Экспериментальные исследования проводили на 50-ти кадаверных глазах человека (от 28-ми доноров-трупов) без признаков патологии роговицы, не соответствующих критериям отбора для кератопластики, предоставленных Глазным тканевым банком ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, имеющим лицензию на осуществление медицинской деятельности по изъятию и хранению органов и (или) тканей человека для трансплантации; транспортировку органов и (или) тканей человека для трансплантации. Возраст доноров варьировал от 30-ти до 38-ми лет. От момента смерти до энуклеации проходило не более 10-ти часов, от момента смерти до выполнения эксперимента – не более 12-ти часов.
Рисунок 5 – Кадаверный глаз в «зажиме-лепестке»
Рисунок 6 – Оптический 3D-цифровой микроскоп Hirox KH-8700 (Япония)
• Основная группа – 22 кадаверных глаза человека (от 22-х доноров-трупов), на которых роговичный клапан формировали с использованием отечественной фемтолазерной установки мегагерцового диапазона Фемто Визум (ООО «Оптосистемы», Россия).
• Контрольная группа – 22 кадаверных глаза человека (от 22-х доноров-трупов), на которых роговичный клапан формировали с использованием зарубежной фемтолазерной установки мегагерцового диапазона Femto LDV Z6 («Ziemer Ophthalmic Systems AG», Швейцария).
Один кадаверный глаз от одного донора-трупа включали в основную группу, парный глаз – в контрольную группу.
Экспериментальный этап исследования был разделен на 3 части:
1. Сравнительная оценка морфологии роговицы:
• Основная группа – 12 глаз, из них: сразу после формирования роговичного клапана – 6 глаз, через 24 часа культивирования после формирования роговичного клапана – 6 глаз.
• Контрольная группа – 12 глаз, из них: сразу после формирования роговичного клапана – 6 глаз, через 24 часа культивирования после формирования роговичного клапана – 6 глаз.
• Группа отрицательного контроля – 6 кадаверных глаз человека (от 6-ти доноров-трупов), которые подвергали только культивированию в течение 24 часов, без фемтолазерного воздействия.
2. Сравнительная оценка морфометрических параметров роговичного клапана:
• Основная группа – 10 глаз.
• Контрольная группа – 10 глаз.
3. Сравнительная оценка качества поверхности стромального ложа роговицы, после формирования роговичного клапана:
А. Количественная оценка – те же 20 глаз, на которых исследовали морфометрические параметры роговичного клапана, из них:
• Основная группа – 10 глаз.
• Контрольная группа – 10 глаз.
Б. Качественная оценка – из тех же 20-ти глаз, на которых исследовали морфометрические параметры роговичного клапана, были отобраны 8 глаз от 4-х доноров-трупов со схожими значениями измеренной толщины роговичного клапана (поскольку качество поверхности стромального ложа роговицы на разной глубине разное (чем глубже, тем более шероховатая поверхность [78])), из них:
• Основная группа – 4 кадаверных глаза.
• Контрольная группа – 4 кадаверных глаза.
2.2.2. Технология экспериментальной хирургии
Рисунок 7 – Край стромального ложа роговицы, после формирования клапана фемтосекундным лазером. Роговичный клапан удален. Изображение получено с видеокамеры 3D-цифрового микроскопа Hirox KH-8700 (Япония)
Рисунок 8 – Схема измерения угла вреза роговичного клапана
Затем скарифицировали эпителий роговицы. После этого формировали роговичный клапан с использованием отечественной или зарубежной фемтосекундных лазерных установок. Технические параметры фемтолазерных установок, используемых в настоящей работе, представлены в таблице 9.
Во всех случаях формировали роговичный клапан по заданным параметрам: толщина – 100 мкм, диаметр – 9,0 мм, угол вреза края клапана – 70°.
На образцах для исследования морфологии роговицы клапан не поднимали. На образцах для исследования морфометрических параметров роговичного клапана и качества поверхности стромального ложа роговицы с помощью пинцета фиксировали край роговичного клапана и выполняли его подъем. Таким образом, отсутствовало механическое воздействие шпателя или других металлических инструментов по обе стороны от фемтодиссекционного разреза. Затем с помощью трепана выполняли выкраивание корнеосклеральных дисков.
2.2.3. Исследование морфологии роговицы после формирования роговичного клапана
Пробоподготовка корнеосклеральных дисков групп исследования сразу после формирования роговичного клапана. Полученные корнеосклеральные диски промывали в фосфатном буферном растворе в течение 10 минут 3 раза.
Далее образцы помещали в жидкий азот на 1 минуту, после чего в среду O.C.T. (Tissue-Tek, Sakura Finetek, США) и с помощью криостата нарезали поперечные срезы толщиной 5 мкм. Затем полученные срезы окрашивали гематоксилин -эозином по стандартной методике и изучали с помощью инвертного микроскопа IX 81 (Olympus, Япония) на увеличениях х40 и х100.
Пробоподготовка корнеосклеральных дисков групп исследования подверженных культивированию после формирования роговичного клапана и группы отрицательного контроля (без фемтолазерного воздействия). Для культивирования полученные корнеосклеральные диски помещали на 24 часа в среду Игла в модификации Дульбекко со средой Хема F12 1:1 (DMEM F12) (ПанЭко, Россия) с добавлением антибиотиков (амфотерицин 25 мкг/мл, пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл), 10% фетальной бычьей сыворотки, L-глютамина 2 ммоль/л при температуре +37° С, влажности 100% и содержании СО 2 5%. После культивирования образцы подготавливали к исследованию по вышеописанной методике.
2.2.4. Исследование морфометрических параметров роговичного клапана
Полученные образцы корнеосклеральных дисков со сформированным роговичным клапаном фиксировали в 4,0% формальдегиде в течение 12-ти часов при температуре +4°С.
В экспериментальном исследовании изучение морфометрических параметров роговичного клапана проводили с помощью измерительного оптического 3D-цифрового микроскопа Hirox KH-8700 (Япония) (Рисунок 6).
Построение математической 3D-модели объекта в данном микроскопе основано на серии захваченных плоских изображений на разном уровне фокусировки. Полученную модель можно поворачивать в пространстве, изменять масштаб, выполнять 2D- и 3D-измерения: длины линии, величины угла, диаметра, периметра, площади, уровня высот и др. Контрольные точки измерения можно наносить как на самой 3D-модели, так и на сформированном графике, после нанесения профильной линии измерения на 3D-модели [24]. Так же 3D-цифровой микроскоп позволяет выполнять видеосъемку объектов с использованием поворотной камеры (Рисунок 7).
Рисунок 9 – Схема измерения толщины клапана Примечание: А, В – острые углы прямоугольного треугольника; С – прямой угол; а, b – катеты прямоугольного треугольника; c – гипотенуза прямоугольного треугольника
Таблица 9 – Технические параметры фемтосекундных лазерных установок, используемых в настоящем исследовании
При оценке толщины роговичного клапана выполняли измерение высоты сформированного интерфейса по диаметру стромального ложа роговицы (измеренная толщина) (Рисунок 9). Принимая во внимание, что измеренная толщина (Рисунок 9, с) находится не под прямым углом к поверхности стромального ложа, было решено выполнить математическое вычисление высоты сформированного интерфейса (полученная толщина) путем построения прямоугольного треугольника, гипотенузой которого является измеренная толщина (Рисунок 9, с). Далее определяли длину катета (Рисунок 9, а), который образует высоту сформированного интерфейса (полученная толщина) – это наименьшее расстояние между передней и задней поверхностями клапана, соответствующее фактической толщине клапана. При расчетах использовали значения измеренного и полученного (Рисунок 9, А) углов.
Для общего решения прямоугольного треугольника использовали теорему Пифагора: c²=a²+b², где a, b – катеты, c – гипотенуза.
Измерение угла вреза и высоты сформированного интерфейса (измеренные угол и толщина) с помощью 3D-цифрового микроскопа Hirox KH-8700 (Япония) выполняли на трех профильных линиях в каждом квадранте сформированного стромального ложа. Таким образом, с каждого подготовленного роговично-склерального диска со сформированным роговичным клапаном получали по 12 значений измеренного угла и измеренной толщины. Также выполняли измерение диаметра стромального ложа роговицы путем нанесения измерительных точек на полученных снимках с помощью программного обеспечения 3D-цифрового микроскопа. Этот диаметр является задаваемой величиной в настройках фемто-установки - внутренним (задним) значением диаметра клапана, и именно этот параметр имеют в виду в повседневной практике офтальмологи, когда вводят значение диаметра клапана в программное обеспечение фемтолазерной установки.
2.2.5. Количественная оценка поверхности стромального ложа роговицы
Количественную оценку поверхности стромального ложа роговицы проводили с помощью измерительного оптического 3D-цифрового микроскопа Hirox KH-8700 (Япония) (Рисунок 6) одновременно с исследованием морфометрических параметров роговичного клапана (на тех же глазах). Измеряли параметры шероховатости: «среднеарифметическое отклонение профиля (Ra) – среднее арифметическое из абсолютных значений отклонений профиля в пределах базовой длины, высота неровностей профиля по 10-ти точкам (Rz) – сумма средних абсолютных значений высот пяти наибольших выступов профиля и глубин пяти наибольших впадин профиля в пределах базовой длины» [3]. Чем меньше полученные значения параметров шероховатости, тем более гладкая поверхность.
2.2.6. Качественная оценка поверхности стромального ложа роговицы
Все полученные образцы стромального ложа роговицы монтировали на алюминиевые столики, таким образом, чтобы поверхность стромы роговицы была обращена вверх, и на установке SPI-MODULE Sputter Coater (SPI, США) проводили напыление золотом (проба 999, толщина слоя 5 нм) для обеспечения электронно-проводящего слоя на поверхности образцов. Затем материал для исследования помещали в камеру двулучевого сканирующего электронного микроскопа Quanta 200 3D (FEI Company, США), анализировали в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 5 кВ и выполняли фотофиксацию образцов на увеличениях х200 и х400.
Качественную оценку поверхности стромального ложа роговицы проводили субъективным методом тремя группами независимых исследователей в соответствии с предложенным Sarayba M. A. et al. (2007) методом [106].
Подготовлено по 2-е электроннограммы основной и контрольной групп на увеличениях х200, а также х400, всего 8 снимков. Электроннограммы были зашифрованы и представлены каждому исследователю в случайном порядке. Все электроннограммы оценивали по 5-бальной шкале Sarayba M.A. et al. (2007) [106]: «1» балл - самые гладкие образцы среди всех; «2» – менее гладкие образцы, чем «1»; «3» – средняя группа; «4» – шероховатые образцы, но не худшие; «5» - самые шероховатые среди всех образцов.
