2.2. II этап - Испытание возможностей имплантата из коллагена в качестве носителя для rhBMP-2

    Изготовление коллагенового имплантата

     Коллоидный раствор крысиного коллагена («ИМТЭК»), титруя при постоянном перемешивании, доводили раствором 1 M NaOH (РЕАХИМ, Россия) до нейтральных значений pH. Инкубировали смесь при + 4°C в течение 2 часов, затем разливали по 1,0 мл в лунки 24-луночного планшета (Techno Plastic Products AG, Швейцария). Для формирования геля полученную смесь инкубировали при +37°C в течение 30 минут. Образованные коллагеновые гидрогели, извлеченные из планшета, отмывали в 500 мл фосфатного буферного раствора Рингера-Кребса (SigmaAldrich, США) при комнатной температуре в течение 24 часов с заменой раствора каждые 8 часов. Далее гели выкладывали на поверхность и сушили их до полного высыхания потоком воздуха при +37°C. Полученные пленки регидратировали в 20 мл фосфатного раствора Рингера-Кребса при +37°C в течение 2 часов. В результате чего получали коллагеновую мембрану диаметром 12-15 мм сферической формы и толщиной 0,1 мм (Рисунок 1). Все манипуляции были проведены в асептических условиях.

    Изготовление коллагенового имплантата с rhBMP-2

    Все процедуры выполняли аналогично вышеприведенной методике приготовления коллагенового имплантата, за исключением того, что коллоидный раствор крысиного коллагена смешивали с раствором rhBMP-2 таким образом, чтобы в конечной смеси концентрация rhBMP-2 была 30 мкг/мл.

    Модифицированный с целью повышения растворимости и содержания активной димерной формы белка rhBMP-2 получали микробиологическим синтезом в клетках Esсherichia coli в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Гамалеи (Москва), биологическая активность фактора, протестированная in vitro и in vivo, полностью соответствует активности фирменного препарата rhBMP-2 (R@D Systems, Канада), полученного в клетках эукариот.

    Техника подкожного введения коллагеновго имплантата крысам

    В качестве наркоза при проведении операции использовали препарат «Золетил 100, Франция» в дозировке 25 мг/кг веса. Крыс фиксировали в лежачем положении на спине. Хирургическое поле в паховой области освобождали от шерсти, обрабатывали однопроцентным спиртовым раствором йода. В асептических условиях скальпелем делали линейный кожный разрез длиной 1,5 см. В полученные «карманы» каждой крысе вводили по одному коллагеновому имплантату с rh-BMP2. Рану послойно ушивали атравматической нитью и обрабатывали препаратом «Террамицин, Германия» для предупреждения развития бактериальной инфекции.

    Метод экстракции оставшегося rhBMP­2 из коллагенового имплантата

    Продолжительность эксперимента составила 42 дня, животных выводили из эксперимента на 3-, 7-, 14-, 28- и 42-е сутки по 2 особи. Всего использовано 10 крыс. После выведения животных из эксперимента, для полной экстракции оставшегося rhBMP­2 коллагеновые имплантаты извлекали и помещали в 0,5 мл водного раствора 6 М мочевины (РЕАХИМ, Россия), 10 мМ ЭДТА (Kaiyue Chemicals, Россия), pH 6,5; при комнатной температуре (25°C) и постоянном перемешивании выдерживали до полного растворения матрикса. Затем при помощи метода иммуноферментного анализа «сендвич-типа» с использованием тест-системы «BMP2» производства «ИМТЭК» определяли концентрацию фактора роста.