2.2. Экспериментальное изучение процессов миграции эндотелиальных клеток роговицы

    Исследование проводили на 10 кроликах-самках (10 глаз) породы шиншилла, которым проводилась модифицированная трансплантация полукруглого фрагмента (1/2) Десцеметовой мембраны и эндотелия. Донорские трансплантаты Десцеметовой мембраны с эндотелием выкраивали из корнеосклеральных дисков кроликов-самцов той же породы. Для определения вектора миграции использовали гистологические, цитологические (окраска азур-эозином и раствором акрихина) и молекулярно-генетические (полимеразная цепная реакция) методы исследования.

    Для проведения гистологического исследования фрагменты корнеосклеральных дисков промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин, выполняли серии гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Препараты изучали под микроскопом Leica DM LВ2 (Швейцария) при х50, х100, х200, х400, х630 кратных увеличениях с последующим фотографированием.

    Для цитологического анализа использовали изолированные эндотелиальные клетки глаза кролика-реципиента из двух зон заднего слоя роговицы: первая – центральная область трансплантата диаметром 3 мм, вторая – периферическая зона на расстоянии 6-8 мм от центра. Суспензия эндотелиальных клеток была зафиксирована на предметном стекле, после чего было проведено окрашивание азур-эозином с последующей световой микроскопией, а также раствором акрихина и дальнейшей визуализацией методом люминесцентной микроскопии (n=2).

    Для молекулярно-генетического исследования энуклеированные глаза кролика помещали в 10% р-р формалина. Для этого глаза были промыты дистиллированной водой и расположены в специальном держателе. Фрагменты роговицы с ДМ и монослоем эндотелиальных клеток вырезаны из вновь образованной послеоперационной области. Материал инкубировали при +8оС в течение 72 часов в Tris-глициновом буфере со сменой буфера два раза в сутки. Выделение ДНК из фрагмента ткани проводили по стандартной методике: обработка в течение 16 часов при 56°C протеиназой К в присутствии дитиотреитола, фенол-хлороформная экстракция, концентрирование переосаждением этиловым спиртом. Полученную ДНК использовали в полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации sex-determining региона Y-хромосомы (gSRY) у кролика с использованием праймеров SRYfor: CAGGAACGGGTCAAGCGAC и SRYrev: AGATCAGTACGCCTTCTTG. Результаты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Учет результатов проводили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Размеры молекул анализируемых образцов ДНК определяли путем сопоставления их электрофоретической подвижности в геле с подвижностью маркеров – фрагментов ДНК известной молекулярной массы (100+ bp DNA Ladder, Евроген) (n=8).