2.2. Децеллюляризация лентикулярного материала

     Заготовка и перенос нативного лентикулярного материала из операционного блока до лаборатории глазного тканевого банка

    Перед началом исследования у всех пациентов было получено добровольное информированное согласие в соответствии с положениями Хельсинкской декларации. ЛМ получали у пациентов после проведения рефракционной операции СМАЙЛ по поводу миопии и сложного миопического астигматизма. Возраст пациентов в среднем составлял 27,3±5,4 лет. Значения сферического эквивалента до операции СМАЙЛ варьировали в пределах -4,72±0,86 дптр. Параметры ЛМ были следующими: толщина 77 – 148 мкм, диаметр 6,5 мм. Забор ЛМ проходил в операционном блоке на базе головной организации ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Сама операция СМАЙЛ проходила под местной капельной анестезией с помощью фемтосекундного лазера VisuMax (частота следования импульсов 500 кГц, энергия в импульсе 160 нДж) сначала формировалось дно ЛМ (диаметр 6,5 мм), а затем ее «крышка» (диаметр 7,5 мм либо 7,6 мм). Сразу после извлечения, под контролем операционного микроскопа накладывался шовный материал 10-0 (Mani, Япония) на край ЛМ, при этом узел шва подтягивался в сторону передней поверхности ткани (Рисунок 1). Далее ЛМ переносили в стерильную пробирку типа Эппендорф (GenFollower, Китай), содержащей 1 мл среды для переноса образцов. Пробирка типа Эппендорф со средой была заранее подготовлена в лаборатории глазного тканевого банка (ГТБ). Затем контейнер с образцами транспортировался в лабораторию ГТБ, располагающейся на базе Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (ЦФПМБП) головной организации ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Дальнейшие исследования в лаборатории проводились в стерильных условиях in vitro.

    Для переноса ЛМ из операционной до лаборатории ГТБ использовались разные среды. Для выбора лучшей среды для транспортировки ЛМ были сформированы 4 группы (Таблица 2):

    1. «Раствор для хранения роговицы» (среда Борзенка-Мороз) (ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) [19]

     2. «Средство для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы» которая, в сущности, является дополненным и модифицированным производным р«аствора для хранения роговицы» [20]

    3. Когезивный вискоэластик (КВ), массой 2.500.000 Дальтон, содержащий 1,0% гиалуроната натрия (ALCON Laboratories Inc, США)

    4. Дисперсный вискоэластик (ДВ), массой 600.000 Дальтон, содержащий 4,0% хондроитин сульфат и 3,0% гиалуронат натрия (ALCON Laboratories Inc, США)

    Метод спектрофотометрии

     Для оценки прозрачности ЛМ в разных средах для транспортировки использовали спектрофотометр Multiskan GO (Thermo Scientific, США). Светопропускные свойства нативного ЛМ измеряли в диапазоне длины волны 380–780 нм. Данные собирались с шагом 10 нм (Рисунок 2). Образцы помещали в 96-луночный планшет, начиная со второй лунки. Среду для транспортировки равномерно добавляли в каждую лунку планшета, начиная с первой в объеме 250 мкл. Далее для измерения коэффициента пропускания Kп (%) 96-луночный планшет с образцами вставляли в камеру спектрофотометра. Для статистического анализа данных в качестве расчетного значения было использовано среднее значение для всей группы по 41 точке прозрачности полученного волнового спектра.

    Для этого, сначала был рассчитан Кo, следующим образом: где Кo– коэффициент пропускания в пределах одного образца для каждой из 41 точек спектра K1 – коэффициент пропускания лунки с образцом K2– коэффициент пропускания лунки без образца

    Далее был рассчитан Kc следующим образом: где Kc– средний коэффициент пропускания всех образцов в группе, Ko– сумма всех измерений каждого образца в группе для 41 точки спектра, N – общее количество образцов в пределах группы

     В конце рассчитывали Kп следующим образом: где Kп– средний коэффициент пропускания для всех точек спектра целой группы, ΣKс– суммарное значение среднего коэффициента пропускания, 41 – количество точек спектра, которые получили при анализе длины волны от 380– 780 нм, выполненных с шагом 10 нм.

    Описание протоколов децеллюляризации лентикулярного материала

    Все манипуляции с ЛМ проводили в стерильных условиях ламинарного бокса II класса безопасности MSC-Advantage (Thermo Fisher Scientific, Германия). Децеллюляризация ЛМ, направленная на снижение антигенных свойств и разрушение клеток в ЛМ, проводилась с использованием термошейкера TS-100 (Biosan, Латвия) (Рисунок 3).

    Для оптимизации протоколов децеллюляризации ЛМ была изучена эффективность различных концентраций детергентных растворов (SDS, гипертонического раствора натрия хлорида с нуклеазами и раствора Трипсин-ЭДТА с нуклеазами и двойным отмыванием в гипотрис-буфере), ранее описанных в доступной литературе [195, 196, 163, 89].

     Перед началом децеллюляризации ЛМ отмывали от среды для транспортировки трехкратно по 5 минут в PBS с уровнем pH 7,4. В данном исследовании использовались 3 протокола децеллюляризации, которые различались между собой по времени экспозиции, концентрации веществ и действующим компонентам (Рисунок 4).

    Было сформировано четыре группы, где три группы были опытные (протоколы децеллюляризации), а одна являлась контрольной (нативные образцы) (Таблица 3).

    Для оценки результатов протоколов децеллюляризации, а также для качественного анализа структуры ЛМ до и после обработки образцы исследовали с помощью различных методов (Таблица 4).

    Спектрофотометрия для децеллюляризированного и нативного лентикулярного материала

     Сбор и анализ данных спектрофотометра проводился тем же методом, которым оценивали светопропускаемость образцов, где выбирали среду для их транспортировки. С целью устранения неспецифического отека ЛМ, возникающего после децеллюляризации обычно используют глицерин. В данной работе для решения данной проблемы применялся, разрешенный к клиническому использованию в офтальмохирургии дисперсный вискоэластик (ДВ). Для спектрофотометрического анализа ЛМ предварительно дегидратировали в ДВ от 30 минут до 1 часа.

    Гистологический анализ

    ЛМ сначала фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина, далее отмывали под проточной водой, проводили обезвоживание в спиртах восходящей концентрации с последующим заливанием в парафин. Затем выполняли серии гистологических срезов толщиной 2-3 мкм с использованием окрасок гематоксилином-эозином для оценки наличия либо отсутствия клеточного материала, по методу Ван-Гизон определяли общую структуру коллагена, а также альциановым синим для оценки состояния гликозаминогликанов в тканях. Изучали препараты на инвертированном микроскопе ix81 (Olympus, Япония) при 40-кратном увеличении с последующим их фотографированием.

    Иммуногистохимический анализ

     Данным методом оценивали экспрессию коллагена I, III, V и VI типов, которые являются характерными для стромы роговицы, а также входят в основной состав ВКМ. Для этого нативные и децеллюляризированные образцы помещали в реактив Shandon Cryomatrix (Thermo scientifiс, Великобритания) и замораживали в криостате HM525 NX (Thermo scientifiс, Великобритания) при температуре – 30°С. Далее проводили криостатные срезы образцов (толщина среза 10 мкм). Потом образцы переносили на слайды Polysine (Thermo scientifiс, Великобритания) из расчета четыре среза на один слайд (Рисунок 5).

    В данном исследовании применяли следующие первичные антитела: коллаген I типа (Rabbit 1:200, ab34710, Abcam, Великобритания), коллаген III типа (Mouse 1:100, ab6310, Abcam, Великобритания); коллаген V типа (Rabbit 1:100, ab114072, Abcam, Великобритания); коллаген VI типа (Rabbit 1:200, ab6588, Abcam, Великобритания). С целью идентификации вышеперечисленных маркеров применяли вторичные антитела Alexa Fluor 488 (1:250, ab150077, Goat Anti-Rabbit IgG, Abcam, Великобритания) и Alexa Fluor 594 (1:250, ab150116, Goat Anti-Mouse IgG, Abcam, Великобритания) с последующим их отмыванием. Помимо этого, для оценки окрашивания ядер применяли краситель Hoechst (О150, ПанЭко, Россия) (Таблица 5). Результаты оценивали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа «Fluo View FV10i» (Olympus,Япония) х 100.

    Метод сканирующей электронной микроскопии

    Образцы сначала обезвоживали в растворе ацетона по восходящей концентрации 10%; 30%; 50%; 70%; 90%; 100%, трехкратно по 10 минут в каждом. Затем образцы подвергались критической сушке с применением осушителя (Critical Point Dryer Qurum k850, Quorum Technologies, Великобритания). Далее образцы напыляли золотом (толщина слоя 5нм, проба 999) с помощью специальной напылительной установки (Smart Coater SPI, SPI Supplies, США). Данные анализировали с помощью сканирующего электронного микроскопа – 6000plus (Jeol, Япония) (Рисунок 6). Анализ образцов проводился в десяти случайно выбранных точках центральной 3 мм зоны и осуществлялся в режиме высокого вакуума х1000 (мощность 10kV).

    ДНК-анализ

    Содержание ДНК в ткани является одним из достоверных способов оценки эффективности протоколов децеллюляризации тканей [54]. ДНК выделяли из образцов с помощью набора DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя (Рисунок 7). Подсчет содержания ДНК в полученных растворах осуществлялся с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Invitrogen, США) и набора для анализа Qubit dsDNAHS High-Sensitivity Assay Kit (Invitrogen, США). Процедура измерения проводилась согласно инструкции компании-производителя.