модификации, применяется и в настоящее время [1, 87, 53, 178, 216].

    Однако такой способ препарирования глазного яблока обладает недостатком – при таком способе неизбежно повреждение сетчатки и вскрытие витреальной полости. Как результат, получаемая первичная культура клеток с некоторой вероятностью оказывается загрязненной элементами сетчатки (клетками Мюллера) и стекловидного тела (гиалоцитами), активность которых, по мнению ряда авторов, может усугублять процесс эпителиально-мезенхимальной трансформации РПЭ и которые могут являться источником клеточного загрязнения получаемой культуры РПЭ [63].

    На первом этапе сравнивали две методики выделения РПЭ из глаза донора-трупа: известную – с использованием переднего доступа, и разработанную в настоящем исследовании – наружным доступом, которая позволяет выделять клетки РПЭ без повреждения стекловидного тела и сетчатки. Описанный способ препарирования глазного яблока вдохновлен работами Дж. Вёрста по изучению анатомии стекловидного тела при минимальной травматизации последнего [286, 287]. В доступной литературе не обнаружено примеров использования подобных техник для выделения клеток РПЭ для целей культивирования и трансплантации, что, принимая во внимание желательность минимального загрязнения культур РПЭ сторонними клеточными элементами и минимизации эпителиально-мезенхимальной трансформации, определило первую задачу данной работы.

    2.1.1. Характеристика использованного донорского материала

    В качестве первичного источника клеток РПЭ использовали глазные яблоки доноров-трупов (ГЯДТ) без роговично-склеральных дисков, удаленных для целей трансплантации роговицы в Глазном тканевом банке МНТК МГ, г. Москва (заведующий Глазным тканевым банком к.м.н. Тонаева Х.Д.), согласно разрешению на применение медицинской технологии ФС№ 2010/243 от 24 июня 2010 года «Алгоритм заготовки трупных роговиц че ловека для трансплантации». После удаления роговично-склеральных дисков ГЯДТ передавались в ЦФПМБП МНТК МГ (директор Центра д.м.н., профессор Борзенок С.А.).

    Экспериментальные исследования на тканях, выделенных из трупных человеческих глаз, проводились в соответствии с официально принятыми процедурами и специальным разрешением в рамках законодательства РФ. На основании лицензии Федеральной государственной службы по надзору за Здравоохранением № 99-01-005317 от 30.04.2008 и № ФС-99-01-008251 от 18.02.2013 Глазной тканевой банк МНТК МГ получает трупные человеческие глаза из танатологических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента Здравоохранения города Москвы. Лицензия позволяет использовать ткани, выделенные из трупных человеческих глаз для целей трансплантации и научных исследований.

    В связи с установленным режимом работы в Глазном тканевом банке и Лаборатории клеточных технологий ЦФПМБП МНТК МГ, к ГЯДТ предъявляли требования инфекционной безопасности [3]. ГЯДТ поступали в Глазной тканевой банк МНТК МГ из танатологических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы, согласно действующему договору. Перед выкраиванием роговично-лимбальных дисков проводилась серологическая диагностика доноров-трупов на инфицированность вирусами ВИЧ I/II, гепатитов В и С, сифилиса, как наиболее опасных возбудителей заболеваний, представляющих потенциальную угрозу для персонала. Клинико-лабораторная диагностика указанных инфекций проводилась в микробиологической лаборатории МНТК МГ по образцам крови, поставляемым вместе с тканями ГЯДТ.

    Оригинальная методика выделения РПЭ (опыт)

    Для выделения РПЭ в опытной группе было использовано 11 глазных яблок от 11 доноров, разделенных на две группы по показателям адреналиновой пробы С.А. Борзенка – Проба А (6 глаз) и Проба В (5 глаз). В таб. 2 представлены основные характеристики донорских глаз, использованных в опытной группе первого эксперимента.

    Известная методика выделения РПЭ (контроль)

    В контрольной группе было использовано 11 парных глаз от тех же 11 доноров, что и в опытной группе.

    В таб. 3. представлены основные характеристики донорского материала, использованного в контрольной группе на первом этапе.

    О принципах отбора ГЯДТ для первичного выделения клеток РПЭ см. в разделе 3.1.1.

    2.1.2. Выделение ретинального пигментного эпителия

    Оригинальная методика выделения РПЭ (опытная группа) Описание оригинальной методики выделения клеток РПЭ изложено в разделе 3.1.2.

    Образец полученной суспензии клеток РПЭ объемом 100 мкл переносили в чашку Петри (35 мм) и исследовали с помощью инвертированного микроскопа – качественно оценивали степень чистоты суспензии, наличие в ней фрагментов сетчатки, волокнистых элементов, сравнивали с группой контроля (см. раздел 3.1.3).

    Иридохрусталиковая диафрагма, цилиарное и стекловидное тела и нейральная часть сетчатой оболочки отделялись от ХПК единым комплексом.

    Макроскопически давали визуальную качественную оценку состоянию иридо-цилио-хрусталиково-витреоретинального комплекса – оценивали целостность нейральной сетчатки и степень выхода стекловидного тела за пределы стекловидной полости (см. раздел 3.1.3).

    Известная методика выделения РПЭ (контроль)

    Контрольную группу формировали из парных глаз, тех, что были использованы в опытной группе.

    Согласно Александровой М.А. с соавт. [1] удаляли по зубчатой линии передний сегмент глазного яблока, отделяли стекловидное тело и нейральную сетчатку от пигментного эпителия, наполняли глазную чашу раствором Хенкса без ионов Са²⁺ , Mg²⁺ с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и инкубировали клетки ретинального пигментного эпителия в течение 15-30 мин, полученные клетки собирали пипеткой и переносили в стерильную среду для выделения, пипетировали, центрифугировали, выделенные клетки ресуспендировали в ростовой среде с высоким содержанием сыворотки [1].

    Пробу суспензии РПЭ объемом 100 мкл переносили в чашку Петри (35 мм) и исследовали с помощью инвертированного микроскопа, оценивая степень чистоты культуры по бальным показателям, изложенным в разделе "Результаты экспериментальных исследований". Оценку жизнеспособности выделенного клеточного материала проводили по методике, описанной в разделе 2.6.3.